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要約

このプロトコルは、ドロショウジョウバエ幼虫を取り付け、無傷の生きている動物における10時間以上の中断のないタイムラプス画像を達成する方法を記載している。この方法は、幼虫の身体壁に近い多くの生物学的プロセスを画像化するために使用することができる。

要約

ライブイメージングは、細胞生物学の問題を調査するための貴重なアプローチです。ショウジョウバの幼虫は、幼虫の体壁とほとんどの内臓が透明であるため、生体内のライブイメージングに特に適しています。しかし、30分を超えて無傷のショウジョウバエ幼虫の連続的なライブイメージングは、幼虫を長時間非侵襲的に固定固定化することが困難であるため困難であった。ここでは、高時間的および空間的分解能を有する生きたショウジョウバエ幼虫を10時間以上連続的にイメージングできるLarvaSPAと呼ばれる幼虫取り付け方法を紹介する。この方法は、UV反応性接着剤を使用してカバースリップに幼虫を部分的に取り付け、さらにポリジメチルシロキサン(PDMS)ブロックを使用して幼虫の動きを抑制することを含む。この方法は、第二のインスターから放浪第三のインスターまでの発達段階での幼虫と互換性があります。我々は、デンドライトの成長および傷害誘発性の樹状皮質変性を含むショウジョウバエ体体性体性感覚ニューロンの動的プロセスを研究する上で、この方法の応用を実証する。この方法は、幼虫の体壁の近くで起こる他の多くの細胞プロセスを研究するためにも適用することができます。

概要

タイムラプスライブイメージングは、動的細胞プロセスを研究するための強力な方法です。タイムラプス映画によって提供される空間的および時間的情報は、細胞生物学の質問に答えるために重要な詳細を明らかにすることができます。ショウジョウバエ幼虫は、その透明な体壁が内部構造1、2の非侵襲的なイメージングを可能にするので、ライブイメージングを使用した調査のための人気のインビボモデルとなっています。さらに、ショウジョウバエでは解剖学的構造および高分子を蛍光標識する多数の遺伝的ツールが利用可能である。しかし、ショウジョウバエ幼虫の長期経過画像化は困難である。静止した初期胚や子犬とは異なり、ショウジョウバエ幼虫は絶えず動き、ライブイメージングのために固定化が必要である。生きたショウジョウバエ幼虫を固定化する有効な方法は、クロロホルム4でハロカーボン油に取り付けること、イソフルランまたはジクロルボス溶液5を用いた麻酔、およびカバースリップと顕微鏡スライド6との間の圧縮を含む。これらの方法のいくつかは顕微鏡検査に使用されてきたが、いずれも長期のライブイメージングに有効ではない。他の方法は、従来の共焦点顕微鏡または光シート顕微鏡7、8、9を用いて幼虫をクロールする際の身体壁ニューロンのイメージングのために開発された。しかし、これらの方法は、幼虫の動きによる細胞動態のモニタリングには理想的ではありません。

ショウジョウバエ幼虫の長期経過画像化を達成するための新しい方法が開発されました。ポリジメチルシロキサン(PDMS)の「幼虫チップ」を使用すると、ショウジョウバエ幼虫は麻酔なしで特殊なマイクロチャンバーで真空発生吸引を通して効果的に固定化することができる。しかし、この方法は、細胞生物学の研究のための高い時間分解能を提供していないし、それは動物のサイズ10に厳しい制限を有する。麻酔装置を用いた別の方法は、ショウジョウバエ幼虫のライブイメージングを複数の時点で達成し、神経筋接合部11、12、13、14、15、16の研究に応用されている。しかしながら、この方法は、30分を超える連続イメージングを可能にせず、デスフルランを繰り返し使用する必要があり、これは神経活動を阻害し、研究された生物学的プロセスに影響を及ぼす可能性がある17,18である。近年、微小流体装置と凍結麻酔を組み合わせた新しい方法が、短時間(分)19の間、様々なサイズの幼虫を固定化するために使用されている。しかし、この方法は、冷却システムなどの特殊なデバイスを必要とし、固定化の長い期間は、幼虫の繰り返し冷却を必要とします。

ここでは、10時間以上の時間経過画像化と互換性のあるショウジョウバエ幼虫を固定化する汎用性の高い方法を紹介します。この方法は「部分的な取り付けによる幼虫の安定化」(LarvaSPA)と呼び、幼虫のキューティクルをカスタムメイドのイメージングチャンバーでのイメージング用のカバースリップに付着することを含む。このプロトコルは、イメージングチャンバーを作る方法と、様々な発達段階で幼虫を取り付ける方法を説明します。LarvaSPA法では、UV反応性接着剤を使用して、所望のボディセグメントをカバースリップに貼り付けます。PDMS立方体はさらに幼虫に圧力をかけ、脱出を防ぐ。撮像チャンバー内の空気と水分は、イメージング中に部分的に固定化された幼虫の生存を保証します。他の技術よりもLarvaSPAの利点は次のとおりです:(1)それは高い時間的および空間的解像度で何時間も無傷のショウジョウバエ幼虫の連続的なライブイメージングを可能にする最初の方法です。(2)この方法は幼虫のサイズに対する制限が少ない。(3)イメージングチャンバーとPDMS立方体は、最小限のコストで製造することができ、再利用可能です。

幼虫の取り付け方法を説明することに加えて、ショウジョウバエ樹状樹状樹状樹状(da)ニューロンの樹状突起発生および樹状変性を研究するためのその応用例をいくつか紹介する。

プロトコル

1. イメージングチャンバーの作成

  1. 金属フレームは、典型的な機械工場のアルミニウムブロックから構築することができます。フレームの仕様を図 1A に示します。
  2. イメージングチャンバーを構築するには、長いカバースリップ(22mm×50mm)とUV接着剤(図1A)を使用して金属フレームの底部を密封します。手持ち型のUVランプを使用してUV接着剤を硬化させる。

2. PDMSの立方体を作る

  1. PDMS立方体の金型を準備します。
    1. 長方形(80mm×55mm)のペトリ皿または丸い細胞培養板の内面に包装テープの層を取り付けます。2番目のインスター幼虫には1層(厚さ0.063mm)、3番目の星内幼虫には2層(厚さ0.126mm)、後期3番目の星幼虫には3層(0.189mm厚)を使用します(図1B)。
    2. カミソリの刃でテープを特定の幅のストリップに切ります:1層テープの場合は1.5 mm、2層または3層テープの場合は2 mmです。ストリップの幅と厚さは、最終的なPDMS立方体が保持できる幼虫の大きさを決定します。2つのストリップの間に少なくとも5つのmmのスペースを残します。スペースを覆うテープ層を取り外します (図 1B)。
    3. 粘着テープを使用してプレートの内面からほこりを除去します。金型は使用できる状態です。
  2. PDMS ミックスを準備します。
    1. PDMSベース7gと0.7gの硬化剤(10:1比)を小さな容器に完全に混ぜます。
    2. 容器を真空デシケーターに少なくとも15分間入れ、混合物から空気を取り除きます。
    3. PDMS混合物を約5.5gゆっくりと金型に注ぎ、厚さ1~2mmに達します(図1B)。
    4. PDMS混合物を少なくとも15分間真空乾燥器に再び入れ、混合物から残った気泡を除去する。ピペットチップで最後のいくつかの泡を破ります。
    5. 65 °Cの熱インキュベーターで平らな表面でPDMSを2時間硬化させます。
    6. カミソリの刃を使用して、金型の端に沿って硬化PDMSを緩め、金型から取り外します。PDMS を室温で 2 枚の大きな粘着テープの間に保管します。
    7. 初期と後期の第3インスター幼虫の場合、PDMSを8mm x 2mm x 1mmの立方体に切り取り(図1Bの点線に沿って)、テープストリップ(ステップ2.1.2)によって作成された溝を立方体の長辺の中心に配置します(図1B,C)。2番目の星の幼虫の場合は、立方体を8mm x 1mm x 1mmに切ります。

3. 長期経過イメージングのための幼虫の取り付け

  1. 取り付け用の上部カバースリップを準備します。
    1. 幼虫の大きさに合った溝を持つ6つのPDMS立方体を選択してください。ステップ 2.1.1、2.1.2、および 2.2.7 に基づいて、推奨される PDMS の溝とサイズに従ってください。
    2. 粘着テープでPDMSの表面からほこりを取り除きます。
    3. PDMS立方体を後で固定するために、長いカバースリップ(22 mm x 50 mm)に両面テープ(12 mm x 5mm)を4枚取り付けます。両面テープの 2 つの部分の間のスペースは、PDMS 溝の幅と同じにする必要があります。
    4. 各PDMS立方体の溝にUV接着剤の小さな滴(〜1.2 μL)を適用し、カバースリップの両面テープ間のスペースにUV接着剤の6つの小さな滴を追加します。
  2. 幼虫を取り付ける準備をします。
    1. 一対の鉗子を使用して、幼虫を水できれいにして、体表面から食べ物を取り除きます。
    2. 蓋をしない小さな(35mm)ペトリ皿に湿らせたティッシュペーパーの小片にきれいな幼虫を置きます。小さなペトリ皿を、乾燥したティッシュペーパーを入れた大きな(60mm)のペトリ皿に入れます。化学フードで、プラスチック製の移入ピペットを使用して、8~12滴のイソファフルラン(160~240 μL)をドライティッシュペーパーに塗布し、大きなペトリ皿の蓋を閉めます。
    3. 幼虫を監視しながら2~3分待ちます。口のフックが動かなくなったら、大きなペトリ皿から幼虫を取り出します。
  3. 動物をマウントします。
    1. 動物の後側の構造を画像化するには、カバースリップの両面テープの間のUV接着剤の上に固定された幼虫を置き、後方のキューティクルをカバースリップに向けます。
    2. 各幼虫をPDMSブロックで覆い、幼虫の幹をPDMSの溝に収めます。PDMSの溝の外に幼虫の頭と尾を残します。接着剤で幼虫の尖塔をふさぐのは避けてください。
    3. PDMSブロックの端を溝に力を加えずに両面テープに押し込みます。幼虫の尾をそっと引っ張ってPDMSの下のキューティクルを平らにします。
    4. 高い設定(約0.07 mW/mm2)で手持ち式のUVランプを使用して、UV接着剤を4分間硬化します。
      注意: UVランプを使用している間、安全メガネで目を保護してください。
    5. カバースリップを上下逆にして、手順 3.3.4 を繰り返します。
    6. レンズ紙(15mm×30mm)を20μL~30μLの水で湿らせた。湿ったレンズ用紙を撮像室の底部に置きます(図1A,D)。
    7. 幼虫がチャンバーの内側に面するように、カバースリップをチャンバーに置きます。UV接着剤(図1A、D)を使用して、カバースリップの両端を金属表面に接着します。幼虫の側側は共焦点顕微鏡下でイメージングの準備ができています (図 1E)。

4. イメージング

  1. 適切な顕微鏡による幼虫の画像。このプロトコル (図 2、図 3、 ビデオS2、ビデオ S3、ビデオ S4) に示されているすべての結果は、40 x (1.30 NA) オイルの目的を持つ共焦点システムを使用して取得されました。

5. イメージングチャンバーとPDMS立方体の回収

  1. 画像化後、レンズ用紙を使用して上部のカバースリップのオイルを取り除きます。カバースリップとカミソリの刃で金属フレームの間のスペースに切り込んで、トップカバースリップを金属フレームから取り外します。イメージングチャンバーは再利用の準備ができています。
  2. PDMSの立方体を、上のカバースリップから鉗子で取り外します。粘着性のテープにPDMS立方体を転がして、接着剤の残留物やほこりを取り除きます。PDMSの立方体は再使用の準備ができている。

結果

幼虫のイメージ投射室は、カスタムメイドの金属フレームと2つのカバースリップを一緒に接着することによって構築されます。金属フレームの設計は、図1Aに指定されています。チャンバー内のショウジョウバエ幼虫は、UV接着剤とPDMS立方体の助けを借りてトップカバースリップに接着されます。PDMS立方体の溝と、立方体が取り付けられた両面テープは、幼?...

ディスカッション

ここでは、長期経過イメージングのために生きたショウジョウバエ幼虫を取り付ける汎用性の高い方法であるLarvaSPAについて説明します。この方法は幼虫の回復や再装着を必要とせず、中断のないイメージングを可能にする。従って、樹状変性や再生など、完了までに数時間かかる生物学的プロセスを追跡するのに理想的です。この方法は、細胞内カルシウムの動態や微小管の成長な?...

開示事項

著者らは競合する利益を宣言していない。

謝辞

以前のバージョンのLarvaSPAメソッドを確立してくれたリンフェン・タンに感謝します。イメージングチャンバーの以前のプロトタイプを作るためのコーネルオリンホールマシンショップでグレンスワン。金属フレームを構築し、PDMS立方体を作るための提案を提供するためのフィリップ・イザーマン;コーネル BRC 顕微鏡へのアクセスのための施設 (NIH 助成金 S10OD018516)原稿の批判的な読書のためのマリア・サパー。この作品は、H.J.に授与されたコーネル・フェローシップによって支えられ、H.J.に授与されました。C.H.H.J.とC.H.に授与されたコーネルのスタートアップファンドとNIH助成金(R01NS099125とR21OD023824)は、プロジェクトを考案し、実験を設計しました。H.J.が実験を行った。H.JとC.H.は原稿を書いた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
6061 Aluminum barsMcMaster-Carr9246K421
3M double-sided tapeTed Pella, Inc.16093
3M Scotch Packaging tape3M1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 ForcepsFisher Scientific50-241-34
Glass coverslipAzer Scientific1152250
IsofluraneMidwest Veterinary Supply193.33161.3
Leica Confocal MicroscopeLeicaSP8 equipped with a resonant scanner
Lens paperBerkshireLN90.0406.24
Petri dishes (medium)VWR25373-085
Petri dishes (small)VWR10799-192
Razor bladeTed Pella, Inc.121-20
Rectangular petri dishVWR25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit)Electron Microscopy Sciences24236-10
Transferring pipetteThermo Fisher Scientific1371126
UV glueNorland products#6106, NOA 61Refractive Index 1.56
UV lamp (Workstar 2003)MaxxeonMXN02003
Vacuum desiccatorElectron Microscopy Sciences71232
WipesKimberly-ClarkKimwipes

参考文献

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