JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для выполнения изоляции и расширения периферической крови моноядерных клеток, полученных цитокиновых CD3cd56- клетки-убийцы и иллюстрируем их цитотоксический эффект против гематологических и твердых раковых клеток с помощью системы цитометрии в пробирке диагностики.

Аннотация

Приемная клеточная иммунотерапия фокусируется на восстановлении распознавания рака через иммунную систему и улучшает эффективное убийство опухолевых клеток. Цитокин индуцированных убийца (CIK) Т-клеточная терапия, как сообщается, оказывают значительное цитотоксиче эффекты против раковых клеток и уменьшить неблагоприятные последствия хирургии, радиации и химиотерапии в лечении рака. CIK может быть получен из периферических моноядерных клеток крови (ПБМК), костного мозга и пуповинной крови. Клетки CIK представляют собой разнородную субпопуляцию Т-клеток с CD3иCD56 и природными фенотипическими характеристиками убийцы (NK), которые включают в себя основные комплексы гистосовместимости (MHC)-неограниченной противоопухолевой активности. Это исследование описывает квалифицированный, клинически применимый, поток цитометрии на основе метода для количественной цитолической способности ПБМК полученных клеток CIK против гематологических и твердых раковых клеток. В цитолическом анализе, клетки CIK совместно инкубируются в различных соотношениях с заранее целевыми опухолевыми клетками. После инкубационного периода, количество клеток-мишеней определяется нуклеиновой кислотой-связывающей пятно для обнаружения мертвых клеток. Этот метод применим как к исследованиям, так и к диагностическим приложениям. Клетки CIK обладают мощной цитотоксичностью, которая может быть изучена в качестве альтернативной стратегии для лечения рака после его доклинической оценки с помощью установки цитометра и отслеживания (CS и T) на основе цитометрии потока системы.

Введение

Цитотоксические Т-лимфоциты являются специфической популяцией клеток иммунного эффектора, которая опосредует иммунные реакции против рака. Несколько популяций эпреторных клеток, включая лимфокин-активированный убийца (LAK) клетки, опухолевые лимфоциты (TILs), естественные клетки убийцы (НК), Т-клетки, и цитокин-индуцированных убийца (CIK) клетки были разработаны для приемной Т-клеточной терапии (ACT) целей1. Существует растущий интерес к клеткам CIK, потому что они представляют собой смесь цитокинов индуцированных цитотоксических клеток населения расширена от аутологичных периферических клеток крови (PMBCs)2.

Неконтролируемый рост клеток-прародителей лимфоидов, миелобластов и лимфобластов приводит к трем основным видам рака крови (например, лейкемии, лимфомы и миеломы), твердых опухолей, включая рак , рак легких, рак желудка, рак шейки матки) и саркомы, среди других видов рака3. Клетки CIK представляют собой смесь клеточных популяций, которые демонстрируют широкий спектр основных комплекс гистосовместимости (MHC)-неограниченной противоопухолевой активности и, таким образом, держать обещание для лечения гематологических и передовых опухолей4,5,6,7. Клетки CIK состоят из комбинации ячеек, в том числе Т-клеток (CD3иCD56),НК-Т-клеток (CD3иCD56)и НК-клеток (CD3-CD56). Оптимизация протокола индукции CIK с использованием фиксированного графика для добавления IFN-З, анти-CD3 антител и IL-2, приводит к расширению ciK-клеток8. Цитотоксические возможности клеток CIK против раковых клеток в основном зависит от участия НК группы 2 член D (член C-типа лектин-подобных рецепторов семьи) NKG2D лиганды на опухолевые клетки, и на перфорин-опосредованных путей9. Результаты доклинического исследования показали, что IL-15-стимулировали клетки CIK индуцированной мощной цитотоксичности против первичной и острой миелоидной лейкемии клеточных линий в пробирке и выставлены более низкую алореактивность против нормальных ПБМК и фибробластов9. В последнее время, результат ы одноразовый здоровый донора полученных CIK (1 х 108/ кг CD3- клетки) инфузии, как консолидация после немиелоаблятивной аллогенной трансплантации для лечения миелоидных неоплазм в фазе II клинического исследования было опубликовано10.

В настоящем исследовании мы разработали оптимизированную формулу культуры клеток, состоящую из IFN-Я, IL-1, антител анти-CD3 и IL-2, добавленных в гематопоиетическую среду для увеличения производства CIK, и исследовали цитотоксический эффект клеток CIK против хронических человеческих миелоидный лейкоз (K562) клетки рака яичников (OC-3) клеток.

протокол

Клинический протокол был выполнен и утвержден в соответствии с руководящими принципами Институционального наблюдательного совета Китайского медицинского университета и Комитета по этике исследований больниц. Образцы периферийной крови были собраны у здоровых добровольцев с их информированного согласия.

1. Подготовка материалов

  1. Храните реагенты, антитела и химические вещества, как показано на листе данных о материальной безопасности (MSDS). Растворите препараты или цитокины в растворителях в качестве стоковых растворов, а затем аликвот для хранения при -20 градусах или -80 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация для подготовкиматериала отмечена в таблице материалов .

2. Изоляция PBMC

  1. Разогрейте градиентный раствор плотности(Таблица материалов) до 18-20 градусов по Цельсию перед использованием. Несколько раз переворачивайте бутылку раствора, чтобы обеспечить тщательное смешивание.
  2. Соберите 3'5 мл образца венозной крови человека в гепаринилном флаконе и хорошо перемешайте, несколько раз аккуратно инвертируя трубку.
  3. Приготовьте 4 мл градиентного раствора плотности в стерильной трубке 15 мл.
  4. Тщательно прокладывайте 1 мл образца крови на градиентный раствор плотности.
  5. Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин при 18–20 градусах по Цельсию (выключите перерыв).
  6. Тщательно и сразу же аспирировать буйный слой пальто моноядерных клеток (около 1 мл) сразу, чтобы избежать нарушения слоев стерильной трубки 15 мл с помощью 1 мл стерильной пипетки.
  7. Добавьте не менее 3 томов (3 мл) фосфатно-буферного сосудистого раствора (PBS) в буйный слой в центрифуге трубки. Приостановить клетки, аккуратно pipetting их вверх и вниз, по крайней мере 3x со стерильной пипеткой.
  8. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин при 18-20 градусах По Цельсию. Аспирируй супернатанта.
  9. Приостановить клетку гранулы с 5 мл базальной среды (Таблица материалов) и передать в колбу. Культура клеток в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах По цельсии и 5% CO2.

3. Индукция и расширение CIK

  1. На день 0, культура PBMCs (1 х 106) в свежей базальной среде, содержащей 1000 МЕ /мл IFN-я для 24 ч в увлажненных инкубатор культуры клеток на 37 C и 5% CO2.
  2. На 1-й день освежите среду со свежей базальной средой, содержащей 50 нг/мл анти-CD3 антител, 1 нг/мл rh IL-1 и 1000 U/mL rh IL-2. Освежать среду каждые 3 дня.
  3. На 7-й день освежите среду со свежей базальной средой, содержащей 1000 U/mL rh IL-2. Освежать среду каждые 3 дня до конца расширения клеток (День 14).

4. Иммунофенотипирование для оценки клеток CIK

  1. Вымойте клетки CIK с 10 мл стерильных PBS. Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г и 18-20 градусов по Цельсию, аспирируй супернатант и resuspend клетки с 10 мл PBS. Подсчитайте номер ячейки и жизнеспособность ячейки теста, используя анализ исключения trypan blue.
  2. Aliquot клетки CIK в шесть стерильных труб 1,5 мл при плотности 5-10 х 105 клеток / мл PBS. Этикетка и лечить следующим образом: Труба 1, Пустой (без антитела); Трубка 2, добавьте 20 зл изотипа IgG1-FITC; Трубка 3, добавить 20 зл изотипов IgG1-APC mAbs; Трубка 4, добавить 20 зл CD3-FITC; Трубка 5, добавить 20 зл и d56-APC mAbs; и трубка 6, добавить 20 зл CD3-FITC и 20 Зл CD56-APC mAbs.
  3. Аккуратно перемешайте клетки CIK с антителами, аккуратно пайпетируя их вверх и вниз, по крайней мере 3x с 1 мл стерильной пипетки, а затем инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
  4. Центрифуга трубки в течение 10 мин при 300 х г и 18-20 градусов по Цельсию. Аспирируйте супернатант и приостанавливаете клетку гранулы один раз с 1 мл PBS. Аккуратно пайпет их вверх и вниз, по крайней мере 3x с 1 мл стерильной пипетки.
  5. Повторите шаг 4.4.
  6. Оставьте трубки в темноте перед циклометрическим анализом потока.

5. Распознавание маркеров CD

  1. Перенесите суспензию клетки в стерильную 5 мл полистирола круглой нижней трубки с крышкой ситечко (100 мкм сетки) путем мягкого трубачерез через крышку. Поставьте трубки на карусель в порядок.
  2. Откройте программное обеспечение для анализа цитометрии потока и создайте экспериментальную папку. Нажмите кнопку New Specimen, чтобы добавить образец и трубку к эксперименту и назвать трубы следующим образом: Tube 1, Blank; Трубка 2, Изотип IgG1-CD3; Трубка 3, Изотип IgG1-CD56; Трубка 4, CD3; Трубка 5, CD56; Трубка 6, CD3CD56.
  3. Создайте систему рассеяния gating для популяций клеток CIK(Рисунок 2A).
    1. Выберите трубку 1 (Blank) и нажмите на кнопку Dot Plot, чтобы создать участок FSC-A/SSC-A. Нарисуйте прямоугольник ворота над всей популяции клеток с FSC-A порога йgt;5 х 104, чтобы исключить мусор ауда.
    2. Выберите параметр SSC-A/SSC-H для нового точечного участка и нарисуйте многоугольные ворота вокруг всех одиночных ячеек. Выберите параметр Count/FITC (CD3) и Count/APC (CD56) для нового сюжета гистограммы соответственно. Выберите параметр FITC (CD3)/APC (CD56) для нового точечного участка и нарисуйте четыре квадранта для определения четырех субпопуляций.
    3. Запишите данные из 20 000 одиночных ячеек в каждом образце. Нажмите кнопку Load Sample, чтобы сначала проанализировать образец элемента управления Blank. Определите всю популяцию клеток CIK с помощью параметров канала CD56 и CD3.
  4. Повторите шаг 5.3 для исследования всех образцов.
  5. Откройте файлы, содержащие статистические значения отдельного образца, для анализа популяций клеток CIK и перепечатки их в файлы анализа.

6. Культирование и окрашивание хронических миелоидных клеток K562 и клеток рака яичников OC-3

  1. Клетки K562
    1. Культура K562 клеток в полных носителях (RPMI базальной среде, содержащей 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS) и 50 U/mL антибиотики и настроить глюкозу до 4,5 г/л) при плотности 0,5 х 1 х 106 клеток / мл в колбу клеточной культуры и инкубировать в увлажненный инкубатор при 37 "C и 5% CO2.
    2. Перенесите культурные носители, содержащие клетки K562, в стерильные трубки 50 мл и гранулируйте клетки при 300 х г в течение 10 минут при 18–20 градусах По Цельсию в день эксперимента.
    3. Аспирируйте супернатант, resuspend клетки в 5 мл стерильных PBS, и хорошо перемешать осторожно.
    4. Пеллет клетки на 300 х г в течение 10 мин. Аспирировать супернатант, resuspend клетки в PBS, и настроить K562 клеток до концентрации 0,5-1 х 106 клеток / мл.
    5. Добавьте 0,5 л красителя CFSE к 1 мл суспензии клеток K562 в стерильной трубке 15 мл при конечной концентрации 5 мкм. Аккуратно перемешать подвеску, пипетка вверх и вниз, по крайней мере 3x.
    6. Оставьте трубку в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в течение 10-15 мин.
    7. Добавьте 9 мл PBS в трубку и гранулы клетки на 300 х г в течение 10 мин. Декант супернатант, а затем приостановить клеточной гранулы в 10 мл полных носителей. Перенесите суспензию клетки в колбу клеточной культуры и поместите в инкубатор.
  2. Oc-3 клетки
    1. Культура OC-3 клеток в полных носителях (DMEM/ F12 среды, содержащей 10% FBS и 50 U/mL антибиотики) при плотности 0,5-1 х 106 клеток в колбе клеточной культуры на 37 C и 5% CO2.
    2. Аспирируйте культурные носители и мойте клетки PBS за 1 день до начала эксперимента.
    3. Отсоедините клетки, добавив 1 мл клеточного ферментного раствора(Таблица материалов)и инкубировать в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия.
    4. Приостановить клетки, добавив 5 мл PBS и хорошо перемешать осторожно. Пелле клетки на 300 х г в течение 10 минут и аспирации супернатант. Приостановите работу клеток в PBS и настроить клетки до концентрации 0,5-1 х 106 клеток / мл.
    5. Добавьте 0,5 л красителя CFSE к 1 мл клеточной подвески OC-3 в стерильной трубке 15 мл при конечной концентрации 5 мкм. Аккуратно перемешать подвеску, пипетка вверх и вниз, по крайней мере 3x.
    6. Оставьте трубку в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в течение 10-15 мин.
    7. Добавьте 9 мл PBS в трубку и гранулы клетки на 300 х г в течение 10 мин. Декант супернатант, а затем приостановить клеточной гранулы с полным испытуемым. Семена 5 х 105 клеток / хорошо в 6 хорошо пластины и инкубировать в увлажненный инкубатор при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 ночь.

7. Цитотоксический ассссе

  1. Кокультура клеток CIK и K562 (CIK-K562)
    1. Подсчитайте клетки K562 со ступени 6.1.7 и проверьте жизнеспособность клетки, происните синий анализ исключения. Добавьте 1 мл клеток K562 к каждой скважине в6 скважине при плотности 5 х 10 5/мл.
    2. Добавить 1 мл базальной среды с или без клеток CIK от шага 3,4 до 6 хорошо пластины от шага 7.1.1 следующим образом: Ну 1 - Пустой, K562 клетки в одиночку (5 х 105); Ну 2 - CFSE окрашенных K562 клетки в одиночку (5 х 105); Ну 3 - клетки CIK (E (эффектор), 25 x 105) - окрашенные CFSE клетки K562 (T «цель», 5 x 105); Ну 4 - клетки CIK (E, 50 x 105)
    3. Смешайте клеточные суспензии, аккуратно пайпетируя их вверх и вниз, по крайней мере 3x. Поместите тарелку в инкубатор на 24 ч.
  2. Кокультура клеток CIK и OC-3 (CIK-OC-3)
    1. Добавить 1 мл базальной среды с или без клеток CIK от шага 3,4 до 6 хорошо пластины от шага 6.2.7 следующим образом: Ну 1 - Пустой, OC-3 клетки в одиночку (5 х 105); Ну 2 - CFSE окрашенных OC-3 клетки в одиночку (5 х 105); Ну 3 - клетки CIK (E, 25 x 105)- CFSE-окрашенные OC-3 клетки (T, 5 x 105); Ну 4 - клетки CIK (E, 50 x 105)- CFSE-окрашенные OC-3 клетки (T, 5 x 105).
    2. Смешайте клеточные суспензии, аккуратно пайпетируя их вверх и вниз, по крайней мере 3x. Положите тарелку в инкубатор на 24 ч.
  3. 7-Аминоактиномицин D (7-AAD) окрашивание красителя
    1. Урожай CIK-K562 подвески ячейки от шага 7.1.3 непосредственно в 15 мл стерильной трубки.
    2. Урожай как подвески и адептов клетки из группы CIK-OC-3 от шага 7.2.2.
      1. Перенесите суспензию клетки в стерильную трубку 15 мл. Вымойте колодец с 1 мл стерильных PBS, собирать PBS, и добавить в трубку. Добавьте 0,5 мл раствора фермента диссоциации клеток и инкубируют в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия.
      2. Добавьте 1 мл раствора из той же трубки в соответствующую скважину и аккуратно перемешайте клетки, пополнив их вверх и вниз по крайней мере 3x с 1 мл стерильной пипетки. Соберите все клетки в одной трубке.
    3. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин, аспирируй супернатант и resuspend клетки в 1 мл стерильных PBS. Пеллет клетки на 300 х г в течение 10 минут, аспирации супернатант, и resuspend клеток в 100 л стерильных PBS.
    4. Добавьте в клеточный суспензию 5 кЛ 7-AAD красителя (50 нг/Л. Аккуратно перемешать клетки, пипетка их вверх и вниз, по крайней мере 3x с 1 мл стерильной пипетки. Инкубировать в течение 10 минут и оставить в темноте перед анализом.
  4. Цитолитический ассикул
    1. Смешайте суспензию ячейки со ступени 7.3.4 и повторите шаги 5.1 и 5.2 один раз.
    2. Нажмите кнопку New Specimen, чтобы добавить образец и трубку к эксперименту и назвать трубки следующим образом: Трубка 1, K562 (или OC-3) клетки только; Трубка 2, CFSE окрашенных K562 (или OC-3) клетки только; Трубка 3, E:T - 5:1; Трубка 4, E:T и 10:1.
    3. Создайте систему рассеяния Gating для цитолитического асссе(Рисунок 3A).
      1. Выберите трубку 1 и нажмите на кнопку Dot Plot, чтобы создать участок FSC-A/SSC-A. Нарисуйте прямоугольник ворота над всеми событиями с FSC-A порога йgt;5 х 104, чтобы исключить мусор аулаизм клетки.
      2. Выберите параметр SSC-A/CFSE для нового точечного участка. Выберите параметр 7-AAD/CFSE для нового точечного участка и нарисуйте ворота из четырех квадрантов, чтобы определить четыре субпопуляции.
      3. Нажмите кнопку Load Sample, чтобы сначала проанализировать пустой образец управления.
      4. Отрегулируйте напряжение SSC-A и FSC-A. Определите популяцию мертвых клеток с помощью параметров канала CFSE и 7AD. Запись данных изклеток CFSE в каждом образце.
    4. Повторите раздел 7.4.6 для исследования всех образцов.
    5. Откройте файлы, содержащие статистические значения каждого отдельного образца, для анализа нежизнеспособных популяций ячеек и экспорта данных в файлы анализа.

Результаты

Цель юристого протокола состоит в том, чтобы изолировать и расширить цитокин-индуцированных киллеров (CIK) Т-клеток из периферических моноцитов крови и оценить цитотоксический эффект CIK против гематологической злокачественности и твердых раковых клеток, соответственно. Индукция CIK был?...

Обсуждение

Описанный метод представляет собой быстрый, удобный и надежный протокол для изоляции и расширения цитотоксических цитокинов- индуцированных киллером (CIK) Т-клеток из цельных образцов крови здоровых доноров. Он также показывает цитотоксический эффект CIK против лейкемии (K562) и раковых кл...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих конфликтов финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано больницей Китайского медицинского университета (DMR-Cell-1809).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
7-Amino Actinomycin DBD559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibodyBD555518B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD555751MOPC-21
BD FACSCanto II Flow CytometerBD338962
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)BD565082
D-(+)-Glucose solutionSIGMAG8644
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12HyCloneSH30023.02
Fetal bovine serumHyCloneSH30084.03
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare Life Sciences71101700-EK
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibodyBD555332UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD555748MOPC-21
Human anti-CD3 mAbTaKaRaT210OKT3
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
ProleukinNOVARTIS
Recombinant Human Interferon-gammaCellGenix1425-050
Recombinant Human Interleukin-1 alphaPEPROTECH200-01A
RPMI1640 mediumGibco11875-085
Sigma 3-18K CentrifugeSigma10295
TrypLE Express EnzymeGibco12605028
X-VIVO 15 mediumLonza04-418Q

Ссылки

  1. Cappuzzello, E., et al. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells. Cytokine & Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).
  2. Schmidt-Wolf, R. S., et al. Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers. British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).
  3. Grainger, S., et al. Wnt Signaling in Hematological Malignancies. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).
  4. Dai, C., et al. Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer. Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).
  5. Schmidt-Wolf, I. G., et al. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity. TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).
  6. Introna, M., et al. Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).
  7. Schmeel, L. C., et al. Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC). Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).
  8. Rutella, S., et al. Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol. Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).
  9. Nausch, N., et al. NKG2D ligands in tumor immunity. Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).
  10. Gammaitoni, L., et al. Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features. Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).
  11. Rettinger, E., et al. The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells. Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).
  12. Narayan, R., et al. Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).
  13. Castiglia, S., et al. Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).
  14. Bonanno, G., et al. Thymoglobulin, interferon-γ and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures. Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).
  15. Iudicone, P., et al. Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway. Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).
  16. Liu, J., et al. Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion. PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).
  17. Chen, D., et al. Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer. Cell Death & Disease. 9 (3), 366 (2018).
  18. Tario, J. D. Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection. Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).
  19. Last'ovicka, J., et al. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).
  20. Yoshida, T., et al. Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity. Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

155

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены