癌治療のための細胞傷害性サイトカイン誘発キラーT細胞の分離と拡張

要約

ここでは、末梢血単核細胞由来のサイトカイン誘導CD3+CD56+キラー細胞の単離・増殖を行うプロトコルを提示し、インビトロ診断フローサイトメトリーシステムを用いて血液学的および固形癌細胞に対する細胞毒性効果を示す。

要約

養子細胞免疫療法は、免疫系を介して癌の認識を回復することに焦点を当て、効果的な腫瘍細胞死滅を改善する。サイトカイン誘発キラー(CIK)T細胞療法は、癌細胞に対して顕著な細胞毒性作用を及ぼし、癌治療における手術、放射線および化学療法の悪影響を軽減することが報告されている。CIKは末梢血単核細胞(PBMC)、骨髄、臍帯血から誘導することができる。CIK細胞は、CD3+ CD56⁺および自然殺し (NK) 主要な組織適合性複合体 (MHC) 制限のない抗腫瘍活性を含む発現特性を有するT細胞の不均質な亜集団である。本研究は、PBMC由来CIK細胞の細胞分解能力を血球学的および固形癌細胞に対する定量化のための修飾された、臨床的に適用可能なフローサイトメトリーベースの方法について説明する。細胞分解アッセイでは、CIK細胞は、前染色された標的腫瘍細胞との異なる比率で共培養される。インキュベーション期間後、標的細胞数は、死細胞を検出する核酸結合染色によって決定される。この方法は、研究アプリケーションと診断アプリケーションの両方に適用できます。CIK細胞は、細胞計のセットアップとトラッキング(CS&T)ベースのフローサイトメトリーシステムによる前臨床評価で、がん治療の代替戦略として探求できる強力な細胞毒性を有しています。

概要

細胞傷害性Tリンパ球は、癌に対する免疫応答を媒介する特異的な免疫エフェクター細胞集団である。いくつかのエフェクター細胞群は、リンパ球活性化キラー(LAK)細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TILs)、ナチュラルキラー(NK)細胞、γδT細胞、およびサイトカイン誘発キラー(CIK)細胞を含む、養子T細胞療法(ACT)の目的のために開発^された。CIK細胞に対する関心が高まっているのは、サイトカイン誘発細胞傷害性細胞集団の混合物を表すため、自己性末梢血単核細胞(PMBC)2から拡大される。

リンパ系前駆細胞、骨髄芽細胞、リンパ芽細胞の制御不能な増殖は、3種類の血液癌(白血病、リンパ腫、骨髄腫)、癌腫を含む固形腫瘍(例えば、肺癌、胃癌、子宮頸癌)、および肉腫の³つの主要なタイプにつながる。CIK細胞は、広範囲の主要組織適合性複合体(MHC)-無制限の抗腫瘍活性を示す細胞集団の混合物であり、したがって、造馬学および進行性腫瘍^{4、5、6、7}の治療のための約束を保持する。CIK細胞は、T細胞(CD3⁺CD56^-)、NK-T細胞(CD3⁺CD56^+)、およびNK細胞(CD3^–CD56⁺⁾を含む細胞の組み合わせを含む。IFN-γ、抗CD3抗体、およびIL-2の添加のための固定スケジュールを用いてCIK誘導プロトコルの最適化は、CIK細胞⁸の拡張をもたらす。癌細胞に対するCIK細胞の細胞傷害性は、主にNK群2のメンバーD(C型レクチン様受容体ファミリーのメンバー)の腫瘍細胞上のNKG2Dリガンドの関与に依存し、そしてパーフォリン媒介経路⁹に依存する。前臨床試験の結果、IL-15刺激CIK細胞がインビトロで一次および急性骨髄性白血病細胞株に対して強力な細胞毒性を誘導し、正常PBMCおよび線維芽細胞⁹に対して低い刺激性を示したことが明らかになった。最近、第II相臨床試験における骨髄性新生物治療のための非骨髄異系移植に続く統合として、1回限りの健康ドナー由来CIK(1x 10^8/kgCD3+細胞)の注入の結果^{が発表された}。

本研究では、CIK産生を増加させる造血細胞培地にIFN-γ、IL-1α、抗CD3抗体、IL-2を添加した最適化細胞培養式を開発し、ヒト慢性に対するCIK細胞の細胞傷害作用を調べた。骨髄性白血病(K562)細胞および卵巣癌(OC-3)細胞。

プロトコル

臨床プロトコルは、中国医科大学および病院研究倫理委員会の機関審査委員会のガイドラインに従って実施され、承認されました。末梢血標本は、彼らのインフォームド・コンセントを持って健康なボランティアから採取された。

1. 材料の調製

1. 物質安全データシート(MSDS)に示すように、試薬、抗体、および化学物質を保存する。ストック溶液として薬剤またはサイトカインを溶媒に溶解し、-20°Cまたは-80°Cで保存するためにアリコートを使用します。
   注: 材料準備の詳細については、資料表に記載されています。

2. PBMCの分離

1. 使用前に密度勾配溶液(材料表)を18~20°Cに温めます。溶液ボトルを数回反転させ、完全な混合を確実にします。
2. ヘパリンバイアルで3-5 mLのヒト静脈血球試料を集め、チューブを数回穏やかに反転させることでよく混ぜます。
3. 15 mLの滅菌チューブに4mLの密度勾配溶液を調製します。
4. 血液サンプルの1mLを密度勾配溶液に慎重に重層する。
5. 18-20 °Cで30分間400 x gで遠心分離します(休憩をオフにします)。
6. 1mLの無菌ピペットを用いて、単核細胞(約1mL)のバフィーコート層を注意深く、すぐに吸引し、1mLの無菌ピペットを用いて無菌15mLチューブに層を乱さないようにする。
7. 遠心管のバフィーコートに少なくとも3巻のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加える。滅菌ピペットで少なくとも3倍上下に穏やかにピペットを入れて細胞を吊り下げます。
8. 18-20 °Cで10分間400 x gで遠心分離。上清を吸引する。
9. 5 mLの基底培地(材料表)で細胞ペレットを懸濁し、フラスコに移します。細胞を培養した細胞培養インキュベーターで37°Cおよび5%CO2で培養する。

3. CIKの誘導と拡張

1. 日目に、PBMC(1 x¹⁰⁶⁾を、37°Cおよび5%CO2で加湿した細胞培養インキュベーターで24時間IFN-γの1,000 IU/mLを含む新鮮な基礎培地で培養する。
2. 1日目に、抗CD3抗体50ng/mL、rh IL-1αの1ng/mL、およびrh IL-2の1,000 U/mLを含む新鮮な基底培地で培地をリフレッシュします。3 日ごとにメディアを更新します。
3. 7日目に、rh IL-2の1,000 U/mLを含む新鮮な基底媒体で培地をリフレッシュします。セルの拡張が終了するまで、3 日ごとにメディアを更新します (14 日目)。

4. CIK細胞の評価のための免疫フェノタイピング

1. 10 mLの無菌PBSでCIK細胞を洗浄します。300×gおよび18-20°Cで10分間遠心分離し、上清を吸引し、10 mLのPBSで細胞を再懸濁した。トリパンブルー除外アッセイを用いて、細胞番号と試験細胞の生存率をカウントします。
2. CIK細胞を6つの無菌1.5 mLチューブに~5~10~10 x 10⁵セル/mL PBSの密度でアリコートします。ラベルと治療は次のとおりです: チューブ1、ブランク(抗体なし);チューブ 2、アイソタイプ IgG1-FITC の 20 μL を追加します。チューブ 3、アイソタイプ IgG1-APC mAbs の 20 μL を追加します。チューブ 4、CD3-FITC の 20 μL を追加します。チューブ 5、CD56-APC mAbs の 20 μL を追加します。チューブ6、CD3-FITCの20 μLとCD56-APC mAbsの20 μLを追加します。
3. CIK細胞と抗体を軽く混合し、少なくとも3倍の上と下に1mLの滅菌ピペットを軽くピペットで入れ、暗闇の中で室温で30分間インキュベートします。
4. 300 x gおよび 18-20 °C で 10 分間チューブを遠心分離します。上清を吸引し、1 mLのPBSで細胞ペレットを1回懸濁させる。1 mL滅菌ピペットで少なくとも3倍上下に軽くピップします。
5. 手順 4.4 を繰り返します。
6. フローサイトメトリの解析前に、暗い部分にチューブを残します。

5. CDマーカー認識

1. セル懸濁液を、キャップを通して穏やかにピペットでセルストレーナーキャップ(100 μmメッシュ)で滅菌5 mLポリスチレン丸底管に移します。カルーセルにチューブを順番に置きます。
2. フローサイトメトリー解析ソフトウェアを開き、実験用フォルダを作成します。[新しい標本]ボタンをクリックして、試験体とチューブを実験に追加し、チューブに「チューブ 1、ブランク」と名前を付けます。チューブ 2、 アイソタイプ IgG1-CD3;チューブ 3、 アイソタイプ IgG1-CD56;チューブ4、CD3;チューブ5、CD56;チューブ6、CD3CD56。
3. CIK 細胞集団の散布体系を作成します (図 2A)。
   1. チューブ 1 (空白) を選択し、[ドット プロット] ボタンをクリックして FSC-A/SSC-A プロットを作成します。FSC-A しきい値が > 5 x 10⁴のセル全体に長方形ゲートを描画して、セルの破片を除外します。
   2. 新しいドット プロットのSSC-A/SSC-Hパラメータを選択し、すべての単一セルの周囲にポリゴン ゲートを描画します。新しいヒストグラム プロットのカウント/FITC (CD3)およびカウント/APC (CD56)パラメータをそれぞれ選択します。新しいドット プロットのFITC (CD3)/APC (CD56)パラメータを選択し、4 つの象限ゲートを描画して 4 つのサブ母集団を定義します。
   3. 各標本の20,000個の単一細胞からのデータを記録します。[サンプルの読み込み] ボタンをクリックして、最初に [空のコントロール] サンプルを分析します。CD56 および CD3 チャネル パラメータを使用して、CIK セル全体を識別します。
4. すべての検体の調査のためにステップ5.3を繰り返します。
5. 個々の標本の統計値を含むファイルを開いて、CIK細胞集団を分析し、それらを分析ファイルに再印刷します。

6. ヒト慢性骨髄性白血病K562細胞および卵巣癌OC-3細胞の培養および染色

1. K562細胞
   1. 完全培地中のK562細胞(10%胎児ウシ血清[FBS]と50 U/mL抗生物質を含むRPMI基底培地および50U/mL抗生物質を含み、グルコースを4.5g/Lに調整する)を細胞培養フラスコで0.5〜1 x 10⁶細胞/mLの密度で培養し、37°Cおよび_5%の加湿インキュベーターでインキュベートする。
   2. K562細胞を含む培養培地を50 mL滅菌チューブに移し、実験当日18-20°Cで10分間300xgで細胞をペレットします。
   3. 上清を吸引し、5 mLの無菌PBSに細胞を再懸濁し、優しく混ぜ合わせます。
   4. 細胞を300xgで10分間ペレットにし、上清を吸引し、PBSで細胞を再懸濁し、K562細胞を濃度0.5-1 x 10^6細胞/mLに調整した。
   5. CfSE色素の0.5 μLを、最終濃度5μMの15mLの滅菌管にK562細胞懸濁液1mLを加えます。少なくとも3倍上下にピペットでサスペンションを軽く混ぜます。
   6. チューブを細胞培養インキュベーターの37°Cと5%のCO2(10~15分)に放置します。
   7. チューブに9 mLのPBSを加え、細胞を300 x gで10分間ペレットにし、上清をデカントし、10 mLの完全な培地で細胞ペレットを懸濁させます。細胞懸濁液を細胞培養フラスコに移し、インキュベーター内に置く。
2. OC-3細胞
   1. 完全培地(10%FBSおよび50 U/mL抗生物質を含むDMEM/F12培地)でOC-3細胞を培養し、37°Cおよび5%CO2の細胞培養フラスコ内の0.5〜1 x 10⁶細胞の密度で。
   2. 培養培地を吸引し、実験の1日前にPBSで細胞を洗浄した。
   3. 細胞解離酵素溶液(材料表)を1mL添加して細胞を切り離し、37°Cで5分間インキュベートする。
   4. 5 mLのPBSを加えて細胞を懸濁させ、優しく混ぜ合わせます。細胞を300 x gで10分間ペレットし、上清を吸引する。PBSで細胞を再懸濁し、細胞を0.5~1 x 10⁶細胞/mLの濃度に調整します。
   5. CFSE色素0.5μLを、最終濃度5μMの15mLの滅菌管にOC-3細胞懸濁液の1mLに添加します。少なくとも3倍上下にピペットでサスペンションを軽く混ぜます。
   6. チューブを細胞培養インキュベーターの37°Cと5%のCO2(10~15分)に放置します。
   7. チューブに9 mLのPBSを加え、細胞を300 x gで10分間ペレットにし、上清をデカントし、完全な培地で細胞ペレットを懸濁させます。種5 x 10⁵細胞/ウェルを6ウェルプレートに入れ、37°Cおよび5%CO2で一晩加湿インキュベーターでインキュベートした。

7. 細胞傷害性アッセイ

1. CIK細胞とK562細胞のコカルチャー(CIK-K562)
   1. ステップ6.1.7からK562細胞を数え、トリパンブルー排除アッセイによって細胞の生存率を試験する。5 x 10⁵/mLの密度で6ウェルプレートに各ウェルにK562細胞の1 mLを加えます。
   2. ステップ3.4から6ウェルプレートまでのCIK細胞の有無に関わらず1mLをステップ7.1.1から次のように加える:ウェル1=ブランク、K562細胞単独(5 x^105);ウェル 2 = CFSE 染色 K562 細胞単独 (5 x 10^5);ウェル 3 = CIK 細胞 (E [エフェクター], 25 x 10⁵⁾+ CFSE 染色 K562 セル (T [ターゲット], 5 x 10^5);ウェル 4 = CIK 細胞 (E, 50 x 10⁵⁾+ CFSE 染色 K562 セル (T, 5 x 10⁵)。
   3. 細胞懸濁液を少なくとも3倍上下に軽くピペットで混ぜます。プレートをインキュベーターに24時間入れる。
2. CIK細胞とOC-3細胞のコカルチャー(CIK-OC-3)
   1. ステップ3.4から6ウェルプレートまでのCIK細胞の有無に関わらず1mLを加えるステップ6.2.7から:ウェル1=ブランク、OC-3細胞単独(5 x^105);ウェル 2 = CFSE 染色 OC-3 細胞単独 (5 x 10^5);ウェル 3 = CIK 細胞 (E, 25 x 10⁵⁾+ CFSE 染色 OC-3 細胞 (T, 5 x 10^5);ウェル 4 = CIK 細胞 (E, 50 x 10⁵⁾+ CFSE 染色 OC-3 細胞 (T, 5 x 10⁵)。
   2. 細胞懸濁液を少なくとも3倍上下に軽くピペットで混ぜます。プレートをインキュベーターに24時間入れます。
3. 7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)染色
   1. ステップ 7.1.3 から CIK-K562 セル懸濁液を 15 mL の滅菌チューブに直接収穫します。
   2. ステップ 7.2.2 から CIK-OC-3 グループから懸濁液と接着細胞の両方を収穫します。
      1. 細胞懸濁液を15mLの無菌チューブに移します。1 mLの無菌PBSでウェルを洗浄し、PBSを回収し、チューブに加えます。0.5 mLの細胞解離酵素溶液を加え、37°Cで5分間インキュベートします。
      2. 同じチューブから1 mLの溶液を対応するウェルに加え、少なくとも3倍の上と下に1mLの滅菌ピペットでピペットを入れて細胞を穏やかに混ぜます。同じチューブ内のすべての細胞を収集します。
   3. 300xgで10分間遠心分離し、上清を吸引し、無菌PBSの1 mLで細胞を再懸濁する。300 x gで細胞を10分間ペレットし、上清を吸引し、100 μLの無菌PBSで細胞を再懸濁した。
   4. 細胞懸濁液に7-AAD色素(50ng/μLストック)を5μL添加します。少なくとも3倍の上と下に1mLの滅菌ピペットを入れて細胞をそっと混ぜます。10分間インキュベートし、分析前に暗闇の中に残します。
4. 細胞分解能アッセイ
   1. ステップ7.3.4から細胞懸濁液を混合し、ステップ5.1と5.2を1回繰り返します。
   2. [新しい標本]ボタンをクリックして試験体とチューブを実験に追加し、チューブにチューブ1、K562(またはOC-3)セルのみという名前を付けます。チューブ2、CFSE染色K562(またはOC-3)細胞のみ;チューブ 3、E:T = 5:1;チューブ 4、E:T = 10:1。
   3. 細胞分解アッセイ用の散乱合合法システムを作成します (図3A)。
      1. チューブ 1 を選択し、[ドット プロット]ボタンをクリックして FSC-A/SSC-A プロットを作成します。FSC-A しきい値が >5 x 10⁴のイベントに長方形ゲートを描画して、セルの破片を除外します。
      2. 新しいドットプロットのSSC-A/CFSEパラメータを選択します。新しいドット プロットの7-AAD/CFSEパラメータを選択し、4 つの象限ゲートを描画して 4 つのサブ Population を定義します。
      3. [サンプルの読み込み] ボタンをクリックして、最初に空のコントロール サンプルを分析します。
      4. SSC-AおよびFSC-Aの電圧を調整します。CFSE および 7-AAD チャネル パラメーターを使用して、デッド セルの作成を識別します。各標本の>20,000 CFSE⁺細胞からのデータを記録します。
   4. すべての標本の調査のためにセクション7.4.6を繰り返します。
   5. 個々の標本の統計値を含むファイルを開き、生存不可能な細胞集団を分析し、データを分析ファイルにエクスポートします。

結果

本プロトコルの目的は、サイトカイン誘導キラー(CIK)T細胞を末梢血単球から分離・拡張し、血液学的悪性度および固形癌細胞に対するCIKの細胞毒性効果を評価することにある。CIKの誘導は、CD3/CD56認識によって同定された。図 1A は、CIK の誘導と拡張のプロトコルを示しています。健常ドナー由来の^CD3+CD56+T細胞の亜集団を分析するためのガ?...

ディスカッション

記載された方法は、健康なドナーの全血サンプルからの細胞傷害性サイトカイン誘発キラー(CIK)T細胞の分離および拡張のための迅速で便利で信頼性の高いプロトコルである。また、フローサイトメトリーのセットアップおよびトラッキング(CS&T)システムを用いた白血病(K562)および卵巣癌細胞(OC-3)に対するCIKの細胞傷害作用も示す。CIK細胞は、GMPグレードのサイトカインおよび無血清培地をさ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Amino Actinomycin D	BD	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody	BD	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD	338962
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	BD	565082
D-(+)-Glucose solution	SIGMA	G8644
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody	BD	555332	UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555748	MOPC-21
Human anti-CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Proleukin	NOVARTIS
Recombinant Human Interferon-gamma	CellGenix	1425-050
Recombinant Human Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A
RPMI1640 medium	Gibco	11875-085
Sigma 3-18K Centrifuge	Sigma	10295
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028
X-VIVO 15 medium	Lonza	04-418Q