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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo ottimizzato per isolare, coltivare, tradurre e differenziare i monociti primari umani da individui infettati dall'HIV e dai controlli sani.

Abstract

Il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) rimane una delle principali preoccupazioni per la salute, nonostante l'introduzione della terapia antiretrovirale combinata (cART) a metà degli anni '90. Mentre la terapia antiretrovirale abbassa in modo efficiente il carico virale sistemico e ripristina il normale CD4- conteggi di cellule T, non ricostituisce un sistema immunitario completamente funzionale. Un sistema immunitario disfunzionale in individui infettati da HIV sottoposti a cART può essere caratterizzato da attivazione immunitaria, invecchiamento precoce delle cellule immunitarie o infiammazione persistente. Queste condizioni, insieme ai fattori comorbidi associati all'infezione da HIV, aggiungono complessità alla malattia, che non può essere facilmente riprodotta nei modelli cellulari e animali. Per studiare gli eventi molecolari alla base della disfunzione immunitaria in questi pazienti, viene presentato un sistema per la coltura e la manipolazione dei monociti primari umani in vitro. In particolare, il protocollo consente la coltura e la trasfezione del CD14 primario- monociti ottenuti da individui affetti da HIV sottoposti a cART e da controlli HIV-negativi. Il metodo prevede l'isolamento, la cultura e la trasfezione di monociti e macrofagi derivati da monociti. Mentre sono impiegati kit e reagenti disponibili in commercio, il protocollo fornisce importanti suggerimenti e condizioni ottimizzate per il successo dell'aderenza e della trasfezione dei monociti con mimimi e inibitori di miRNA, nonché con i siRNA.

Introduzione

L'infezione da virus immunodeficienza umana-1 (HIV-1) causa una grave disfunzione immunitaria, che può portare a infezioni opportunistiche e sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS). Anche se i pazienti affetti da HIV sottoposti a cART sono caratterizzati da bassi carichi virali e normali conteggi di cellule CD4- T, il funzionamento del sistema immunitario può essere compromesso in questi individui, portando ad una risposta immunitaria disfunzionale che è stata collegata ad un aumento del rischio di sviluppare il cancro1. I meccanismi della disfunzione immunitaria nei pazienti affetti da HIV su cART rimangono in gran parte sconosciuti. Pertanto, caratterizzare le cellule immunitarie derivate dal paziente e studiare la loro biologia e funzione è una componente fondamentale dell'attuale ricerca sull'HIV.

Monociti e macrofagi sono regolatori chiave delle risposte immunitarie e svolgono un ruolo fondamentale nell'infezione da HIV2,3,4,5. Eterogenei e di natura plastica, i macrofagi possono essere ampiamente classificati in attivazione classica (M1) o in alternativa attivati (M2). Mentre questa classificazione generale è necessaria quando si impostano condizioni sperimentali, lo stato di polarizzazione dei macrofagi può essere invertito da una varietà di citochine6,7,8,9. Anche se diversi studi hanno studiato gli effetti dell'infezione da HIV su monociti e cellule dendritiche, i dettagli molecolari delle risposte mediate da monociti sono in gran parte sconosciuti6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Tra i fattori coinvolti nella regolazione e nella funzione delle cellule immunitarie, i microRNA (miRNA), i brevi RNA non codificanti che regolano post-trascrizione l'espressione genica, hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nel contesto delle principali vie cellulari (cioè, crescita, differenziazione, sviluppo e apoptosi)20. Queste molecole sono state descritte come importanti regolatori di fattori di trascrizione essenziali per dettare la polarizzazione funzionale dei macrofagi21. È stato studiato il ruolo potenziale dei miRNA nei monociti di individui affetti da HIV sottoposti a cART, ma i progressi nel campo richiedono molto più lavoro22,23,24,25,26. Questo documento illustra un metodo ottimizzato per trasfect miRNA e siRNA in monociti umani primari da pazienti e controlli infettati da HIV.

Questo protocollo si basa su reagenti e kit disponibili in commercio, poiché la continuità nella procedura tecnica consente di eliminare le variabili sperimentali non necessarie quando si lavora con campioni clinici. Ciò nonostante, il metodo fornisce suggerimenti importanti (cioè il numero di cellule placcate o una breve incubazione con supporti senza siero per promuovere l'aderenza delle cellule alla piastra). Inoltre, le condizioni di polarizzazione utilizzate in questo protocollo derivano dal lavoro pubblicato27,28,29.

Protocollo

Tutti i metodi descritti di seguito sono stati approvati dal Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board. Tutto il sangue è stato raccolto dopo aver ottenuto il consenso informato.

NOTA: L'intera procedura viene eseguita in condizioni sterili in un impianto di biosicurezza di livello 2 (BSL2) in modo che venga utilizzata cautela per la gestione di materiali biologici. In particolare, ogni passo viene eseguita utilizzando tecniche sterili sotto un armadietto di biosicurezza. Dopo ogni fase che coinvolge sangue, prodotti sanguigni, cellule o pipettaggio di prodotti cellulari, è importante sciacquare tutto il materiale plastico (ad esempio, pipette sierologiche, punte pipette e tubi) con 10% di candeggina da un contenitore di rifiuti all'interno del cofano prima di un corretto smaltimento.

1. Isolamento dei monociti umani primari mediante selezione negativa immunomagnetica

  1. Raccogli 40 mL di sangue intero fresco e umano (da unpaziente o da un controllo sano) da 10 mL in tubi a vuoto da 10 mL di acido etilenediaminetracetraacetica (EDTA) (10 mL di sangue per tubo). Utilizzando tecniche sterili sotto un armadietto di biosicurezza, trasferire tutti i 40 mL di sangue in un tubo di propilene conico da 50 mL.
  2. Seguendo il protocollo del produttore per il kit di isolamento monocite umano selezionato (Tabella dei materiali), aggiungere 2 mL di cocktail di isolamento monocito, fornito nel kit, al tubo di sangue. Perline magnetiche vortice, fornite anche nel kit, per 30 s, e aggiungere 2 mL al tubo di sangue.
    1. Se sono disponibili meno di 40 mL di sangue, ridurre i reagenti aggiunti. Per mescolare la soluzione, pipetta su e giù con una pipetta sierologica da 25 mL di plastica e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
  3. Separare equamente la miscela di sangue in quattro tubi da 50 mL e aggiungere 30 mL di salina sterile con buffer di fosfato (PBS) contenente 1 mM EDTA per ciascun tubo. Mescolare pipettando su e giù con una pipetta sierologica da 25 mL di plastica.
  4. Mettere i tubi in supporti magneti per 10 min per rimuovere le perline magnetiche coniugate anticorpo. Utilizzare quattro supporti magneti contemporaneamente, uno per ogni tubo, per consentire tempi di incubazione e isolamento costanti per ogni campione di sangue.
  5. Disegnare il contenuto dal centro di ogni tubo, utilizzando una pipetta, mentre sono ancora nei supporti magnete. Fare attenzione a non redigere i globuli rossi (non più del 10% del volume iniziale 10 mL) e posizionare il contenuto in uno dei quattro nuovi tubi da 50 mL.
  6. Aggiungete 500 l di perline magnetiche vortiche ad ogni tubo da 50 mL. Pipetta su e giù con una pipetta da 25 mL e incubare a RT per 5 min. Quindi, posizionare i tubi in supporti magnete per 5 min.
  7. Trasferire con attenzione il contenuto dal centro di ogni tubo mentre è ancora in supporti magnete in uno dei quattro nuovi tubi da 50 mL. Posizionare direttamente ogni nuovo tubo da 50 mL nei supporti del magnete per 5 min.
  8. Trasferire con attenzione il contenuto dal centro di ogni tubo in uno dei quattro nuovi tubi da 50 mL. Gira tutti i nuovi tubi da 50 mL a 300 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e rallvi tutti e quattro i pellet cellulari in un totale di 10 mL di PBS sterile.
  9. Contare le celle per trypan esclusione blu utilizzando un emocitometro.
    NOTA: 8-20 x 106 cellule sono generalmente ottenute da 40 mL di sangue intero.

2. Coltura dei monociti umani primari

  1. L'utilizzo di un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi, un caldo supporto RPMI 1640 senza siero integrato con l'1% di penicillina-streptomycin (penna/strep) e (pur continuando a utilizzare tecniche sterili sotto un armadietto della biosicurezza) riavvalerà i monociti isolati in questo supporto a una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL.
  2. Aggiungere 1 mL di celle risospese in ogni pozzetto di un piatto da 6 pozzetto o in un piatto da 35 mm (il numero finale di cellule deve essere 1 x 106 celle /piastra), e mettere in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% di CO2. Attendere 0,5-1,0 h affinché le celle aderiscano.
  3. Utilizzando un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi, il siero bovino fetale (FBS) inattivato dal calore caldo (HI). Aggiungere 100 l (10% di concentrazione finale) di FBS ad ogni piastra. Aggiungere fattori di crescita alle cellule per promuovere la differenziazione dei macrofafi.
    1. Primi macrofagi per un fenotipo simile a M1 aggiungendo ai media 25 ng/mL di fattore di stimolazione della colonia di granulociti-macrofagi (GM-CSF). Primi macrofagi per un fenotipo simile a M2 aggiungendo 50 ng/mL di macrofalo fattore stimolante della colonia (M-CSF) ai media28.
      NOTA: sia GM-CSF che M-CSF consentono la differenziazione del monocito a un fenotipo generale del macrofago (M0) durante l'innesco delle cellule per M1 o M2, rispettivamente7,28,30.

3. Tradurre i monociti umani primari nella cultura

  1. Monociti transfetti con mimimi miRNA o inibitori o siRNA utilizzando un kit contenente un reagente di trasfezione basato su polimeri (Tabella dei materiali).
    1. Seguendo il protocollo del produttore per il kit di trasfezione (e continuando l'uso di tecniche sterili sotto un armadietto di biosicurezza), diluire prima i mimi/inibitori o i siRNA selezionati nel buffer fino a una concentrazione finale di 1,83M.
  2. Preparare il reagente di trasfezione aggiungendo 1 L del polimero fornito a un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml, seguito immediatamente dall'aggiunta di 90 l buffer forniti (per un totale di 91 l di reagente per trasfezione). Vortice per 3-5 s.
  3. Pipetta 90 L di soluzione di trasfezione nel tubo contenente 10 -L di miRNA diluito mimic/inibitore o siRNA. Mescolare con pipettaggio delicato e incubare per 15 min a RT.
  4. Aggiungere 100 L di complesso di trasfezione a un pozzo (o piatto) di 1 x 106 monociti placcati. Incubare le cellule per 4 h a 37 , quindi sostituire il supporto con 3 mL di supporti completi (RPMI 1640 integrato con 1% penicillina-streptomicina e 10% di FBS inattivati dal calore) contenenti GM-CSF o M-CSF.

4. Differenziazione e attivazione M1/M2

  1. I monociti iniziano immediatamente a differenziarsi con ampi macrofagi M0 dopo la placcatura in coltura. Il terzo giorno dopo la placcatura, continuare l'utilizzo di tecniche sterili sotto un armadio di biosicurezza e sostituire i supporti con 3 mL di nuovi supporti RMPI 1640 (completati con 1% penicillina-streptomycin, 10% di FBS inattivati dal calore e 25 ng/mL GM-CSF per promuovere la polarizzazione M1-like o 50 ng/mL M-CSF per promuovere la polarizzazione M2). Coltura le cellule in queste condizioni per un totale di 6 giorni da placcatura iniziale in un'incubatrice a 37 c, 5% CO2.
  2. Per far avanzare la polarizzazione delle cellule innescate al fenotipo M1-macrophage, attivare le cellule il giorno 6 dell'incubazione sostituendo i supporti cellulari con un nuovo supporto contenente il 5% di FBS disattivazione del calore, l'1% di penna/strep, 100 lipopolysaccharide derivati da ng/mL E. coli(LPS) e gamma di interfero 20 ng/mL (IFN-).
  3. Per far avanzare la polarizzazione delle cellule innescate al fenotipo M2-macrophage, attivare le cellule il giorno 6 dell'incubazione sostituendo i supporti cellulari con nuovi supporti contenenti il 5% di FBS disturbati dal calore, 1% penna/strep, 10 ng/mL M-CSF e 20 interleuin 4 ng/mL (IL-4).
  4. Dopo 24 h, raccogliere le cellule per l'RNA, proteine, o analisi della citometria di flusso.
    1. Quando le cellule sono pronte per la raccolta, lavare le cellule nel piatto 2x con PBS (a RT per l'estrazione dell'RNA o raffreddate sul ghiaccio per l'estrazione di proteine). Poiché i macrofagi differenziati sono ora saldamente attaccati alle piastre, lesizie delle cellule nelle piastre direttamente per ottenere materiale per le analisi dell'RNA e delle proteine.
    2. Per la raccolta del materiale per la citometria di flusso, aggiungere PBS contenente 2 mM EDTA al piatto, incubare le cellule per 10 min a 37 gradi centigradi, raschiare delicatamente le cellule dal piatto e raccogliere il contenuto in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL prima di procedere con protocolli standard.

5. Citometria di flusso

  1. Risciacquare le cellule in PBS per rimuovere il mezzo di coltura. Abbassare 100.000 cellule (per ogni condizione di citometria di flusso) e sospendere nuovamente il pellet in 100 - L di PBS contenente 2 -L di inibitore del legame HuFcR. Incubare a RT per 15 min.
  2. Aggiungere 50 l di tampone di colorazione e gli anticorpi desiderati (qui, CD80, CD83, CD163 e CD209) nelle quantità raccomandate.
  3. Mescolare delicatamente e incubare a 4 gradi centigradi al buio per 30 min.
  4. Lavare 2x con PBS e risospendere le celle macchiate in 150 gradi l di PBS prima di eseguire il campione su un citofluorimetro.

Risultati

Utilizzando la procedura descritta, sono stati isolati i monociti umani primari di individui affetti da HIV e donatori sani. Tutti i dati qui presentati sono stati ottenuti daHIV: soggetti sottoposti a cART con basso (<20 copie/mL) o carichi virali non rilevabili e normali conteggi di cellule CD4e T. Subito dopo l'isolamento, le cellule sono state macchiate, e la citometria di flusso è stata eseguita per confermare la purezza delle popolazioni di cellule. I risultat...

Discussione

Il protocollo presentato dimostra l'uso di cellule primarie di soggetti infettati da HIV come modello per studiare monociti e macrofagi. HIV- I pazienti sottoposti a cART vivono con infezione per più anni e possono anche avere altre co-infezioni correlate a un sistema immunitario compromesso. Per studiare l'immunomodulazione in presenza di infezione cronica da HIV, le cellule sono state raccolte direttamente dai pazienti. Poiché i miRNA hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nello sviluppo cellular...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano ringraziare il nucleo del biorepository clinico/tumorale dell'HIV per aver fornito campioni di pazienti e il nucleo del metabolismo dell'immunologia cellulare per la fornitura dell'analisi della citometria del flusso. Questo progetto è stato finanziato da NIH P20GM121288 e P30GM114732.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5M EDTAInvitrogenAM9260G
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTABD Biosciences366643
Brilliant Stain BufferBD Horizon563794Flow cytometry
CD14 PerCPInvitrogen46-0149-42Flow cytometry- conjugated antibody
CD163 BV711BD Horizon563889Flow cytometry- conjugated antibody
CD209 BV421BD Horizon564127Flow cytometry- conjugated antibody
CD80 FITCBD Horizon557226Flow cytometry- conjugated antibody
CD83 APCBD Horizon551073Flow cytometry- conjugated antibody
Easy 50 EasySep MagnetStemCell Technologies18002
Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation KitStemCell Technologies19669
EIF4EBP1 mAbCell Signaling9644Monoclonal antibody for Western blot
EIF4EBP1 siRNASanta Cruzsc-29594
Fetal Bovin Serum Defined Heat InactivatedHycloneSH30070.03HI
Gallios Flow CytometerBeckman CoulterB43618
GAPDH mAbSanta CruzSC-47724Monoclonal antibody for Western blot
HuFcR Binding InhibitoreBiosciences14-9161-73Flow cytometry- blocking buffer
Kaluza Analysis SoftwareBeckman CoulterB16406Software to analyze flow cytometry data
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5SigmaL4524
miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5pQiagenYM00472124
MISSION miRNA Negative ControlSigmaHMC0002Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye
Nunc 35mm Cell Culture DishThermo Scientific150318
PBSGibco20012027
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Recombinant Human GM-CSFR&D Systems215-GM-050
Recombinant Human IFN-γR&D Systems285-IF-100
Recombinant Human IL-4R&D Systems204-IL-010
Recombinant Human M-CSFR&D Systems216-MC-025
RPMI 1640 with L-GlutamineCorning10040CVMP
Scrambled Control siRNASanta Cruzsc-37007
Viromer Blue Transfection Reagent KitLipocalyxVB-01LB-01
WST-1 Cell Proliferation ReagentRoche5015944001Colorimetric assay to assess cell viability

Riferimenti

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