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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire l'isolamento e l'espansione delle cellule mononucleari periferiche derivate dalle cellule citochine- indotte CD3-CD56- cellule killer e illustrare il loro effetto di citotossicità contro le cellule tumorali ematologiche e solide utilizzando un sistema di citometria di flusso di diagnosi invitro.

Abstract

L'immunoterapia cellulare adottiva si concentra sul ripristino del riconoscimento del cancro tramite il sistema immunitario e migliora l'uccisione efficace delle cellule tumorali. La terapia con cellule T indotta da citochine (CIK) per esercitare effetti citotossici significativi contro le cellule tumorali e per ridurre gli effetti negativi della chirurgia, delle radiazioni e della chemioterapia nei trattamenti contro il cancro. Il CIK può essere derivato da cellule mononucleari periferiche del sangue (PBMC), midollo osseo e sangue del cordone ombelicale. Le cellule CIK sono una sottopopolazione eterogenea di cellule T con CD3-CD56e caratteristiche fenotipiche natural killer (NK) che includono l'attività antitumorale senza restrizioni del complesso di istocompatibilità (MHC). Questo studio descrive un metodo qualificato, clinicamente applicabile, basato sulla citometria di flusso per la quantificazione della capacità citolytica delle cellule CIK derivate da PBMC contro le cellule tumorali ematologiche e solide. Nel saggio citolitico, le cellule CIK sono co-incubate a diversi rapporti con cellule tumorali bersaglio prestainte. Dopo il periodo di incubazione, il numero di cellule bersaglio è determinato da una macchia legante acido nucleico per rilevare le cellule morte. Questo metodo è applicabile sia alle applicazioni di ricerca che a quella diagnostica. Le cellule CIK possiedono una potente citotossicità che potrebbe essere esplorata come strategia alternativa per il trattamento del cancro dopo la sua valutazione preclinica da parte di un sistema di citometria basato su citometro (CS & T).

Introduzione

I linfociti Citotossici sono una popolazione specifica di cellule eretritarie immunitarie che mediano le risposte immunitarie contro il cancro. Diverse popolazioni di cellule efleganti, tra cui cellule killer attivate da linfocini (LAK), linfociti infiltrati di tumore (TIL), cellule NK , cellule di z T, e cellule killer indotta da citochine (CIK) sono stati sviluppati per scopi di terapia at-cellule adottivi (ACT)1. C'è un crescente interesse per le cellule CIK, perché rappresentano una miscela di popolazioni di cellule citototossiche indotte da citochine espanse da cellule mononucleari del sangue periferico autologhe (PMBC)2.

La crescita incontrollata di cellule progenitrici linfoidi, mieloblasti e linfoblasti porta a tre principali tipi di tumori del sangue (ad esempio leucemia, linfoma e mieloma), tumori solidi, tra cui carcinomi (ad esempio, cancro del polmone, cancro gastrico, cancro cervicale) e sarcomi, tra gli altri cancri3. Le cellule CIK sono una miscela di popolazioni cellulari che presentano una vasta gamma di attività antitumorali unrestricted complex (MHC) -unrestricted e quindi promettono per il trattamento dei tumori ematologici e avanzati4,5,6,7. Le celle CIK sono costituite da una combinazione di celle, tra cui le celle T (CD3,CD56),le cellule NK-T (CD3,CD56) e le cellule NK (CD3–CD56). L'ottimizzazione del protocollo di induzione del CIK mediante l'uso di un programma fisso per l'aggiunta di anticorpi IFN-z, anti-CD3 e IL-2, comporta l'espansione delle cellule CIK8. La capacità citototossica delle cellule CIK contro le cellule tumorali dipende principalmente dall'impegno del membro D del gruppo NK 2 (un membro della famiglia di recettori simili alla lectina di tipo C) ligando NKG2D sulle cellule tumorali e sulle vie mediate da perforina9. I risultati di uno studio preclinico hanno rivelato che le cellule CIK stimolate da IL-15 hanno indotto la potente citotossicità potente contro le linee cellulari della leucemia mieloide primaria e acuta in vitro e hanno mostrato una minore alloreattività contro i normali PBMC e i fibroblasti9. Recentemente, è stato pubblicato il risultato dell'infusione di CIK (1 x 108/kg dicellule CD3) come consolidamento a seguito del trapianto allogeneico non mieloablativo per il trattamento dei neoplasmi mieloidi in uno studio clinico di fase II.

Nel presente studio, abbiamo sviluppato una formula di coltura cellulare ottimizzata composta da ifN-z, IL-1, anticorpi anti-CD3, e IL-2 aggiunto al mezzo cellulare ematopoietico per aumentare la produzione di CIK, e studiato l'effetto citotossico delle cellule CIK contro le malattie umane croniche leucemia mieloide (K562) cellule e cellule tumorali ovariche (OC-3).

Protocollo

Il protocollo clinico è stato eseguito e approvato in conformità con le linee guida del Institutional Review Board della China Medical University and Hospital Research Ethics Committee. Gli esemplari di sangue periferico sono stati raccolti da volontari sani con il loro consenso informato.

1. Preparazione dei materiali

  1. Conservare reagenti, anticorpi e sostanze chimiche, come mostrato nella scheda dati sulla sicurezza dei materiali (MSDS). Sciogliere i farmaci o le citochine nei solventi come soluzioni di riserva e poi per lo stoccaggio di un valore di -20 o -80 gradi centigradi.
    NOTA: informazioni dettagliate per la preparazione dei materiali sono annotate nella Tabella dei materiali.

2. Isolamento PBMC

  1. Scaldare la soluzione di sfumatura di densità (Tabella dei materiali) a 18-20 gradi centigradi prima dell'uso. Invertire la bottiglia di soluzione più volte per garantire una miscelazione accurata.
  2. Raccogliere 3 o 5 mL di campione di sangue venoso umano in una fiala eparinizzata e mescolare bene invertendo delicatamente il tubo più volte.
  3. Preparare 4 mL di soluzione di gradiente di densità in un tubo sterile da 15 mL.
  4. Con attenzione strato 1 mL del campione di sangue sulla soluzione di gradiente di densità.
  5. Centrifuga a 400 x g per 30 min a 18-20 gradi (spegni la pausa).
  6. Aspirare con attenzione e immediatamente lo strato di strato di buffy di cellule mononucleari (circa 1 mL) contemporaneamente per evitare di disturbare gli strati di un tubo sterile da 15 mL utilizzando una pipetta sterile da 1 mL.
  7. Aggiungete al manio del tubo di centrifuga nel tubo di centrifugare almeno 3 volumi di salina con buffer fosfato. Sospendere le cellule pipettandoli delicatamente su e giù almeno 3x con una pipetta sterile.
  8. Centrifuga a 400 x g per 10 min a 18-20 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.
  9. Sospendere il pellet cellulare con 5 mL di mezzo basale (Tabella dei materiali) e trasferirlo in un pallone. Coltura le cellule in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.

3. Induzione ed espansione del CIK

  1. Il giorno 0, colture i PBMC (1 x 106) in un mezzo basale fresco contenente 1.000 IU/mL di IFN-z per 24 h in un'incubatrice di coltura cellulare umida a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
  2. Il primo giorno, rinfrescare il supporto con un supporto basale fresco contenente 50 ng/mL di anticorpo anti-CD3, 1 ng/mL di rh IL-1 e 1.000 U/mL di rh IL-2. Rinfrescare il supporto ogni 3 giorni.
  3. Il giorno 7, rinfrescare il supporto con un supporto basale fresco contenente 1.000 U/mL di rh IL-2. Aggiornare il supporto ogni 3 giorni fino alla fine dell'espansione delle celle (Giorno 14).

4. Immunofenotipizzazione per la valutazione delle cellule CIK

  1. Lavare le cellule CIK con 10 mL di PBS sterile. Centrifuga per 10 min a 300 x g e 18-20 gradi centigradi, aspira il super-natante, e risospende nuovamente le cellule con 10 mL di PBS. Contare il numero di cella e testare la fattibilità della cella utilizzando l'esempio di esclusione blu trypan.
  2. Aliquote in sei sterili tubi da 1,5 mL ad una densità di 5-10 x 105 cellule/mL PBS. Etichettare e trattare come segue: Tube 1, Blank (nessun anticorpo); Tubo 2, aggiungere 20 L di isotipo IgG1-FITC; Tubo 3, aggiungere 20 L di isotipo IgG1-APC mAbs; Tubo 4, aggiungere 20 l di CD3-FITC; Tubo 5, aggiungere 20 L di CD56-APC mAbs; e Tube 6, aggiungere 20 gradi di CD3-FITC e 20 -L di CD56-APC mAbs.
  3. Mescolare delicatamente le cellule CIK con gli anticorpi pipeting su e giù almeno 3x con una pipetta sterile da 1 mL, quindi incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
  4. Centrifugare i tubi per 10 min a 300 x g e 18-20 gradi centigradi. Aspirare il supernatante e sospendere il pellet cellulare una volta con 1 mL di PBS. Convogliarli delicatamente su e giù almeno 3x con una pipetta sterile da 1 mL.
  5. Ripetere il passaggio 4.4.
  6. Lasciare i tubi al buio prima dell'analisi citometrica del flusso.

5. Riconoscimento dei marcatori CD

  1. Trasferire la sospensione cellulare in uno sterile tubo rotondo inferiore in polistirolo da 5 mL con un tappo a colino a celle (100 m di rete) pipettando delicatamente attraverso il tappo. Mettere i tubi sul carosello in ordine.
  2. Aprire il software di analisi della citometria di flusso e creare una cartella sperimentale. Fare clic sul pulsante Nuovo campione per aggiungere un campione e un tubo all'esperimento e denominare i tubi come segue: Tubo 1, Vuoto; Tubo 2, Isotipo IgG1-CD3; Tubo 3, Isotipo IgG1-CD56; Tubo 4, CD3; Tubo 5, CD56; Tubo 6, CD3CD56.
  3. Creare un sistema di gating a dispersione per le popolazioni di cellule CIK (Figura 2A).
    1. Selezionare Tubo 1 (Vuoto) e fare clic sul pulsante Stampa punti per creare un grafico FSC-A/SSC-A. Disegnare un cancello rettangolare sull'intera popolazione di celle con una soglia FSC-A >5 x 104 per escludere i detriti delle cellule.
    2. Selezionare il parametro SSC-A/SSC-H per il nuovo grafico a punti e disegnare un cancello poligono intorno a tutte le singole celle. Selezionare i parametri Count/FITC (CD3) e Count/APC (CD56) rispettivamente per il nuovo grafico dell'istogramma. Selezionare il parametro FITC (CD3)/APC (CD56) per la nuova stampa a punti e disegnare un gate quadrante a quattro per definire le quattro sottopopolazioni.
    3. Registrare i dati da 20.000 singole celle in ogni campione. Fare clic sul pulsante Carica campione per analizzare prima l'esempio del controllo Vuoto. Identificare l'intera popolazione di celle CIK utilizzando i parametri dei canali CD56 e CD3.
  4. Ripetere il passaggio 5.3 per l'indagine di tutti i campioni.
  5. Aprire i file contenenti i valori statistici del singolo campione per analizzare le popolazioni di cellule CIK e ristamparle in file di analisi.

6. Coltura e colorazione delle cellule di leucemia mieloide cronica umana K562 e cellule OC-3

  1. Cellule K562
    1. Coltura cellule K562 in supporti completi (RPMI basale medium contenente 10% siero bovino fetale [FBS] e 50 U/mL antibiotici e regolare il glucosio a 4,5 g/L) ad una densità di 0,5x1 x 106 cellule/mL in una coltura cellulare e incubare in un'incubatrice umidizzata a 37 C e 5% CO2.
    2. Trasferi i mezzi di coltura contenenti le cellule K562 in tubi sterili da 50 mL e ferma le cellule a 300 x g per 10 min a 18-20 gradi centigradi il giorno dell'esperimento.
    3. Aspirare il supernatante, rispendere le cellule in 5 mL di PBS sterile, e mescolare bene delicatamente.
    4. Pellet le cellule a 300 x g per 10 min. Aspirate the supernatant, resuspend the cells in PBS, and adjust the K562 cells to a a concentration of 0.5-1 x 106 cells/mL.
    5. Aggiungete 0,5 l di colorante CFSE al 1 mL di sospensione cellulare K562 in un tubo sterile da 15 mL ad una concentrazione finale di 5 M. Mescolare delicatamente le sospensioni convogliando su e giù almeno 3x.
    6. Lasciare il tubo in un'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 10-15 min.
    7. Aggiungere 9 mL di PBS al tubo e pellet le cellule a 300 x g per 10 min. Trasferire la sospensione cellulare in un pallone di coltura cellulare e posizionarla nell'incubatrice.
  2. Celle OC-3
    1. Coltura OC-3 cellule in un supporto completo (media DMEM/F12 contenente 10% FBS e 50 U/mL antibiotici) ad una densità di 0,5-1 x 106 cellule in un pallone di coltura cellulare a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
    2. Aspirare i mezzi di coltura e lavare le cellule con PBS 1 giorno prima dell'esperimento.
    3. Staccare le cellule aggiungendo 1 mL di soluzione enzimatica di dissociazione cellulare (Tabella dei materiali) e incubare per 5 min a 37 .
    4. Sospendere le celle aggiungendo 5 mL di PBS e mescolare bene delicatamente. Pellet le cellule a 300 x g per 10 min e aspirare il supernatante. Risospendere le cellule in PBS e regolarle a una concentrazione di 0,5–1 x 106 celle/mL.
    5. Aggiungete 0,5 l di colorante CFSE a 1 mL della sospensione cellulare OC-3 in un tubo sterile da 15 mL ad una concentrazione finale di 5 M. Mescolare delicatamente le sospensioni convogliando su e giù almeno 3x.
    6. Lasciare il tubo in un'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 10-15 min.
    7. Aggiungere 9 mL di PBS al tubo e pellet le cellule a 300 x g per 10 min. Seme 5 x 105 cellule / bene in una piastra 6 pozzi e incubare in un'incubatrice umidificata a 37 c e 5% DI CO2 durante la notte.

7. Ansaggio di Cytotoxic

  1. Cocultura delle cellule CIK e K562 (CIK-K562)
    1. Contare le cellule K562 del passaggio 6.1.7 e testare la fattibilità cellulare con il test di esclusione blu trypan. Aggiungere 1 mL di celle K562 a ogni pozzo in una piastra 6 po' a densità di 5 x 105/mL.
    2. Aggiungere 1 mL di mezzo basale con o senza celle CIK dal passo 3.4 alla piastra 6 del pozzo dal passo 7.1.1 come segue: Beh 1 - Vuoto, Celle K562 da solo (5 x 105); Beh 2 - Cellule K562 macchiate di CFSE da sole (5 x 105); Beh 3 - Celle CIK (E [effettore], 25 x 105) - cellule K562 macchiate CFSE (T [bersaglio], 5 x 105); Cellule 4 - CIK (E, 50 x 105) - cellule K562 colorate CFSE (T, 5 x 105).
    3. Mescolare le sospensioni cellulari convogliandole delicatamente su e giù almeno 3x. Posizionare la piastra nell'incubatrice per 24 ore.
  2. Cocultura delle cellule CIK e OC-3 (CIK-OC-3)
    1. Aggiungere 1 mL di mezzo basale con o senza celle CIK dal passo 3.4 alla piastra 6 del pozzo dal passo 6.2.7 come segue: Beh 1 - Vuoto, OC-3 cellule da solo (5 x 105); Beh 2 - Cellule OC-3 macchiate di CFSE da sole (5 x 105); Beh 3 - Celle CIK (E, 25 x 105) - cellule OC-3 macchiate CFSE (T, 5 x 105); Cellule CIK (E, 50 x 105) - cellule OC-3 colorate CFSE (T, 5 x 105).
    2. Mescolare le sospensioni cellulari convogliandole delicatamente su e giù almeno 3x. Mettere la piastra nell'incubatrice per 24 ore.
  3. 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) colorazione
    1. Raccogliere la sospensione cellulare CIK-K562 da passo 7.1.3 direttamente in un tubo sterile da 15 mL.
    2. Raccogliere le sospensioni e le cellule aderenti dai gruppi CIK-OC-3 dal punto 7.2.2.
      1. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo sterile da 15 mL. Lavare il pozzo con 1 mL di PBS sterile, raccogliere il PBS e aggiungere al tubo. Aggiungere 0,5 mL di soluzione enzimatica di dissociazione cellulare e incubare per 5 min a 37 gradi centigradi.
      2. Aggiungere 1 mL della soluzione dallo stesso tubo al pozzo corrispondente e mescolare delicatamente le cellule perforandole su e giù almeno 3x con una pipetta sterile da 1 mL. Raccogliere tutte le cellule nello stesso tubo.
    3. Centrifuga a 300 x g per 10 min, aspirare il supernatante, e risospendere le cellule in 1 mL di PBS sterile. Pellere le cellule a 300 x g per 10 min, aspirare il supernatante, e rimettere in sospensione le cellule in 100 .
    4. Aggiungete alla sospensione cellulare 5-L l di 7-AAD (50 ng/-L stock). Mescolare delicatamente le cellule pipetting su e giù almeno 3x con una pipetta sterile da 1 mL. Incubare per 10 min e lasciare al buio prima dell'analisi.
  4. Saggio di capacità citolitica
    1. Mescolare la sospensione della cella dai passaggi 7.3.4 e ripetere i passaggi 5.1 e 5.2 una volta.
    2. Fare clic sul pulsante Nuovo esemplare per aggiungere un campione e un tubo all'esperimento e assegnare un nome ai tubi come segue: Solo le celle Tube 1, K562 (o OC-3); Tubo 2, solo cellule K562 (o OC-3) macchiate di CFSE; Tubo 3, E:T - 5:1; Tubo 4, E:T - 10:1.
    3. Creare un sistema di dispersione per l'esempio citolytico (Figura 3A).
      1. Selezionare Tubo 1 e fare clic sul pulsante Grafico punti per creare un grafico FSC-A/SSC-A. Disegnare un cancello rettangolare su tutti gli eventi con una soglia FSC-A >5 x 104 per escludere i detriti delle celle.
      2. Selezionare il parametro SSC-A/CFSE per il nuovo grafico a punti. Selezionare il parametro 7-AAD/CFSE per il nuovo grafico a punti e disegnare un gate a quattro quadranti per definire le quattro sottopopolazioni.
      3. Fare clic sul pulsante Carica campione per analizzare prima l'esempio di controllo vuoto.
      4. Regolare la tensione di SSC-A e FSC-A. Identificare la popolazione di cellule morte utilizzando i parametri CFSE e 7-AAD del canale. Registrare i dati da >20.000 CFSE: cellule in ogni campione.
    4. Ripetere la sezione 7.4.6 per l'indagine di tutti i campioni.
    5. Aprire i file contenenti i valori statistici di ogni singolo campione per analizzare le popolazioni di cellule non vitali ed esportare i dati in file di analisi.

Risultati

Lo scopo del presente protocollo è quello di isolare ed espandere le cellule T killer indotte da citochine (CIK) dai monociti del sangue periferici e valutare l'effetto citotossico del CIK contro la malignità ematologica e le cellule tumorali solide, rispettivamente. L'induzione del CIK è stata identificata dal riconoscimento CD3/CD56. Figura 1A mostra il protocollo per l'induzione e l'espansione CIK. I risultati rappresentativi della strategia di gating per l'analisi del...

Discussione

Il metodo descritto è un protocollo veloce, conveniente e affidabile per l'isolamento e l'espansione di cellule T killer citotototossiche indotte da citotozi (CIK) da campioni di t di donatori sani. Mostra anche l'effetto citotossico del CIK contro la leucemia (K562) e le cellule tumorali ovariche (OC-3) utilizzando un sistema di localizzazione e tracciamento della citometria a flusso (CS & T). Le cellule CIK possono essere indotte ed espanse in buone pratiche manufactoryli (GMP) utilizzando citochine di grado GMP e mez...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano che non esistono conflitti di interesse finanziario concorrenti.

Riconoscimenti

Questo studio è stato supportato dal China Medical University Hospital (DMR-Cell-1809).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
7-Amino Actinomycin DBD559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibodyBD555518B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD555751MOPC-21
BD FACSCanto II Flow CytometerBD338962
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)BD565082
D-(+)-Glucose solutionSIGMAG8644
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12HyCloneSH30023.02
Fetal bovine serumHyCloneSH30084.03
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare Life Sciences71101700-EK
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibodyBD555332UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD555748MOPC-21
Human anti-CD3 mAbTaKaRaT210OKT3
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
ProleukinNOVARTIS
Recombinant Human Interferon-gammaCellGenix1425-050
Recombinant Human Interleukin-1 alphaPEPROTECH200-01A
RPMI1640 mediumGibco11875-085
Sigma 3-18K CentrifugeSigma10295
TrypLE Express EnzymeGibco12605028
X-VIVO 15 mediumLonza04-418Q

Riferimenti

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