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Resumo

Apresentado aqui é um protocolo otimizado para isolar, cultivar, transfeccionar e diferenciar monócitos primários humanos de indivíduos infectados pelo HIV e controles saudáveis.

Resumo

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) continua a ser um grande problema de saúde, apesar da introdução da terapia antirretroviral combinada (cART) em meados da década de 1990. Embora a terapia antirretroviral reduza eficientemente a carga viral sistêmica e restaure a contagem normal de células T CD4+ T, ela não reconstitui um sistema imunológico completamente funcional. Um sistema imunológico disfuncional em indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART pode ser caracterizado por ativação imunológica, envelhecimento precoce de células imunes ou inflamação persistente. Essas condições, juntamente com fatores comórbidos associados à infecção pelo HIV, adicionam complexidade à doença, que não pode ser facilmente reproduzida em modelos celulares e animais. Para investigar os eventos moleculares subjacentes à disfunção imunológica nesses pacientes, um sistema para cultura e manipular monócitos primários humanos in vitro é apresentado aqui. Especificamente, o protocolo permite a cultura e transfecção do CD14 primário+ monócitos obtidos a partir de indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART, bem como de controles HIV-negativos. O método envolve isolamento, cultura e transfecção de monócitos e macrófagos derivados de monócitos. Embora kits e reagentes comercialmente disponíveis estejam empregados, o protocolo fornece dicas importantes e condições otimizadas para aadesão bem-sucedida e transfecção de monócitos com miRNA imitadores e inibidores, bem como com siRNAs.

Introdução

A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1) causa disfunção imunológica grave, o que pode levar a infecções oportunistas e à síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Embora os pacientes infectados pelo HIV submetidos a CART sejam caracterizados por baixas cargas virais e contagens normais de células T CD4+ T, o funcionamento do sistema imunológico pode ser comprometido nesses indivíduos, levando a uma resposta imune disfuncional que tem sido associada a um risco aumentado de desenvolver câncer1. Os mecanismos de disfunção imunológica em pacientes com HIV em cART permanecem em grande parte desconhecidos. Portanto, caracterizar as células imunes derivadas do paciente e investigar sua biologia e função é um componente crítico da pesquisa atual sobre HIV.

Monócitos e macrófagos são reguladores-chave das respostas imunes e desempenham papéis fundamentais na infecção pelo HIV2,3,4,5. Heterogêneo e plástico na natureza, macrófagos podem ser amplamente classificados em ativado classicamente (M1) ou ativado alternativamente (M2). Embora essa classificação geral seja necessária na criação de condições experimentais, o status de polarização dos macrófagos pode ser revertido por uma variedade de citocinas6,7,8,9. Embora vários estudos tenham investigado os efeitos da infecção pelo HIV em monócitos e células dendríticas, detalhes moleculares de respostas mediadas por monócito são em grande parte desconhecidos6,7,10,12,12,14,15,16,17,18,19. Entre os fatores envolvidos na regulação e função das células imunes, microRNAs (miRNAs), RNAs curtos não codificadores que regulam a expressão gênica pós-transcritoria, têm demonstrado desempenhar um papel importante no contexto das principais vias celulares (ou seja, crescimento, diferenciação, desenvolvimento e apoptose)20. Estas moléculas têm sido descritas como importantes reguladores de fatores de transcrição essenciais para ditar a polarização funcional dos macrófagos21. O papel potencial dos miRNAs em monócitos de indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART tem sido investigado, mas o progresso no campo requer muito mais trabalho22,23,24,25,26. Este artigo discute um método otimizado para transfect miRNAs e siRNAs em monócitos humanos primários de pacientes infectados pelo HIV e controles.

Este protocolo baseia-se em reagentes e kits comercialmente disponíveis, uma vez que a continuidade no procedimento técnico ajuda a eliminar variáveis experimentais desnecessárias ao trabalhar com amostras clínicas. No entanto, o método fornece dicas importantes (ou seja, o número de células banhadas ou breve incubação com mídia livre de soro para promover a adesão das células à placa). Além disso, as condições de polarização utilizadas neste protocolo são derivadas do trabalho publicado27,28,29.

Protocolo

Todos os métodos descritos abaixo foram aprovados pelo Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board. Todo o sangue foi coletado após a obtenção de consentimento informado.

NOTA: Todo o procedimento é realizado em condições estéreis em uma instalação de nível 2 de biossegurança (BSL2) para que o cuidado seja usado para lidar com materiais biológicos. Em particular, cada etapa é realizada usando técnicas estéreis um armário de biossegurança. Após cada etapa envolvendo sangue, produtos sanguíneos, células ou tubulação de produtos celulares, é importante enxaguar todo o material plástico (ou seja, pipetas sorológicas, pontas de pipetas e tubos) com 10% de lixívia de um recipiente de resíduos dentro do capô antes do descarte adequado.

1. Isolamento de monócitos humanos primários por seleção negativa imunomagnética

  1. Colete 40 mL de sangue integral humano fresco (de um HIV+ paciente ou controle saudável) em quatro tubos de vácuo etilediaminatetraáticos (EDTA) de 10 mL( 10 mL de sangue por tubo). Usando técnicas estéreis um armário de biossegurança, transfira todos os 40 mL do sangue em um tubo cônico do propileno de 50 mL.
  2. Seguindo o protocolo do fabricante para o kit de isolamento monócito humano selecionado(Mesa de Materiais),adicione 2 mL de coquetel de isolamento monócito, fornecido no kit, ao tubo de sangue. Vortex contas magnéticas, também fornecido no kit, para 30 s, e adicionar 2 mL para o tubo de sangue.
    1. Se menos de 40 mL de sangue estiver disponível, reduza os reagentes adicionados. Para misturar a solução, pipeta para cima e para baixo com uma pipeta sorológica de plástico 25 mL e incubar por 5 min à temperatura ambiente (RT).
  3. Separe a mistura de sangue igualmente em quatro tubos de 50 mL e adicione 30 mL de soline estéril tampão de fosfato (PBS) contendo 1 mM EDTA para cada tubo. Misture por pipetting cima e para baixo com uma pipeta sorológica de plástico 25 mL.
  4. Coloque os tubos em suportes de ímã por 10 min para remover as contas magnéticas conjugadas com anticorpos. Use quatro suportes do ímã simultaneamente, um para cada tubo, para permitir tempos consistentes da incubação e da isolação para cada amostra de sangue.
  5. Elabore o conteúdo do centro de cada tubo, usando uma pipeta, enquanto eles ainda estão nos suportes do ímã. Tenha cuidado para não elaborar glóbulos vermelhos (não mais do que 10% do volume inicial de 10 mL), e coloque o conteúdo em um dos quatro novos tubos de 50 mL.
  6. Adicione 500 μL de contas magnéticas vórticeas a cada tubo de 50 mL. Pipeta para cima e para baixo com uma pipeta de 25 mL e incubar em RT para 5 min. Em seguida, coloque os tubos em suportes de ímã por 5 min.
  7. Transfira cuidadosamente o conteúdo do centro de cada tubo enquanto ainda está em suportes de ímã para um dos quatro novos tubos de 50 mL. Coloque diretamente cada novo tubo de 50 mL nos suportes de ímã por 5 min.
  8. Transfira cuidadosamente o conteúdo do centro de cada tubo para um dos quatro novos tubos de 50 mL. Gire todos os novos tubos de 50 mL a 300 x g por 5 minutos. Aspirar o supernatant e resuspender todas as quatro pelotas celulares em um total de 10 mL de PBS estéril.
  9. Conte as células por exclusão azul trypan usando um hemocytometer.
    NOTA: 8-20 x 106 células são geralmente obtidas a partir de 40 mL de sangue inteiro.

2. Culturing de monócitos humanos primários

  1. Usando um banho de água 37 °C, a mídia RPMI 1640 sem soro quente complementada com 1% penicilina-estreptomicina (caneta/estreptococo), e (continuando a usar técnicas estéreis um armário de biossegurança) resuspende os monócitos isolados nesta mídia a uma concentração de 1 x 106 células/mL.
  2. Adicione 1 mL de células resuspensas a cada poço de uma placa de 6 poços ou em um prato de 35 mm (o número final de células deve ser 1 x 106 células/placa), e coloque em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2. Espere 0,5-1,0 h para as células a aderir.
  3. Usando um banho de água 37 °C, calor quente inativado (HI) soro fetal bovino (FBS). Adicione 100 μL (10% de concentração final) da FBS a cada placa. Adicionar fatores de crescimento para as células para promover a diferenciação de macrófagos.
    1. Macrófagos prime para um fenótipo m1-like, adicionando 25 ng /mL de granulocito-macrófago colônia de estímulo fator (GM-CSF) para a mídia. Macrófagos prime para um fenótipo m2-like, adicionando 50 ng /mL de macrófago colônia de estímulo fator (M-CSF) para a mídia28.
      NOTA: Tanto gm-CSF e M-CSF permitir diferenciação monócito para um fenótipo de macrófago geral (M0), enquanto as células priming para M1 ou M2, respectivamente7,28,30.

3. Transfecting monocytes humanos preliminares na cultura

  1. Monócitos transfect com miRNA imita ou inibidores ou siRNA usando um kit contendo um reagente de transfecção à base de polímero(Mesa de Materiais).
    1. Seguindo o protocolo do fabricante para o kit de transfecção (e continuando o uso de técnicas estéreis um armário de biossegurança), diluir pela primeira vez os imitadores/inibidores de miRNA selecionados ou siRNAs no buffer para uma concentração final de 1,83 μM. Prepare 10 μL de mi-inibidor diluído por transfecção de 1 x 106 células.
  2. Prepare o reagente de transfecção adicionando 1 μL do polímero fornecido a um tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mL, seguido imediatamente adicionando 90 μL de buffer fornecido (para um total de 91 μL de reagente por transfecção). Vórtice por 3-5 s.
  3. Pipette 90 μL de solução de transfecção no tubo contendo 10 μL de miRNA diluído mimic/inibidor ou siRNA. Misture por pipetting suave e incubar por 15 min em RT.
  4. Adicione 100 μL de complexo de transfecção a um poço (ou prato) de 1 x 106 monócitos banhados. As células incubadas por 4 h a 37 °C, em seguida, substituir o meio com 3 mL de mídia completa (RPMI 1640 complementado com 1% penicilina-estreptomicina e 10% fbs inativado de calor) contendo GM-CSF ou M-CSF.

4. M1/M2 diferenciação e ativação

  1. Os monócitos começam imediatamente a diferenciar-se aos macrófagos M0 largos em cima do revestimento na cultura. No terceiro dia após o revestimento, continue usando técnicas estéreis um armário de biossegurança e substitua a mídia por 3 mL de novos meios de comunicação RMPI 1640 (complementado com 1% de penicilina-estreptomicina, 10% FBS inativado pelo calor e 25 ng/mL GM-CSF para promover a polarização semelhante à M1 ou 50 ng/mL M-CSF para promover a polarização semelhante à M2). Cultura as células nestas condições para um total de 6 dias a partir de revestimento inicial em uma incubadora em 37 °C, 5% CO2.
  2. Para avançar a polarização das células preparadas para o fenótipo de macrófago M1-macrófago, ativar as células no dia 6 de incubação, substituindo a mídia celular por novas mídias contendo FBS inativada pelo calor de 5%, 1% caneta/estreptococo, 100 ng/mL E. coli-lipopolissaccharide derivado (LPS) e 20 gamma interferon ng/mL (IFN-γ).
  3. Para avançar a polarização das células preparadas para o fenótipo de m2-macrófago, ativar as células no dia 6 de incubação, substituindo a mídia celular por novas mídias contendo FBS 5% inativada pelo calor, 1% caneta/estreptococo, 10 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL interleucina 4 (IL-4).
  4. Após 24 h, colher as células para análises de RNA, proteína ou citometria de fluxo.
    1. Quando as células estão prontas para coleta, lave as células no prato 2x com PBS (em RT para extração de RNA ou refrigerados no gelo para extração de proteínas). Como os macrófagos diferenciados estão agora firmemente ligados às placas, lyse as células em placas diretamente para obter material para análises de RNA e proteínas.
    2. Para a coleta de material para citometria de fluxo, adicione PBS contendo 2 mM EDTA para o prato, incubar as células por 10 min em 37 °C, raspar suavemente as células do prato, e recolher o conteúdo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL antes de prosseguir com protocolos padrão.

5. Citometria flow

  1. Lave as células em PBS para remover o meio de cultivo. Desça 100.000 células (por cada condição de citometria de fluxo) e resuspenda a pelota em 100 μL de PBS contendo 2 μL de inibidor de ligação HuFcR. Incubar em RT por 15 min.
  2. Adicione 50 μL de buffer de coloração e os anticorpos desejados (aqui, CD80, CD83, CD163 e CD209 foram usados) nas quantidades recomendadas.
  3. Misture suavemente e incubar a 4 °C no escuro por 30 min.
  4. Lave 2x com PBS e resuspenda as células manchadas em 150 μL de PBS antes de executar a amostra em um citofluorímetro.

Resultados

Usando o procedimento descrito, os monócitos humanos preliminares dos indivíduos HIV-contaminados e os doadores saudáveis foram isolados. Todos os dados aqui apresentados foram obtidos a partir de HIV+ sujeitos submetidos a cART com baixa (<20 cópias/mL) ou cargas virais indetectáveis e contagens normais de células T CD4+ T. Imediatamente após o isolamento, as células foram manchadas, e citometria de fluxo foi realizada para confirmar a pureza das populaçõe...

Discussão

O protocolo apresentado demonstra o uso de células primárias de indivíduos infectados pelo HIV como modelo para o estudo de monócitos e macrófagos. HIV+ pacientes submetidos a cART vivem com infecção por vários anos e também podem ter outras co-infecções relacionadas a um sistema imunológico comprometido. Para estudar a imunomodulação na presença de infecção crônica do HIV, as células foram colhidas diretamente dos pacientes. Como miRNAs têm demonstrado desempenhar papéis importantes no de...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Núcleo biorepositório clínico/tumoral do HIV por fornecer amostras de pacientes e o Núcleo de Metabolismo de Imunologia Celular por fornecer análise de citometria de fluxo. Este projeto foi financiado pelo NIH P20GM121288e e P30GM114732.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5M EDTAInvitrogenAM9260G
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTABD Biosciences366643
Brilliant Stain BufferBD Horizon563794Flow cytometry
CD14 PerCPInvitrogen46-0149-42Flow cytometry- conjugated antibody
CD163 BV711BD Horizon563889Flow cytometry- conjugated antibody
CD209 BV421BD Horizon564127Flow cytometry- conjugated antibody
CD80 FITCBD Horizon557226Flow cytometry- conjugated antibody
CD83 APCBD Horizon551073Flow cytometry- conjugated antibody
Easy 50 EasySep MagnetStemCell Technologies18002
Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation KitStemCell Technologies19669
EIF4EBP1 mAbCell Signaling9644Monoclonal antibody for Western blot
EIF4EBP1 siRNASanta Cruzsc-29594
Fetal Bovin Serum Defined Heat InactivatedHycloneSH30070.03HI
Gallios Flow CytometerBeckman CoulterB43618
GAPDH mAbSanta CruzSC-47724Monoclonal antibody for Western blot
HuFcR Binding InhibitoreBiosciences14-9161-73Flow cytometry- blocking buffer
Kaluza Analysis SoftwareBeckman CoulterB16406Software to analyze flow cytometry data
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5SigmaL4524
miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5pQiagenYM00472124
MISSION miRNA Negative ControlSigmaHMC0002Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye
Nunc 35mm Cell Culture DishThermo Scientific150318
PBSGibco20012027
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Recombinant Human GM-CSFR&D Systems215-GM-050
Recombinant Human IFN-γR&D Systems285-IF-100
Recombinant Human IL-4R&D Systems204-IL-010
Recombinant Human M-CSFR&D Systems216-MC-025
RPMI 1640 with L-GlutamineCorning10040CVMP
Scrambled Control siRNASanta Cruzsc-37007
Viromer Blue Transfection Reagent KitLipocalyxVB-01LB-01
WST-1 Cell Proliferation ReagentRoche5015944001Colorimetric assay to assess cell viability

Referências

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