Geração de um modelo de rato de insuficiência hepática aguda, combinando 70% hepatectomia parcial e paracetamol

Resumo

O modelo animal da falha de fígado aguda desenvolvido no estudo atual apresenta uma alternativa praticável para o estudo de terapias potenciais. O modelo atual emprega o efeito combinado de ferimento hepático físico e droga-induzido e fornece uma janela de tempo apropriada para estudar o potencial de terapias novas.

Resumo

A insuficiência hepática aguda (ALF) é uma condição clínica causada por várias etiologias, resultando na perda de funções metabólicas, bioquímicas, sintetizantes e desintoxicantes do fígado. Na maioria dos casos irreversíveis de danos hepáticos, o transplante de fígado ortotrópico (OLT) continua sendo o único tratamento disponível. Para estudar o potencial terapêutico de um tratamento para ALF, seu teste prévio em um modelo animal de ALF é essencial. No presente estudo, um modelo ALF em ratos foi desenvolvido apartir da combinação de hepatectomia parcial de 70% (PHx) e injeções de paracetamol (APAP) que fornece uma janela terapêutica de 48 h. Os lobos laterais medianos e esquerdos do fígado foram removidos para extirpar 70% da massa do fígado e O APAP foi dado 24 h postsurgically por 2 dias. A sobrevivência em animais induzidos por ALF foi encontrada para ser diminuída severamente. O desenvolvimento da ALF foi confirmado por níveis alterados de soro das enzimas alanina amino transferase (ALT), aspartate amino transferase (AST), fósforo alcalino (ALP); mudanças no tempo de protrombina (PT); e avaliação do rácio normalizado internacional (INR). Estudo do perfil de expressão gênica por qPCR revelou um aumento nos níveis de expressão de genes envolvidos na apoptose, inflamação e na progressão da lesão hepática. A degeneração difusa de hepatócitos e a infiltração de células imunes foram observadas pela avaliação histológica. A reversibilidade da ALF foi confirmada pela restauração dos níveis de sobrevivência e soro de ALT, AST e ALP após transplante intrasplenic de hepatócitos de ratos saudáveis singênicos. Este modelo apresenta uma alternativa confiável para os modelos animais ALF disponíveis para estudar a fisiopatologia da ALF, bem como para avaliar o potencial de uma nova terapia para ALF. O uso de duas abordagens diferentes também permite estudar o efeito combinado da lesão hepática induzida por drogas e drogas. A reprodutibilidade e viabilidade do procedimento atual são um benefício adicional do modelo.

Introdução

A insuficiência hepática aguda (ALF) é definida pela Associação Americana para o Estudo de Doenças Hepáticas como o rápido desenvolvimento de lesão hepática aguda sem quaisquer sinais prévios de dano e é caracterizada por comprometimento grave das funções sintéticas, metabólicas e desintoxicantes do fígado^1. ALF difere da insuficiência hepática crônica, onde a falha ocorre como resultado de lesão hepática causada durante um longo período de tempo e de insuficiência hepática crônica aguda (ACLF), onde danos bruscos abruptos ocorre como resultado de doenças hepáticas crônicas^2,3,4. A única cura disponível para ALF é o transplante de fígado ortotópico (OLT), ou a morte pode ocorrer. Devido à escassez de doadores de fígado, a taxa de mortalidade em pacientes que sofrem de ALF é muito alta.

Para estudar o potencial de abordagens terapêuticas alternativas e para entender melhor a fisiopatologia da ALF, são necessários modelos animais que possam refletir a ALF que ocorre em seres humanos. Muitos dos modelos animais ALF já disponíveis têm várias deficiências. Os efeitos do paracetamol (APAP) são difíceis de reproduzir, mas têm as semelhanças mais próximas em termos de parâmetros temporais, clínicos, bioquímicos e patológicos. Modelos animais induzidos por APAP freqüentemente encontram problemas devido à presença de methemoglobinemia causada pela oxidação da hemoglobina pela APAP e seus intermediários^5,6,7. Outro problema é a falta de reprodutibilidade refletida por respostas de dose imprevisíveis e a hora da morte. Os modelos animais ALF produzidos com cloreto de tetra carbono (CCl₄₎têm baixa reprodutibilidade^8,9,10,11. Concavalin A (Con A) e lipoplysaccharide (LPS) induzida a modelos animais ALF não refletem o padrão clínico da doença humana, embora tenham vantagens no estudo de mecanismos celulares envolvidos em doenças hepáticas auto-imunes e no estudo da sepse respectivamente^12,13,14,15. Da mesma forma, o thioacetamide (TAA) também requer biotransformação para um metabolito ativo tiaacetamide sulfoxida e mostra variação de espécies^16,17,18,19. D-galactosamina (D-Gal) produz algumas alterações bioquímicas, metabólicas e fisiológicas semelhantes a ALF, mas não é capaz de refletir toda a condição patológica ALF^20,21,22,23. Houve muito poucas tentativas de combinar dois ou mais desses métodos para desenvolver um modelo ALF que é capaz de refletir a síndrome de ALF de uma maneira melhor¹³. Portanto, mais estudos são necessários para desenvolver um modelo que possa refletir os parâmetros da doença, tenha melhor reprodutibilidade e proporcione tempo suficiente para estudar os efeitos de uma intervenção terapêutica.

No estudo atual, um modelo alternativo de ALF nos ratos foi criado combinando os efeitos da hepatectomia parcial (PHx) e doses mais baixas de um reagente hepatotoxic. APAP tem um papel bem estabelecido na causa de lesão hepática^5,24,25. É um analgésico amplamente utilizado e é tóxico para o fígado em doses supraterapêuticas, formando metabólitos tóxicos. A APAP é a causa de muitas mortes em países desenvolvidos. Lesão física causada pela hepatectomia parcial inicia ativação de vários processos envolvidos na inflamação, bem como regeneração hepática. A injeção do agente hepatotóxico APAP causa um ambiente hostil no fígado, impedindo a proliferação de hepatócitos. Isso reduz o período de estresse sobre o animal, que quando combinado com doses menores de hepatotoxina, leva a uma melhor reprodutibilidade do procedimento. Portanto, usando este modelo, um efeito combinatório de dois tipos de lesões hepáticas tem sido estudado. Para caracterizar o modelo animal alf desenvolvido, parâmetros fisiológicos e bioquímicos têm sido estudados. A reversibilidade bem sucedida da ALF foi confirmada pelo transplante de hepatócitos de ratos saudáveis singênicos.

Protocolo

O procedimento descrito abaixo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Ética Animal do Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. O número de referência em série da aprovação é o IAEC#355/14.

1. Preparação

1. Prepare-se para o procedimento cirúrgico, como descrito anteriormente por Das B et al.²⁶.
2. Use 6-8 semanas de idade ratos Wistar consanguíneos com um peso corporal de 200-250 g.
3. Abrigar os animais em condições padrão de cuidados com os animais e alimentá-los com rat chow e libitum antes e depois do procedimento.
4. Ao realizar 70% de PHx, use uma mistura padrão de coquetel de cloridrato de cetamina (100 mg/kg de peso corporal) e xilina (10 mg/kg de peso corporal), que é injetado intraperitoneally.
   NOTA: O tipo de anestésico utilizado pode ter efeitos pós-operatórios sobre a mortalidade e morbidade.
5. Durante o transplante celular, use a anestesia inalante Isoflurane (2-cloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-etano) para reduzir o tempo de recuperação do animal após a cirurgia de transplante.
6. Induzir e manter a anestesia inalação usando um sistema de anestesia personalizado. Mantenha o fluxo de oxigênio em 4 L/min. Para uso de indução isoflurane em 4% e para uso de manutenção 2-3% durante o procedimento cirúrgico.

2. Procedimentos pré-operatórios

1. Anestesie o rato injetando a mistura de cetamina-xilázine descrita no passo 3.1 intraperitoneally. Confirme a anestesia completa beliscando o dedo do animal. Outros procedimentos são realizados apenas quando não há reflexo de pedal.
2. Para evitar a dessecação da córnea, aplique uma gota de olho à base de metilcelio carboxy em ambos os olhos.
3. Contenha o animal anestesiado a uma placa cirúrgica usando a fita branca. Coloque o animal com o lado abdominal voltado para cima, garantindo que a boca está no lado distal da pessoa que executa a operação.
4. Retire o cabelo da área cirúrgica abdominal superior direita usando um clipper elétrico.
5. Desinfete o local cirúrgico por três esfoliantes alternados de iodo povidone e 70% de etanol usando almofadas de algodão esterilizadas em movimento circular.

3. Hepatectomia parcial (PHx) para remover 70% da massa do fígado

NOTA: Realize todo o procedimento cirúrgico um ambiente estéril em um capô de fluxo laminar. Use apenas instrumentos cirúrgicos estéreis para minimizar o risco de infecção pós-cirúrgica. A remoção de 70% da massa hepática, denominada hepatectomia parcial de 70% (70% PHx), foi realizada conforme descrito por C. Mitchell e H. Willenbring,^{2008 27}.

1. Antes do início da cirurgia, confirme a anestesia completa do animal beliscando o dedo do dedo do dedo do dedo do dia. Outros procedimentos são realizados apenas quando não há reflexo de pedal.
2. Marque a pele a ser cortada logo abaixo do esterno, perpendicular ao xifórido, e paralelo à caixa torácica.
3. Coloque uma folha de cortina estéril com uma abertura de cerca de 3 cm x 1 cm sobre a pele marcada.
4. Realize uma incisão transversal de cerca de 2-3 cm ao longo da linha marcada com um bisturi. Use a lâmina cirúrgica nº 22. Remova delicadamente o acessório da pele à camada subjacente do músculo na vizinhança da área incisada usando pontas estérils do algodão umedecido.
5. Em seguida, faça uma incisão transversal através da camada peritoneal logo abaixo do processo xifórico.
6. Com a ajuda de duas pontas de algodão umedecido soro fisiológico, expor o lobo esquerdo do fígado, aplicando uma pressão suave sobre o tórax. Coloque uma ponta de algodão na região diafragmática da porção incisa e a outra ponta de algodão abaixo da região incisa para levantar o lóbulo do fígado.
7. Deslize um loop de fio de nylon estéril de 8-10 cm de comprimento (tamanho 4-0, 0,15 mm de diâmetro) ao redor do lobo do fígado exposto. Leve o laço para a base do lóbulo perto do hilum com a ajuda de fórceps microdissecting ou cotonetes umedecidos.
8. Com a ajuda do suporte da agulha da microcirurgia e dos microforceps, amarre as duas extremidades do laço, coloc o nó tão perto da base do lóbulo como possível para constrição do vaso sanguíneo e reduzir o sangramento depois que o lóbulo do fígado é removido. Amarre dois nós adicionais do outro lado.
9. Tome precauções para não amarrar o nó muito perto dos vasos sanguíneos próximos, o que pode causar obstrução venosa (estenose).
10. Use tesouras de microcirurgia para cortar o lobo amarrado logo acima do nó, o que deixa uma massa detecido descolorida chamada um coto isquêmico no lugar do lobo.
    NOTA: O fígado de rato, como os de camundongos, é dividido em quatro lobos distintos: o lobo mediano, lobo lateral direito, lobo lateral esquerdo e lóbulo caudado, que representam cerca de 40%, 20%, 30% e 7% da massa hepática total, respectivamente. Qualquer combinação desses lobos pode ser removida para extirpar 70% de massa hepática. No estudo atual, o lóbulo mediano e os lóbulos laterais esquerdos foram removidos.
11. Localização cuidadosa do lobo mediano sem danificar o toco restante do lobo lateral esquerdo. Puxe-o delicadamente fora da cavidade abdominal, e na base do lobe amarra um fio de nylon de 8-10 cm de comprimento (tamanho 4-0) nó como mencionado anteriormente. Amarre dois nós adicionais do outro lado. Cuidadosamente extirpar e remover o lobo mediano amarrado tomando todas as precauções mencionadas.
12. Após a remoção dos lobos, sutura do peritônio usando uma sutura cronômica absorvível 4-0 com pontos contínuos seguidos de sutura da pele com uma sutura interrompida.
13. Aplique iodo povidone na pele em torno das suturas para prevenir a infecção.
14. Retire a folha de cortina e retire o animal do tabuleiro de cirurgia.

4. Cuidados pós-operatórios em animais

1. Intraperitoneally injetar o animal com uma dose de 12 mg de antibiótico cefotaxime em 1 mL de 5% solução de glicose com uma seringa de 1 mL para protegê-lo do risco de infecção pós-operatória.
2. Administrar uma injeção subcutânea de meloxicam analgésico (1 mg/kg de peso corporal) para alívio da dor após a cirurgia e segui-lo por mais duas doses, mantendo o regime como uma dose por dia.
3. Abrigar os animais operados em condições padrão de 12 h de luz / ciclo escuro e monitorar em intervalos regulares.

5. Injeção de droga em animais parcialmente hepatectomizados para induzir insuficiência hepática

1. Após 24 h pós-cirurgia, quando os animais se recuperaram com sucesso de 70% de PHx, medir o peso corporal do animal seguido pelas injeções.
2. Injetar 750 mg/kg de peso corporal de APAP intraperitoneally em animais parcialmente hepatectomizados 24 h após o PHx de 70% após a recuperação bem sucedida dos animais do procedimento cirúrgico. Repita a dose novamente após 24 h.
   NOTA: Duas doses de APAP são administradas intraperitoneally ao animal (isto é, 24 h e 48 h borne o procedimento de 70% PHx, respectivamente).
3. Em cada ponto de tempo após a injeção de APAP, medir o peso corporal do animal em recuperação.
   NOTA: APAP (biocetamol) é injetado em animais como uma solução de 150 mg/mL em 2% de álcool benzyl.

6. Transplante de hepatócitos saudáveis em modelos animais ALF

NOTA: Para estudar a reversibilidade da ALF em ratos, transplante de hepatócitos de rato singêneo saudável intrasplenicamente nos animais induzidos por ALF, juntamente com a dose de 1^st de APAP. No presente estudo, para proporcionar tempo suficiente às células transplantadas para homing e enxerto, o transplante foi feito logo após dar a dose de^1º apap. Hepatócitos de ratos são isolados por um protocolo publicado pela primeira vez pela Berry and Friends et^{al. 28} e mais tarde adaptados em vários outros estudos^29,30,31 com algumas modificações. Para transplante intrasplenic de células no modelo animal ALF, siga os passos mencionados abaixo.

1. Coloque o rato em uma câmara poli (metilme metacrilato) para indução de anestesia com 4% isoflurano e fluxo de oxigênio L/min para um rato de 250-350 g de peso corporal. Verifique se há profundidade de anestesia pela falta de reflexos do pedal ao beliscar o dedo do animal.
2. Coloque o rato anestesiado no tabuleiro cirúrgico de tal forma que sua porção lateral esquerda está enfrentando. Manter anestesia em 2-3% inalação isoflurane através de um porta-voz adequado.
3. Raspe a pele na região lateral esquerda e a esteriliza por solução de iodo povidone.
4. Faça uma incisão transversal na região raspada da pele.
5. Faça um corte de 1-2 cm na camada peritoneal para expor o baço.
6. Gentilmente tirar o baço da cavidade peritoneal e levantá-lo com a ajuda de duas pontas de algodão umedecido.
7. Mantenha as células (tipicamente 10⁷ por animal) para serem transplantadas suspensas em 50 μL IMDM em uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha de 29 G.
8. Gentilmente perfurar a agulha no córtex do baço e liberar a suspensão celular no baço dentro de 2-3 min.
9. Após o transplante de células é concluída, retire cuidadosamente a agulha e dab a área da punção da agulha com uma ponta de algodão umedecido para evitar vazamento da suspensão celular do local.
10. Feche o peritônio e a pele por uma sutura absorvente 4-0 com sutura contínua e descontínua, respectivamente.
11. Aplique a solução de iodo povidone na pele no local das suturas para evitar a infecção no local operado.
12. Injete iperneally 1 mL volume de 12 mg/mL de antibiótico (por exemplo, cefotaxime) solução e subcutâneamente injetar analgésico (por exemplo, meloxicam) 1 mg / kg de peso corporal para o animal como parte do cuidado pós-operatório. Mova o animal para uma gaiola de recuperação quente.
13. Mantenha o animal operado em isolamento em condições normais de 12 h de luz / ciclo escuro até que as feridas cirúrgicas são completamente curadas. Isso pode levar de 3 a 4 dias.

7. Caracterização do desenvolvimento da ALF

1. Eutanásia os animais por overdose de solução de cetamina-xilázine 2 h após a^dose 2 de tratamento APAP e coletar amostras de sangue e tecido.
2. Coletar soro de sangue para estudos bioquímicos³².
3. Amostras de tecido hepático processo para estudos histológicos e de expressão gênica^33,34,35.

Resultados

Percentual de sobrevivência em modelos animais de ALF
A dose ideal de APAP para causar ALF em combinação com 70% PHx foi padronizado como 750 mg / kg de peso corporal. O regime de tratamento começou 24 h após 70% de PHx, quando os animais se recuperaram completamente da cirurgia, e consistiu em duas doses de APAP em intervalos de 24 h. A mortalidade foi observada à taxa de 80% após a administração da segunda dose de APAP, 48 h pós-cirurgia. A porcentagem de sobrevivência foi analisada e tra...

Discussão

O desenvolvimento de um modelo animal adequado para ALF é fundamental para uma melhor compreensão da patogênese e progressão da ALF. Um modelo animal alf bem caracterizado também oferece a oportunidade para o desenvolvimento e julgamento de novas abordagens terapêuticas contra a ALF. Muitas tentativas foram feitas para desenvolver um modelo clinicamente relevante de ALF^6,12,21,23,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen (Biocetamol)	EG Pharmaceuticals		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution)	Win-Medicare; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet (Class I)	Kartos international; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
Cefotaxime (Taxim®)	AlKem; India		cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer	Sigma; US	CLS431752
Collagenase Type I	Gibco by Life Technologies	17100-017
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Drape Sheet	JSD Surgicals, Delhi, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant	Sigma; US	6522
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma; US	HT110132
Forceps	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Glucose	Himedia, India	GRM077
Hair removing cream (Veet®)	Reckitt Benckiser, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma; US	MHS16
Heparin sodium salt	Himedia; India	RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes	Sigma; US	H6254
I.V. Cannula (Plusflon)	Mediplus, India	Ref 1732411420
Insulin Syringes	BD; US	REF 303060
Isoflurane (Forane®)	Asecia Queenborough	No B506	Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax®)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex®)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight & curved	Mercian; England	BS-13-8
Micro needle holders straight & curved	Mercian; England	BS-13-8
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Nylon Thread	Mighty; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Percoll®	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India	P3060	No specific Catalog Number
RPMI	Himedia; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation; US		No specific Catalog Number
Sucrose	Sigma; US	S0389
Surgical Blade No. 22	La Medcare, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board	Locally made		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape	3M India; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Sutures	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
Syringes (1ml, 26 G)	Dispo Van; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper)	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine	Braun		No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media	Himedia; India	AT125
Xylazine (Xylaxin®)	Indian Immunologicals Limited		Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant