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要約

現在の研究で開発された急性肝不全動物モデルは、潜在的な治療法の研究のための実行可能な代替手段を提示します。現在のモデルは物理的および薬物誘発性肝障害の結合効果を採用し、新しい療法の可能性を研究するために適切な時間枠を提供する。

要約

急性肝不全(ALF)は、代謝、生化学的、合成、および肝臓の解毒機能の喪失をもたらす様々な病因によって引き起こされる臨床状態である。ほとんどの不可逆的な肝臓障害の場合, 直交異方性肝移植 (OLT) 唯一の利用可能な治療法.ALFの治療の治療可能性を研究するには、ALFの動物モデルにおけるその以前の試験が不可欠である。現在の研究では、ラットのALFモデルは、70%の部分肝切除術(PHx)と48時間の治療ウィンドウを提供するアセトアミノフェン(APAP)の注射を組み合わせることによって開発されました。肝臓の中央および左横葉を除去して肝臓塊の70%を切除し、APAPは2日間手術後に24時間与えられた。ALF誘発動物の生存率は著しく低下することが分かった。ALFの発症は、酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アルカリホスファターゼ(ALP)の血清レベルを変化させることによって確認された。プロトロンビン時間(PT)の変化;国際正規化比(INR)の評価。qPCRによる遺伝子発現プロファイルの研究は、アポトーシス、炎症、および肝障害の進行に関与する遺伝子の発現レベルの増加を明らかにした。肝細胞の拡散変性および免疫細胞の浸潤は、組織学的評価によって観察された。ALFの可逆性は、同系健康ラット肝細胞の脾臓内移植後のALT、AST、およびALPの生存および血清レベルの回復によって確認された。このモデルはALFの病態生理学を研究し、ALFのための新しい療法の可能性を評価するために利用できるALF動物モデルに信頼できる代わりを提示する。2つの異なるアプローチの使用はまた、物理的および薬物誘発性肝障害の組み合わせ効果を研究することを可能にする。現在のプロシージャの再現性と実現可能性は、モデルの追加の利点です。

概要

急性肝不全(ALF)は、米国肝疾患研究協会によって、損傷の事前徴候なしに急性肝障害の急速な発症として定義され、肝臓1の合成、代謝、および解毒機能の重度の障害によって特徴付される。ALFは、長期間にわたる肝障害の結果として障害が生じる慢性肝不全と、慢性肝疾患2、3、4の結果として突然の肝障害が起こる急性慢性肝不全(ACLF)とは異なる。ALFの唯一の治療法は、オルソトピック肝臓移植(OLT)であり、または死亡が起こる可能性がある。肝臓ドナーの不足のために、ALFに罹患している患者の死亡率は非常に高いです。

代替治療アプローチの可能性を研究し、ALFの病態生理学をよりよく理解するためには、ヒトで起こっているALFを反映できる動物モデルが必要である。すでに利用可能なALF動物モデルの多くには、いくつかの欠点があります。アセトアミノフェン(APAP)効果は再現が困難ですが、時間的、臨床的、生化学的、および病理学的パラメータの点で最も近い類似点を有する。APAP誘導動物モデルは、APAPおよびその中間体5、6、7によるヘモグロビンの酸化によって引き起こされるメトヘモグロビン血症の存在による問題にしばしば遭遇する。もう一つの問題は、予測不可能な用量応答と死亡時によって反映される再現性の欠如である。四塩化炭素(CCl4)を用いて製造されたALF動物モデルは、再現性が悪い8、9、10、11である。コンカバリンA(Con A)およびリポプリ糖(LPS)誘発ALF動物モデルは、自己免疫性肝疾患に関与する細胞機構の研究および敗血症の研究においてそれぞれ12、13、14、15に有利であるが、ヒト疾患の臨床パターンを反映していない。同様に、チオアセトアミド(TAA)はまた、活性代謝産物チオアセトアミドスルホキシドへの生体変換を必要とし、種変動16、17、18、19を示す。D-ガラクトサミン(D-Gal)は、ALFに類似した生化学的、代謝的、および生理学的変化を生じるが、ALF病理学的状態20、21、22、23全体を反映することができない。より良い方法でALF症候群を反映することができるALFモデルを開発するために、これらの方法の2つ以上を組み合わせる試みはほとんどありませんでした13.したがって、疾患パラメータを反映し、より良い再現性を有し、治療介入の効果を研究するのに十分な時間を提供するモデルを開発するためにさらなる研究が必要である。

現在の研究では、ラットの代替ALFモデルは、肝毒性試薬の部分肝切除術(PHx)と低用量の効果を組み合わせることによって作成されています。APAPは、肝臓の損傷を引き起こす上で確立された役割を持っています5,24,25.これは広く使用されている鎮痛薬であり、有毒な代謝産物を形成することによって、上剤用量で肝臓に有毒です.APAPは先進国で多くの死亡の原因です。部分肝切除術によって引き起こされる身体的傷害は、炎症および肝臓再生に関与する様々なプロセスの活性化を開始する。肝毒性剤APAPの注射は、肝臓に敵対的な環境を引き起こし、肝細胞の増殖を防ぐ。これは、ヘパトトキシンのより小さな用量と組み合わせると、手順のより良い再現性につながる動物のストレス期間を減少させます。そこで、このモデルを用いて、2種類の肝損傷の組み合わせ効果が検討されている。開発されたALF動物モデルを特徴付けるために、生理学的および生化学的パラメータが研究されている。ALFの可逆性の成功は、合成健康ラット肝細胞の移植によって確認された。

プロトコル

以下に説明する手順は、ニューデリー国立免疫学会の動物倫理委員会によって承認されています。承認のシリアル参照番号は IAEC#355/14 です。

1. 準備

  1. Das B et al.26によって前述したように外科的処置の準備をする。
  2. 体重が200~250gの6~8週齢の近親交配ウィスターラットを使用します。
  3. 標準的な動物のケア条件の下で動物を収容し、手順の前後にラットチョウと性欲でそれらを養います。
  4. 70%PHxを行う場合は、腹腔内注射されるケタミン塩酸塩(体重100mg/kg)とキシラジン(体重10mg/kg)の標準的なカクテルミックスを使用してください。
    注:使用される麻酔薬の種類は、死亡率および罹患率に術後効果を有し得る。
  5. 細胞移植の間、吸入麻酔イソフルラン(2-クロロ-2-(ジフルオロメトキシ)-1,1,1,1-トリフルオロエタン)を使用して、移植手術後の動物の回復時間を短縮する。
  6. カスタマイズされた麻酔システムを使用して吸入麻酔を誘発し、維持する。酸素の流れを4L/分に保つ。誘導使用のために4%でイソフルラン、および手術の間に2-3%の維持使用のために。

2. 術前手順

  1. ステップ3.1で説明したケタミン-キシラジン混合物を腹腔内に注入してラットを麻酔する。動物のつま先をつまんで完全な麻酔を確認します。さらなる手順は、ペダル反射がない場合にのみ行われます。
  2. 角膜乾燥を防ぐために、両方の眼にカルボキシメチルセルロースベースの眼滴を塗布する。
  3. 白いテープを使用して麻酔された動物を外科用板に拘束する。腹部を上に向けて動物を置き、手術を行う人から口が遠位側にあることを確認する。
  4. 電気バリカンを使用して、右上腹部の手術場から髪を取り除きます。
  5. ポビドネヨウ素の3つの交互のスクラブと70%エタノールを円形運動で殺菌された綿パッドを使用して手術部位を消毒する。

3. 肝肝切除術(PHx)を肝切除し、肝臓の質量の70%を除去する

メモ:層流フード内の滅菌環境下で外科的処置全体を実行します。手術後の感染リスクを最小限に抑えるために、無菌の手術器具のみを使用してください。肝臓量の70%の除去は、70%部分肝切除術(70%PHx)と名付けられ、C.ミッチェルおよびH.ウィレンブリング、200827によって記載されているように行われた。

  1. 手術を開始する前に、そのつま先をつまむことによって動物の完全な麻酔を確認します。さらなる手順は、ペダル反射がない場合にのみ行われます。
  2. 胸骨のすぐ下で切断し、xiphoidに垂直で、胸部に平行に切断する皮膚をマークします。
  3. マークされた皮膚の上に約3cm x 1cmの開口部を有する滅菌ドレープシートを置きます。
  4. メスでマークされたラインに沿って約2〜3cmの横方向の切開を行います。外科用ブレード22番を使用してください。無菌の湿った綿の先端を使用して、切開領域付近の下層に皮膚の付着を穏やかに取り除きます。
  5. 次に、xiphoidプロセスのすぐ下にある腹膜層を通して横切開を行います。
  6. 2つの生理線湿った綿の先端の助けを借りて、胸部に穏やかな圧力を加えることによって肝臓の左葉を露出させる。切開部の横隔膜領域に綿の先端を1つ置き、もう一方の綿の先端を切開領域の下に置き、肝臓の葉を持ち上げます。
  7. 露出した肝臓の葉の周りに8〜10cmの長い滅菌ナイロン糸ループ(サイズ4-0、0.15 mmの直径)を滑ります。マイクロディセプ鉗子や湿った綿の芽の助けを借りて、ヒラムに近いローブのベースにループを取ります。
  8. マイクロサージャリー針ホルダーとマイクロフォースプスの助けを借りて、ループの両端を結び、結び目を可能な限りローブの基部に近づけるので、血管を収縮させ、肝葉を取り除いた後の出血を減らします。反対側に2つの追加の結び目を結びます。
  9. 近くの血管に近すぎて結び目を結びすぎないように注意してください。
  10. マイクロサージャリーハサミを使用して結ばれたローブを結んだローブを結び目のすぐ上に切断し、ローブの代わりに虚血性切り株と呼ばれる組織の変色した塊を残します。
    注:ラット肝臓は、マウスと同様に、中央葉、右横葉、左横葉、および全肝臓質量の約40%、20%、30%、および7%を表すコーデートローブの4つの異なる葉に分かれています。これらの葉の任意の組み合わせは、70%の肝臓の質量を切除するために除去することができます。現在の研究では、中央値ローブと左横葉が除去された。
  11. 左横葉の残りの切り株を損傷することなく、慎重に中央値ローブを見つけます。腹腔からそっと引き出し、ローブの基部で8〜10cmの長いナイロン糸(サイズ4-0)の結び目を結びます。反対側に2つの追加の結び目を結びます。慎重に物品を取り除き、記載されているすべての予防措置を取って結ばれた中央値ローブを取り除く。
  12. ローブを取り除いた後、吸収性の高いクロミック4~0の縫合糸を使用して腹腹を縫合し、続いて皮膚を中断した縫合を行います。
  13. 感染を防ぐために縫合糸を取り囲む皮膚にポビドンヨウ素を塗布する。
  14. ドレープシートを取り外し、手術板から動物を取り除きます。

4. 動物の術後ケア

  1. 腹腔内は、術後感染のリスクからそれを保護するために、1 mLの注射器で5%グルコース溶液の1 mLで12 mgのセフォタキシム抗生物質の用量で動物を注射する。
  2. 手術後の痛みの軽減のために鎮痛性メロキシカム(体重1mg/kg)の皮下注射を投与し、さらに2回の用量でフォローアップし、レジメンを1日1回の投与量として維持する。
  3. 12時間の光/暗いサイクルの標準条件の下で操作された動物を収容し、定期的に監視します。

5. 肝不全を誘発する部分的にヘパトクトム化動物における薬物の注射

  1. 24時間手術後、動物が70%PHxから正常に回復したら、その後注射を行う動物の体重を測定する。
  2. APAPの体重750mg/kgを、手術から正常に回復した動物の70%PHxの後に24時間、部分的に肝切除動物に腹腔内に注入する。24時間後に再度用量を繰り返す。
    注:APAPの2回の用量は、動物に腹腔内に投与される(すなわち、24時間および48時間はそれぞれ70%PHx手順をポストする)。
  3. APAPの注入後の各時点で、回収動物の体重を測定する。
    注:APAP(ビオセタモール)は、2%ベンジルアルコール中の150mg/mL溶液として動物に注入される。

6. ALF動物モデルにおける健康肝細胞の移植

注:ラットにおけるALFの可逆性を研究するために、APAPの1st用量と共にALF誘導動物に正常な同系ラット肝細胞を移植する。現在の研究では、ホーミングおよび生着のために移植された細胞に十分な時間を提供するために、移植はAPAPの1st用量を与えた直後に行われた。ラット肝細胞は、ベリーとフレンズら28によって最初に公開されたプロトコルによって単離され、その後、いくつかの改変を伴う様々な他の研究29、30、31に適応される。ALF動物モデルにおける細胞の脾臓内移植については、以下に示す手順に従う。

  1. ラットを250~350gのラットに対して4%のイソフルランと4 L/min酸素流量の麻酔誘導用のポリ(メチルメタクリレート)チャンバーに入れます。動物のつま先をつまむとき、ペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
  2. 麻酔されたラットを外科用板の上に置き、左側の部分が上を向いている。適切なマウスピースを介して2〜3%のアイソフルラン吸入で麻酔を維持する。
  3. 左の側面領域の皮膚を剃り、ポビドンヨウ素溶液によって殺菌します。
  4. 皮膚の剃った領域に横方向の切開を行います。
  5. 腹膜層で1~2cmのカットを行い、脾臓を露出させる。
  6. 腹膜腔の脾臓を穏やかに取り出し、2つの湿った綿の先端の助けを借りてそれを持ち上げます。
  7. 移植される細胞(通常は動物1匹につき107個)を、29G針で1mLインスリン注射器中の50μL IMDM媒体に懸濁して保管する。
  8. 脾臓皮質に針をそっと突き刺し、細胞懸濁液を2~3分以内に脾臓に放出する。
  9. 細胞移植が完了したら、針を慎重に取り出し、部位からの細胞懸濁液の漏れを避けるために、湿った綿の先端で針穿刺の領域をダブします。
  10. 腹腹と皮膚を4~0の吸収性縫合糸で閉じ、連続および不連続な縫合を行います。
  11. 手術部位の感染を防ぐために縫合糸の場所で皮膚にポビドンヨウ素溶液を塗布する。
  12. 腹腔内注射は、12mg/mLの抗生物質(例えば、セフォタキシム)溶液を注入し、術後ケアの一環として1mg/kg体重を動物に皮下注射する。暖かい回復ケージに動物を移動します。
  13. 手術中の創傷が完全に治癒するまで、12時間の光/暗いサイクルの正常な条件下で手術した動物を隔離しておいてください。これには 3 ~ 4 日かかる場合があります。

7. ALF開発の特徴付け

  1. APAP治療の2回目の用量後にケタミン-キシラジン溶液2時間の過剰摂取によって動物を安楽死させ、血液および組織サンプルを収集する。
  2. 生化学的研究のために血液から血清を収集する 32.
  3. 組織学的および遺伝子発現研究のための肝臓組織サンプルを処理する 33,34,35.

結果

ALFの動物モデルにおける生存率
70%PHxと組み合わせてALFを引き起こすAPAPの最適な用量は、750 mg/kgの体重として標準化された。治療レジメンは、動物が手術から完全に回復した70%PHxの後に24時間開始し、24時間間隔で2つのAPAP用量から構成された。死亡率は、APAPの2回目の投与後80%の割合で観察され、48時間後の手術後に観察された。生存率を分析し、カプランマイヤー法を使用し?...

ディスカッション

ALFのための適切な動物モデルの開発は、病因およびALFの進行のより良い理解のために最も重要である。よく特徴付けられたALF動物モデルはまたALFに対する新しい治療アプローチの開発および試用のための機会を提供する。ALF6,12,21,23,46,47,48

開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

この研究は、インド政府バイオテクノロジー省からニューデリー国立免疫学研究所に寄せられたコア補助金によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetaminophen (Biocetamol)EG PharmaceuticalsNo specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)Coral Clinical System, IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyserTulip, Alto Santracruz, IndiaScreen Maaster 3000Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution)Win-Medicare; IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet (Class I)Kartos international; IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field MicroscopeOlympus, JapanLX51
Cefotaxime (Taxim®)AlKem; Indiacefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell StrainerSigma; USCLS431752
Collagenase Type IGibco by Life Technologies17100-017
Cotton BudsPure Swabs Pvt Ltd; IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
Drape SheetJSD Surgicals, Delhi, IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX MountantSigma; US6522
Eosin Y solution, alcoholicSigma; USHT110132
ForcepsMajor Surgicals; IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia SystemUgo Basile; Italy211000
GlucoseHimedia, IndiaGRM077
Hair removing cream (Veet®)Reckitt Benckiser, IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer'sSigma; USMHS16
Heparin sodium saltHimedia; IndiaRM554
Hyaluronidase From Sheep TestesSigma; USH6254
I.V. Cannula (Plusflon)Mediplus, IndiaRef 1732411420
Insulin SyringesBD; USREF 303060
Isoflurane (Forane®)Asecia QueenboroughNo B506Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax®)Troikaa Pharmaceuticals Ltd.Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex®)Intas Pharmaceuticals Ltd; IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight &
curved		Mercian; EnglandBS-13-8
Micro needle holders straight &
curved		Mercian; EnglandBS-13-8
MicrotomeHisto-Line Laboratories, ItalyMRS3500
Nylon ThreadMighty; IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
ParaformaldehydeHimedia; IndiaGRM 3660
Percoll®GE Healthcare17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist GelAllergan India Private Limited/Sun Pharma, IndiaP3060No specific Catalog Number
RPMIHimedia; IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
ScalpelMajor Surgicals; IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
ScissorsMajor Surgicals; IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KITCoral Clinical System, IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KITCoral Clinical System, IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E CryostatThermo Electron Corporation; USNo specific Catalog Number
SucroseSigma; USS0389
Surgical Blade No. 22La Medcare, IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical BoardLocally madeNo specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape3M India; India1530-1Micropore Surgical Tape
SuturesEthicon, Johnson & Johnson, IndiaNW 5047
Syringes (1ml, 26 G)Dispo Van; IndiaNo specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper)PhilipsNL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing MachineBraunNo specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E MediaHimedia; IndiaAT125
Xylazine (Xylaxin®)Indian Immunologicals LimitedSedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant

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