Isolamento e Expansão de células T assassinas induzidas por citocina para tratamento de câncer

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar o isolamento e expansão de células mononucleares derivadas de citocinas derivadas de citocinas derivadas de citocinas induzidas por citocinas por cdinénsia^{induzidas por}citocinas + CD56⁺ células assassinas e ilustrar seu efeito de citotoxicidade contra células cancerígenas hematológicas e sólidas usando um sistema de citometria de fluxo de diagnóstico in vitro.

Resumo

A imunoterapia celular adotiva se concentra na restauração do reconhecimento do câncer através do sistema imunológico e melhora a efetiva matança de células tumorais. A terapia celular T do assassino induzido por citocinas (CIK) tem sido relatada para exercer efeitos citotóxicos significativos contra células cancerosas e reduzir os efeitos adversos da cirurgia, radiação e quimioterapia em tratamentos de câncer. A CIK pode ser derivada de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs), medula óssea e sangue do cordão umbilical. As células CIK são uma subpopulação heterogênea de células T com CD3⁺CD56⁺ e características fenotimétricas do assassino natural (NK) que incluem grande complexo de histocompatibilidade (MHC) atividade antitumorarestrita. Este estudo descreve um método qualificado, clinicamente aplicável, baseado em citometria de fluxo para a quantificação da capacidade citolítica das células CIK derivadas do PBMC contra células cancerígenas hematológicas e sólidas. No ensaio citolítico, as células CIK são co-incubadas em diferentes proporções com células tumorais alvo prestained. Após o período de incubação, o número de células-alvo são determinados por uma mancha de ligação com ácido nucleico para detectar células mortas. Este método é aplicável tanto a pesquisas quanto às aplicações diagnósticas. As células CIK possuem citotoxicidade potente que poderia ser explorada como uma estratégia alternativa para o tratamento do câncer após sua avaliação pré-clínica por um sistema de citometria e rastreamento baseado em cítometro (CS & T) sistema de citometria de fluxo baseado em CS & T.

Introdução

Linfócitos T citotóxicos são uma população específica de células de efeito imunológico que media as respostas imunes contra o câncer. Várias populações de células effectoras, incluindo células assassinas ativadas por linfokina (LAK), linfócitos infiltrados em tumores (TILs), células assassinas naturais (NK), células γδ T e células assassinas induzidas por citocina (CIK) foram desenvolvidas para fins adotados de terapia celular T (ACT)¹. Há um crescente interesse em células CIK, porque elas representam uma mistura de populações de células citotóxicas induzidas por citocinas expandidas a partir de células mononucleares sanguíneas autologos periféricas (PMBCs)².

O crescimento descontrolado de células progenitoras linfoides, mieloblastos e linfoblastos leva a três tipos principais de câncer de sangue (ou seja, leucemia, linfoma e mieloma), tumores sólidos, incluindo cancerígenos (por exemplo, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer cervical) e sarcomas, entre outros cânceres³. As células CIK são uma mistura de populações celulares que exibem uma ampla gama de grandes atividades antitumorais (MHC)-irrestritas e, portanto, mantêm a promessa para o tratamento de tumores hematológicos e avançados^4,5,6,7. As células CIK compreendem uma combinação de células, incluindo células T (CD3⁺CD56⁻), células NK-T (CD3⁺CD56⁺) e células NK (CD3^–CD56⁺). A otimização do protocolo de indução CIK usando um cronograma fixo para aadição de anticorpo IFN-γ, anti-CD3 e IL-2, resulta na expansão das células CIK⁸. A capacidade citotóxica das células CIK contra células cancerígenas depende principalmente do engajamento do membro do grupo NK D (um membro da família receptora tipo C) ligands NKG2D em células tumorais, e em caminhos mediados por perforina⁹. Os resultados de um estudo pré-clínico revelaram que as células CIK estimuladas pelo IL-15 induziram citotoxicidade potente contra linhas de leucemia mielóide primária e aguda in vitro e apresentaram menor aloreatividade contra PBMCs normais e fibroblastos⁹. Recentemente, foi^publicadoa infusão do resultado da infusão de CIK derivado de doadores saudáveis (1 x 10⁸/kg de CD3⁺ células) como consolidação após transplante aloloablativo não mieloiático para tratamento de neoplasias mielóides em um estudo clínico de fase II .

No presente estudo, desenvolvemos uma fórmula de cultura celular otimizada composta por IFN-γ, IL-1α, anti-CD3 e IL-2 adicionadoao meio de células hematopoiéticas para aumentar a produção de CIK, e investigou o efeito citotóxico das células CIK contra a crônica humana células de leucemia mielóide (K562) e células cancerígenas de ovário (OC-3).

Protocolo

O protocolo clínico foi realizado e aprovado de acordo com as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Médica e Hospitalar da China. Amostras de sangue periféricas foram colhidas de voluntários saudáveis com seu consentimento informado.

1. Preparação de materiais

1. Reagentes de loja, anticorpos e produtos químicos, como mostrado no Material Safety Data Sheet (MSDS). Dissolva as drogas ou citocinas em solventes como soluções de estoque e, em seguida, aliquot para armazenamento a -20 °C ou -80 °C.
   NOTA: Informações detalhadas para preparação do material são notadas na Tabela de Materiais.

2. Isolamento PBMC

1. Aqueça a solução de gradiente de densidade(Tabela de Materiais)a 18-20 °C antes do uso. Inverta a garrafa de solução várias vezes para garantir uma mistura completa.
2. Colete 3-5 mL de amostra de sangue venoso humano em um frasco heparinizado e misture bem, invertendo suavemente o tubo várias vezes.
3. Prepare 4 mL de solução de gradiente de densidade em um tubo estéril de 15 mL.
4. Cuidadosamente camada 1 mL da amostra de sangue na solução de gradiente de densidade.
5. Centrífuga a 400 x g por 30 min a 18-20 °C (desligue o intervalo).
6. Cuidadosamente e imediatamente aspiraa a camada de casaco buffy de células mononucleares (cerca de 1 mL) ao mesmo tempo para evitar perturbar as camadas em um tubo estéril de 15 mL usando uma pipeta estéril de 1 mL.
7. Adicione pelo menos 3 volumes (~3 mL) de soro soro tampão de fosfato (PBS) ao casaco polido no tubo de centrífuga. Suspenda as células canalizando-as suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril.
8. Centrífuga a 400 x g por 10 min a 18-20 °C. Aspirar o supernatante.
9. Suspender a pelota celular com 5 mL de meio basal (Tabela de Materiais) e transferir para um frasco. Cultura as células em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% CO₂.

3. Indução e expansão da CIK

1. No dia 0, cultura os PBMCs (1 x¹⁰⁶⁾em meio basal fresco contendo 1.000 UI/mL de IFN-γ por 24 h em uma incubadora de cultura celular umidificada a 37 °C e 5% de CO₂.
2. No dia 1, refresque o meio com meio basal fresco contendo 50 ng/mL de anticorpo anti-CD3, 1 ng/mL de RH IL-1α, e 1.000 U/mL de rh IL-2. Atualize o meio a cada 3 dias.
3. No dia 7, refresque o meio com meio basal fresco contendo 1.000 U/mL de RH IL-2. Refrescar o meio a cada 3 dias até o fim da expansão celular (Dia 14).

4. Imunofenofetipagem para avaliação de células CIK

1. Lave as células CIK com 10 mL de PBS estéreis. Centrífuga por 10 min a 300 x g e 18-20 °C, aspirando o supernatante, e resuspender as células com 10 mL de PBS. Conte o número da célula e a viabilidade da célula de teste usando o ensaio de exclusão azul trypan.
2. Aliquot as células CIK em seis tubos estéreis de 1,5 mL a uma densidade de ~5-10 x 10⁵ células/mL PBS. Rotular e tratar da seguinte forma: Tubo 1, Blank (sem anticorpo); Tubo 2, adicione 20 μL de isotipo IgG1-FITC; Tubo 3, adicione 20 μL de isótipo IgG1-APC mAbs; Tubo 4, adicione 20 μL de CD3-FITC; Tubo 5, adicione 20 μL de MAbs CD56-APC; e Tubo 6, adicione 20 μL de CD3-FITC e 20 μL de MAbs CD56-APC.
3. Misture delicadamente as células CIK com os anticorpos, canalizando-as suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL, e depois incubar por 30 min à temperatura ambiente no escuro.
4. Centrífuga os tubos por 10 min a 300 x g e 18-20 °C. Aspirar o supernatante e suspender a pelota celular uma vez com 1 mL de PBS. Gentilmente, encane-os para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL.
5. Repita o passo 4.4.
6. Deixe os tubos no escuro antes da análise citométrica de fluxo.

5. Reconhecimento de marcadores cd

1. Transfira a suspensão da célula para um tubo inferior redondo de poliestireno estéril de 5 mL com uma tampa de filtro celular (malha de 100 μm) canalizando suavemente através da tampa. Coloque os tubos no carrossel em ordem.
2. Abra o software de análise de citometria de fluxo e crie uma pasta experimental. Clique no botão Novo Espécime para adicionar uma amostra e tubo ao experimento e nomear os tubos da seguinte forma: Tubo 1, Em branco; Tubo 2, Isotype IgG1-CD3; Tubo 3, Isotype IgG1-CD56; Tubo 4, CD3; Tubo 5, CD56; Tubo 6, CD3CD56.
3. Crie um sistema de dispersão para as populações de células CIK(Figura 2A).
   1. Selecione o Tubo 1 (Em branco) e clique no botão Dot Plot para criar um enredo FSC-A/SSC-A. Desenhe um portão retângulo sobre toda a população celular com um limiar FSC-A >5 x 10⁴ para excluir detritos celulares.
   2. Selecione o parâmetro SSC-A/SSC-H para o novo lote de ponto e desenhe um portão de polígono em todas as células únicas. Selecione o parâmetro Count/FITC (CD3) e Count/APC (CD56) para o novo enredo de histograma, respectivamente. Selecione o parâmetro FITC (CD3)/APC (CD56) para o novo lote de pontos e desenhe um portão de quatro quadrantes para definir as quatro subpopulações.
   3. Registre os dados de 20.000 células individuais em cada espécime. Clique no botão Amostra de carga para analisar a amostra de controle em branco primeiro. Identifique toda a população de células CIK usando os parâmetros do canal CD56 e CD3.
4. Repita o passo 5.3 para a investigação de todos os espécimes.
5. Abra os arquivos contendo os valores estatísticos da amostra individual para analisar as populações de células CIK e reimprimi-los em arquivos de análise.

6. Culturing e coloração de leucemia mielóide crônica humana células K562 e células OC-3 de câncer de ovário

1. Células K562
   1. Células Culturais K562 em mídia completa (meio basal RPMI contendo 10% de soro bovino fetal [FBS] e 50 antibióticos U/mL e ajustam a glicose a 4,5 g/L) a uma densidade de 0,5-1 x 10⁶ células/mL em um frasco de cultura celular e incubam em uma incubadora úmida a 37 °C e 5% CO₂.
   2. Transfira a mídia cultural contendo as células K562 para tubos estéreis de 50 mL e pellet as células a 300 x g por 10 min a 18-20 °C no dia do experimento.
   3. Aspirar o supernatante, resuspender as células em 5 mL de PBS estéreis, e misture bem suavemente.
   4. Pelotas as células a 300 x g por 10 min. Aspirar o supernatant, resuspender as células na PBS e ajustar as células K562 a uma concentração de 0,5-1 x 10⁶ células/mL.
   5. Adicione 0,5 μL de tinantes CFSE à 1 mL de suspensão celular K562 em um tubo estéril de 15 mL a uma concentração final de 5 μM. Misture delicadamente a suspensão encanando para cima e para baixo pelo menos 3x.
   6. Deixe o tubo em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% DE CO₂ por 10-15 min.
   7. Adicione 9 mL de PBS ao tubo e as células a 300 x g por 10 min. Decante o supernatante e, em seguida, suspenda a pelota celular em 10 mL de mídia completa. Transfira a suspensão celular para um frasco de cultura celular e coloque na incubadora.
2. Células OC-3
   1. Células Culturais OC-3 em mídia completa (meio DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 50 antibióticos U/mL) a uma densidade de 0,5-1 x 10⁶ células em um frasco de cultura celular a 37 °C e 5% DE CO₂.
   2. Aspirar a mídia cultural e lavar as células com PBS 1 dia antes do experimento.
   3. Desaqueasse as células adicionando 1 mL de solução de enzima de dissociação celular (Tabela de Materiais) e incubar por 5 min a 37 °C.
   4. Suspenda as células adicionando 5 mL de PBS e misture bem suavemente. Contasiar as células a 300 x g por 10 min e aspirar o supernatante. Resuspender as células em PBS e ajustar as células a uma concentração de 0,5-1 x 10⁶ células/mL.
   5. Adicione 0,5 μL de tinantes CFSE a 1 mL da suspensão da célula OC-3 em um tubo estéril de 15 mL a uma concentração final de 5 μM. Misture delicadamente a suspensão encanando para cima e para baixo pelo menos 3x.
   6. Deixe o tubo em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% DE CO₂ por 10-15 min.
   7. Adicione 9 mL de PBS ao tubo e as células a 300 x g por 10 min. Decante o supernatante e, em seguida, suspenda a pelota celular com mídia completa. Sementes 5 x 10⁵ células/bem em uma placa de 6 poços e incubam em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% CO₂ durante a noite.

7. Ensaio citotóxico

1. Cocultura das células CIK e K562 (CIK-K562)
   1. Conte as células K562 a partir da etapa 6.1.7 e teste a viabilidade celular por ensaio de exclusão azul trypan. Adicione 1 mL de células K562 a cada poço em uma placa de 6 poços a uma densidade de 5 x 10⁵/mL.
   2. Adicione 1 mL de média basal com ou sem células CIK da etapa 3.4 para a placa 6 poço a partir da etapa 7.1.1 da seguinte forma: Bem 1 = Branco, células K562 sozinha (5 x 10⁵); Bem 2 = células K562 manchadas pela CFSE sozinha (5 x 10⁵); Bem 3 = células CIK (E [effector], 25 x 10⁵) + células K562 manchadas pelo CFSE (T [alvo], 5 x 10⁵); Bem 4 = células CIK (E, 50 x 10⁵) + células K562 manchadas pelo CFSE (T, 5 x 10⁵).
   3. Misture as suspensões da célula canalizando-as suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x. Coloque a placa na incubadora por 24 h.
2. Cocultura das células CIK e OC-3 (CIK-OC-3)
   1. Adicione 1 mL de média basal com ou sem células CIK da etapa 3.4 à placa 6 poço da etapa 6.2.7 da seguinte forma: Bem 1 = Branco, células OC-3 sozinha (5 x 10⁵); Bem 2 = células OC-3 manchadas pela CFSE sozinha (5 x 10⁵); Bem 3 = células CIK (E, 25 x 10⁵) + células OC-3 manchadas pelo CFSE (T, 5 x 10⁵); Bem 4 = células CIK (E, 50 x 10⁵) + células OC-3 manchadas pelo CFSE (T, 5 x 10⁵).
   2. Misture as suspensões da célula canalizando-as suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x. Coloque a placa na incubadora por 24 h.
3. 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) coloração de tinta
   1. Colher a suspensão da célula CIK-K562 da etapa 7.1.3 diretamente em um tubo estéril de 15 mL.
   2. Colher as células suspensas e aderentes dos grupos CIK-OC-3 a partir da etapa 7.2.2.
      1. Transfira a suspensão da célula para um tubo estéril de 15 mL. Lave o poço com 1 mL de PBS estéril, pegue o PBS e adicione ao tubo. Adicione 0,5 mL de solução de enzima de dissociação celular e incuba por 5 min a 37 °C.
      2. Adicione 1 mL da solução do mesmo tubo ao poço correspondente e misture delicadamente as células canalizando-as para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL. Colete todas as células no mesmo tubo.
   3. Centrífuga a 300 x g por 10 min, aspirar o supernatante, e resuspender as células em 1 mL de PBS estéril. Pelotas as células a 300 x g por 10 min, aspirar o supernatant, e resuspender as células em 100 μL de PBS estéreis.
   4. Adicione 5 μL de tinantes 7-AAD (estoque de 50 ng/μL) à suspensão da célula. Misture delicadamente as células canalizando-as para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL. Incubar por 10 min e deixe no escuro antes da análise.
4. Ensaio de capacidade citolítica
   1. Misture a suspensão celular da etapa 7.3.4 e repita as etapas 5.1 e 5.2 uma vez.
   2. Clique no botão Novo Espécime para adicionar um espécime e tubo ao experimento e nomear os tubos da seguinte forma: Tubos 1, Células K562 (ou OC-3) apenas; Tubo 2, células K562 (ou OC-3) manchadas pelo CFSE; Tubo 3, E:T = 5:1; Tubo 4, E:T = 10:1.
   3. Crie um sistema de gating de dispersão para o ensaio citolítico (Figura 3A).
      1. Selecione o Tubo 1 e clique no botão Dot Plot para criar um enredo FSC-A/SSC-A. Desenhe um portão retângulo sobre todos os eventos com um limiar FSC-A >5 x 10⁴ para excluir detritos celulares.
      2. Selecione o parâmetro SSC-A/CFSE para a nova trama de pontilhão. Selecione o parâmetro 7-AAD/CFSE para o novo lote de pontos e desenhe um portão de quatro quadrantes para definir as quatro subpopulações.
      3. Clique no botão Amostra de carga para analisar a amostra de controle em branco primeiro.
      4. Ajuste a tensão de SSC-A e FSC-A. Identifique a população de células mortas usando os parâmetros do CANAL CFSE e 7-AAD. Registre os dados de células >20.000 CFSE⁺ em cada espécime.
   4. Repita a seção 7.4.6 para a investigação de todos os espécimes.
   5. Abra os arquivos contendo os valores estatísticos de cada espécime individual para analisar as populações de células não viáveis e exportar os dados para arquivos de análise.

Resultados

O objetivo do protocolo atual é isolar e expandir células T de assassinos induzidos por citocinas a partir de monocitos sanguíneos periféricos e avaliar o efeito citotóxico da CIK contra malignidade hematológica e células cancerígenas sólidas, respectivamente. A indução do CIK foi identificada pelo reconhecimento CD3/CD56. A Figura 1A mostra o protocolo para indução e expansão cik. Os resultados representativos da estratégia de gating para análise da subpopul...

Discussão

O método descrito é um protocolo rápido, conveniente e confiável para o isolamento e expansão de células T de cifras tóxicas induzidas por citocina (CIK) de amostras de sangue inteiro de doadores saudáveis. Também mostra o efeito citotóxico do CIK contra leucemia (K562) e células cancerígenas ovarianas (OC-3) usando um sistema de configuração e rastreamento de citometria de fluxo (CS & T). As células CIK podem ser induzidas e expandidas em boas condições de práticas manufactory (GMP) usando citocinas de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Amino Actinomycin D	BD	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody	BD	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD	338962
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	BD	565082
D-(+)-Glucose solution	SIGMA	G8644
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody	BD	555332	UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555748	MOPC-21
Human anti-CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Proleukin	NOVARTIS
Recombinant Human Interferon-gamma	CellGenix	1425-050
Recombinant Human Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A
RPMI1640 medium	Gibco	11875-085
Sigma 3-18K Centrifuge	Sigma	10295
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028
X-VIVO 15 medium	Lonza	04-418Q