70% 부분 간 절제술과 아세트아미노펜을 결합하여 급성 간 기능 부전의 쥐 모델 생성

요약

현재 연구에서 개발된 급성 간 부전 동물 모델은 잠재적인 치료법의 연구를 위한 실행 가능한 대안을 제시합니다. 현재 모델은 물리적 및 약물 유발 간 손상의 결합 된 효과를 채택하고 새로운 치료의 잠재력을 연구하기에 적합한 시간 창을 제공합니다.

초록

급성 간 부전 (ALF) 신진 대사의 손실의 결과로 다양 한 병 인에 의해 발생 하는 임상 상태, 생 화 확 적인, 합성, 그리고 간 기능 해독. 대부분의 돌이킬 수없는 간 손상 의 경우, 직교 간 이식 (OLT) 유일한 가능한 치료 남아. ALF에 대 한 치료의 치료 잠재력을 연구 하기 위해, ALF의 동물 모델에서 그것의 이전 테스트필수적이다. 현재 연구에서, 쥐에 있는 ALF 모형은 48 시간의 치료 창을 제공하는 70% 부분 간절제술 (PHx) 및 아세트아미노펜 (APAP)의 주사를 결합해서 개발되었습니다. 간 질량의 70%를 절제하기 위해 간 중도 및 좌측 엽을 제거하고 APAP는 2일 동안 수술 후 24시간 주어졌다. ALF 유도 동물에서의 생존은 심각하게 감소되는 것으로 나타났다. ALF의 발달은 알란닌 아미노 트랜스퍼라제(ALT), 아스파르타테 아미노 트랜스퍼라제(AST), 알칼리성 인산파타제(ALP)의 혈청 수준을 변경하여 확인하였다; 프로트롬빈 시간의 변화 (PT); 국제 정상화 비율(INR)의 평가. qPCR에 의한 유전자 발현 프로필에 대한 연구는 세포사멸, 염증 및 간 손상의 진행에 관여하는 유전자의 발현 수준 증가가 나타났다. 간세포의 확산변성 및 면역세포의 침투는 조직학적 평가에 의해 관찰되었다. ALF의 가역성은 합성 건강한 랫트 간세포의 인트라스장내 이식 후 ALT, AST 및 ALP의 생존 및 혈청 수준의 복원에 의해 확인되었다. 이 모델은 ALF의 병리생리학을 연구하고 ALF에 대한 새로운 치료법의 잠재력을 평가하기 위해 이용 가능한 ALF 동물 모델에 대한 신뢰할 수 있는 대안을 제시한다. 두 개의 다른 접근의 사용은 또한 가능한 물리적 및 약물 유발 간 손상의 결합 된 효과 공부. 현재 절차의 재현성과 타당성은 모델의 추가적인 이점입니다.

서문

급성 간부전(ALF)은 미국 간질환 연구에 의해 사전 손상 징후 없이 급성 간 손상의 급속한 발달로 정의되며 간장의 합성, 대사 및 해독 기능의 심각한 손상을 특징으로 한다^1. ALF는 장기간 에 걸쳐 발생하는 간 손상의 결과로 실패가 발생하는 만성 간 부전과 급성 만성 간 부전 (ACLF)에서 발생하는 만성 간 기능 부전과 는 다르며, 만성 간 질환의 결과로 갑작스러운 간 손상이 발생하는^2,3,4. ALF를 위한 유효한 치료는 정형외 간 이식 (OLT) 또는 죽음이 생길 수 있습니다. 간 기증자의 부족으로 인해 ALF를 앓고있는 환자의 사망률이 매우 높습니다.

대체 치료 접근법의 잠재력을 연구하고 ALF의 병리생리학을 더 잘 이해하기 위해서는 인간에서 발생하는 ALF를 반영할 수 있는 동물 모델이 필요합니다. 이미 사용 가능한 ALF 동물 모델의 대부분은 몇 가지 단점이 있습니다. 아세트아미노펜(APAP) 효과는 재현하기 어렵지만 시간적, 임상적, 생화학적 및 병리학적 매개 변수측면에서 가장 유사한 점이 있습니다. APAP-유도 동물 모델은 APAP 및 그^중간체에의한 헤모글로빈의 산화에 의한 메테모글로빈혈증의 존재로 인해 종종 문제가 발생한다^5,6,7. 또 다른 문제는 예측할 수 없는 복용량 응답 및 죽음의 시간에 의해 반영 된 재현성의 부족. 탄소 테트라 염화물 (CCl_4)을사용하여 생산 된 ALF 동물 모델은^{8, 9,10,11의재현성이}좋지 않습니다. 콘카발린 A(Con A) 및 리포슬리당(LPS)-유도 ALF 동물 모델은 자가면역 간 질환에 관여하는 세포 메커니즘의 연구및 패혈증의 연구에서 각각^{12,13,14,15의}이점을 가지고 있지만, 인간 질환의 임상 적 패턴을 반영하지 않는다. 유사하게, 티오아세타미드(TAA)는 또한 활성 대사산물 티오아세타미드 설폭사이드에 대한 생체변환을 필요로 하며 종 변이를^{16,17,18,19를}나타낸다. D-갈락토사민(D-Gal)은 ALF와 유사한 일부 생화학적, 대사적, 생리적 변화를 생성하지만 전체 ALF 병리학적 상태를 반영할 수^{없다(20,21,22,23)} 더 나은 방식으로 ALF 증후군을 반영할 수 있는 ALF 모델을 개발하기 위해 이들 방법 중 2개 이상을 결합하려는 시도는 거의 없었다^13. 따라서 질병 매개 변수를 반영할 수 있고, 재현성이 우수하며, 치료 적 개입의 효과를 연구할 충분한 시간을 제공하는 모델을 개발하기 위한 추가 연구가 요구된다.

현재 연구에서, 쥐에 있는 대안 ALF 모형은 부분 간절제술의 효력을 결합하여 만들어졌습니다 (PHx) 간 독성 시약의 더 낮은 복용량. APAP는 간 손상을 일으키는 데있어 잘 확립된 역할을 합니다^5,24,25. 그것은 널리 사용 되는 진통제 이며 독성 대사 산물을 형성 하 여 supratherapeutic 복용량에서 간 독성. APAP는 선진국에서 많은 죽음의 원인입니다. 부분 간 절제술로 인한 신체적 상해는 간 재생뿐만 아니라 염증에 관련된 다양한 과정의 활성화를 시작합니다. 간 독성 제제 APAP의 주입은 간세포의 증식을 방지, 간장에서 적대적인 환경을 야기한다. 이것은 동물의 스트레스 기간을 감소시켜, 더 적은 용량의 간독소와 결합하면 절차의 재현성이 향상됩니다. 따라서이 모델을 사용하여 두 가지 유형의 간 손상의 조합 효과가 연구되었습니다. 개발된 ALF 동물 모델을 특성화하기 위해 생리학적 및 생화학적 파라미터가 연구되었다. ALF의 성공적인 가역성은 합성 건강한 랫트 간세포의 이식에 의해 확인되었다.

프로토콜

아래에 설명된 절차는 뉴델리 국립 면역학 연구소의 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다. 승인의 일련 참조 번호는 IAEC#355/14입니다.

1. 준비

1. Das B 외^26에의해 설명된 바와 같이 외과 적 수술을 준비하십시오.
2. 체중이 200-250g인 6-8주 된 근친 위스타 쥐를 사용하십시오.
3. 표준 동물 관리 조건하에 동물을 수용하고 시술 전후에 쥐 차우와 리비툼으로 먹이십시오.
4. 70% PHx를 수행할 때, 피복중 으로 주입되는 케타민 염산염(100 mg/kg 체중)과 자일라진(10 mg/kg 체중)의 표준 칵테일 믹스를 사용하십시오.
   참고 : 사용되는 마취제의 유형은 사망률과 이환율에 수술 후 영향을 미칠 수 있습니다.
5. 세포 이식 동안, 흡입제 마취 이소플루란(2-클로로-2-(디플루오로메톡시)-1,1,1-트리플루오로-에탄)을 사용하여 이식 수술 후 동물의 회복 시간을 단축한다.
6. 유도 및 사용자 정의 마취 시스템을 사용하여 흡입 마취를 유지합니다. 산소 흐름을 4 L/min으로 유지합니다. 유도 사용에 대 한 isoflurane 에 4% 그리고 유지 보수 사용에 대 한 2-3% 수술 동안.

2. 수술 전 절차

1. 3.1단계에서 기재된 케타민-자일라진 혼합물을 복강 내 주사하여 쥐를 마취시다. 동물의 발가락을 꼬집어 완전한 마취를 확인하십시오. 추가 절차는 페달 반사가없는 경우에만 수행됩니다.
2. 각막 탈수증을 방지하려면, 두 눈에 카복시 메틸 셀룰로오스 기반 안약액을 적용하십시오.
3. 마취된 동물을 흰색 테이프를 사용하여 수술용 보드에 제지하십시오. 복부 쪽을 위로 향하도록 동물을 놓고 수술을 수행하는 사람의 말단 쪽에 입이 있는지 확인합니다.
4. 전기 클리퍼를 사용하여 오른쪽 상단 복부 수술 부위에서 머리카락을 제거합니다.
5. 포비동 요오드세 스크럽과 70% 에탄올을 번갈아 가며 살균된 면패드를 원형으로 사용하여 수술 부위를 소독합니다.

3. 부분 간 절제술 (PHx) 간 질량의 70 %를 제거

참고: 층류 후드에서 멸균 환경에서 전체 수술을 수행하십시오. 수술 후 감염 위험을 최소화하기 위해 멸균 수술 기구만 사용하십시오. 70% 부분 간 절제술(70% PHx)으로 명명된 간 질량의 70%를 제거한 후, C. Mitchell 및 H. Willenbring, 2008^27에의해 설명된 대로 수행되었다.

1. 수술이 시작되기 전에 발가락을 꼬집어 동물의 완전한 마취를 확인하십시오. 추가 절차는 페달 반사가없는 경우에만 수행됩니다.
2. 흉골 바로 아래에 절단될 피부를 표시하고, xiphoid에 수직으로, 흉곽과 평행하게 합니다.
3. 표시된 피부에 약 3 cm x 1 cm의 개구부를 갖는 멸균 드레이프 시트를 놓습니다.
4. 메스로 표시된 선을 따라 약 2-3cm의 횡절개를 수행합니다. 외과 용 블레이드 No. 22를 사용합니다. 멸균 축축한 면 팁을 사용하여 절개 부위 부근의 기본 근육 층에 피부 부착을 부드럽게 제거하십시오.
5. 다음으로, 단지 xiphoid 프로세스 아래 의 회막 층을 통해 횡 절개를합니다.
6. 식염수 로고가 촉촉한 면 팁 2개를 사용하여 흉부에 부드러운 압력을 가하여 간 왼쪽 엽을 노출시십시오. 절개된 부분의 횡격막 부위에 면 팁 1개를 놓고 다른 면 팁을 절개 부위 아래에 놓아 간엽을 들어 올립니다.
7. 노출 된 간 엽 주위에 8-10cm 길이의 멸균 나일론 스레드 루프 (크기 4-0, 0.15 mm 직경)를 미끄러. 미세 제해 집게 또는 촉촉한 면봉의 도움으로 hilum에 가까운 로브의 바닥에 루프를 가져 가라.
8. 미세 수술 바늘 홀더와 마이크로 포스의 도움으로 루프의 두 끝을 묶어 가능한 한 로브의 기저부에 매듭을 묶어 혈관을 수축시키고 간 엽이 제거 된 후 출혈을 줄입니다. 다른 쪽에 두 개의 매듭을 추가로 묶습니다.
9. 그렇지 않으면 정맥 방해 (협착)를 일으킬 수있는 근처 혈관에 너무 가까이 매듭을 묶지 않도록주의하십시오.
10. 미세 수술 가위를 사용하여 매듭 바로 위에 묶인 엽을 자르면 로브 대신 허혈성 그루터기라고 불리는 조직의 변색 된 덩어리가 남습니다.
    참고: 쥐 간, 쥐의 것과 같이, 4개의 명백한 엽으로 분할됩니다: 중앙엽, 오른쪽 측엽, 좌측 엽 및 caudate 엽, 대략 40를 나타내는, 20%, 30%, 및 총 간 질량의 7%, 각각. 이 로브의 어떤 조합든지 제거될 수 있습니다 70% 간 질량을 소비하기 위하여. 현재 연구에서는, 중앙엽 및 좌측 측엽이 제거되었다.
11. 왼쪽 측면 엽의 나머지 그루터기를 손상시키지 않고 중앙엽을 조심스럽게 찾습니다. 부드럽게 복강에서 당겨, 그리고 로브의 기지에서 8-10cm 긴 나일론 스레드 (크기 4-0) 매듭을 묶어 앞에서 언급 한 바와 같이. 다른 쪽에 두 개의 매듭을 추가로 묶습니다. 주의 깊게 절제하고 언급 된 모든 예방 조치를 복용 묶여 중앙 엽을 제거합니다.
12. 로브를 제거 한 후, 연속 바늘로 흡수 성 크롬 4-0 봉합사를 사용하여 복막을 봉합하고 중단 된 봉합사로 피부 봉합을합니다.
13. 감염을 방지하기 위해 봉합사를 둘러싼 피부에 포비동 요오드를 바르고 있습니다.
14. 드레이프 시트를 제거하고 수술 판에서 동물을 제거합니다.

4. 동물의 수술 후 관리

1. 복강 내 투여량으로 동물을 12 mg 의 cefotaxime 항생제1 mL에 5% 포도당 용액과 함께 1 mL 주사기로 주입하여 수술 후 감염의 위험으로부터 보호합니다.
2. 진통 멜 록시 캄의 피하 주입을 관리 (1 mg / kg 체중) 수술 후 통증 완화를 위해 두 번 더 복용하여, 하루에 하나의 용량으로 처방을 유지.
3. 12 시간 빛 / 어두운 주기의 표준 조건하에서 작동 동물을 수용하고 일정한 간격으로 모니터링하십시오.

5. 간 기능 부전을 유도하기 위해 부분적으로 간절제술을 입은 동물에 약물 주입

1. 수술 후 24 시간 후, 동물이 70 % PHx에서 성공적으로 회복 되었을 때, 주사 후 동물의 체중을 측정하십시오.
2. APAP 의 750 mg/kg 체중을 부분적으로 간척화 된 동물에 24 시간 후에 동물의 수술 수술에서 성공적으로 회복 한 후 750 mg / kg의 체중을 주입하십시오. 24 시간 후에 다시 복용량을 반복하십시오.
   참고: APAP의 2회 투여량은 동물에게 복강 내 투여된다(즉, 24시간 및 48시간 은 각각 70% PHx 시술을 게시한다).
3. APAP의 주입 후 각 시점에서, 회복 동물의 체중을 측정한다.
   참고: APAP (바이오세타몰)는 2% 벤질 알코올에 150 mg/mL 용액으로 동물에게 주입됩니다.

6. ALF 동물 모델에서 건강한 간세포 이식

참고: 쥐에서 ALF의 가역성을 연구하기 위해, APAP의 1^st 복용량과 함께 ALF 유도 동물에서 건강한 합성 쥐 간세포를 경내적으로 이식합니다. 현재 연구에서, 호밍 및 생착에 대한 이식된 세포에 충분한 시간을 제공하기 위해, 이식은 APAP의^1st 용량을 제공한 직후에 이루어졌다. 랫트 간세포는 베리 와 프렌즈^{외 28에} 의해 처음 출판된 프로토콜에 의해 분리되고, 이후 몇 가지 변형과 함께 다양한 다른 연구에서^{적응29,30,31.} ALF 동물 모델에서 세포의 인트라스플레인 이식의 경우, 아래에 언급된 단계를 따르십시오.

1. 250-350g의 쥐를 위한 4% 이소플루란 및 4 L/min 산소 흐름으로 마취의 유도를 위한 폴리 (메틸 메타크릴레이트) 챔버에 쥐를 놓습니다. 동물의 발가락을 꼬집을 때 페달 반사 신경이 부족하여 마취의 깊이를 확인하십시오.
2. 마취된 쥐를 수술판에 놓고 왼쪽 측면 부분이 위를 향할 수 있도록 합니다. 적절한 마우스 피스를 통해 2-3 %의 이소플루란 흡입에서 마취를 유지하십시오.
3. 왼쪽 측면 부위의 피부를 면도하고 포비도 요오드 용액으로 살균하십시오.
4. 피부의 면도 부위에 가로 절개를 합니다.
5. 비장을 노출하는 각층에서 1-2cm 잘라합니다.
6. 복막의 비장을 부드럽게 꺼내 두 개의 촉촉한 면 팁의 도움으로 들어 올립니다.
7. 세포(동물당 전형적으로^107)를 29 G 바늘로 1 mL 인슐린 주사기에 50 μL IMDM 매체에 이식하도록 유지한다.
8. 부드럽게 비장 피질에 바늘을 관통하고 2-3 분 이내에 비장으로 세포 현탁액을 해제.
9. 세포 이식이 완료된 후 조심스럽게 바늘을 꺼내 면 팁으로 바늘 구멍을 두드려 부위에서 세포 현탁액이 누출되는 것을 방지하십시오.
10. 연속 및 불연속 봉합과 4-0 흡수 봉합사에 의해 각막과 피부를 닫습니다.
11. 수술 부위의 감염을 방지하기 위해 봉합사 대신 피부에 포비돈의 요오드 용액을 바르고 있습니다.
12. 복강 내 항생제 (예 : cefotaxime) 용액의 1 mL 부피를 주입하고 피하 진통제 (예 : 멜록시캄) 1 mg / kg 체중을 수술 후 치료의 일환으로 동물에게 주입합니다. 동물을 따뜻한 회복 케이지로 옮김을 옮니다.
13. 수술 상처가 완전히 치유 될 때까지 12 시간 빛 / 어두운 주기의 정상적인 조건에서 수술 동물을 격리 상태로 유지하십시오. 이 데 3-4 일이 걸릴 수 있습니다.

7. ALF 개발의 특성화

1. APAP 치료의^2nd 투여 후 케타민 자일라진 용액 2 시간의 과다 복용에 의해 동물을 안락사시키고 혈액 및 조직 샘플을 수집합니다.
2. 생화학 연구를 위해 혈액에서 혈청을 수집^32.
3. 조직학 및 유전자 발현 연구를 위한 간 조직 샘플을^{처리하는 33,34,35.}

결과

ALF의 동물 모델에서 생존 율
70% PHx와 함께 ALF를 유발하는 APAP의 최적 용량은 750 mg/kg 체중으로 표준화되었다. 치료 요법 시작 24 시간 후 70% PHx, 때 동물 완전히 수술에서 회복 했다, 그리고 24 시간 간격에 두 개의 APAP 복용량으로 구성. 사망률은 APAP의 두 번째 투여 후 80%의 비율로 관찰되었고, 48시간 수술 후. 생존율을 카플란-마이어 방법을 통해 분석하고 플롯하였다(도

토론

ALF에 적합한 동물 모델의 개발은 ALF의 병인과 진행을 더 잘 이해하기 위해 가장 중요합니다. 잘 특성화 된 ALF 동물 모델은 또한 ALF에 대한 새로운 치료 접근법의 개발 및 시험을위한 기회를 제공합니다. ALF^{6,12,21, 23,46,47,48의}임상적?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen (Biocetamol)	EG Pharmaceuticals		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution)	Win-Medicare; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet (Class I)	Kartos international; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
Cefotaxime (Taxim®)	AlKem; India		cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer	Sigma; US	CLS431752
Collagenase Type I	Gibco by Life Technologies	17100-017
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Drape Sheet	JSD Surgicals, Delhi, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant	Sigma; US	6522
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma; US	HT110132
Forceps	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Glucose	Himedia, India	GRM077
Hair removing cream (Veet®)	Reckitt Benckiser, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma; US	MHS16
Heparin sodium salt	Himedia; India	RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes	Sigma; US	H6254
I.V. Cannula (Plusflon)	Mediplus, India	Ref 1732411420
Insulin Syringes	BD; US	REF 303060
Isoflurane (Forane®)	Asecia Queenborough	No B506	Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax®)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex®)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight & curved	Mercian; England	BS-13-8
Micro needle holders straight & curved	Mercian; England	BS-13-8
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Nylon Thread	Mighty; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Percoll®	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India	P3060	No specific Catalog Number
RPMI	Himedia; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation; US		No specific Catalog Number
Sucrose	Sigma; US	S0389
Surgical Blade No. 22	La Medcare, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board	Locally made		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape	3M India; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Sutures	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
Syringes (1ml, 26 G)	Dispo Van; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper)	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine	Braun		No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media	Himedia; India	AT125
Xylazine (Xylaxin®)	Indian Immunologicals Limited		Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant