JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, drosophila larvalarının sağlam canlı hayvanlarda 10 saatten daha uzun süre kesintisiz zaman atlamalı görüntüleme elde etmek için bir yöntem inşama yöntemini açıklamaktadır. Bu yöntem larva gövde duvarına yakın birçok biyolojik süreci görüntülemek için kullanılabilir.

Özet

Canlı görüntüleme hücre biyolojisi sorularını araştırmak için değerli bir yaklaşımdır. Larva vücut duvarı ve iç organların çoğu saydam olduğu için Drosophila larvaözellikle in vivo canlı görüntüleme için uygundur. Ancak, 30 dakikadan uzun süre bozulmamış Drosophila larvalarının sürekli canlı görüntülemesi, invaziv olarak hareketsiz hale getirmek uzun süre larvaları hareketsiz hale getirmek zor olduğu için zor olmuştur. Burada larvaSPA adı verilen ve 10 saatten uzun süre yüksek temporal ve mekansal çözünürlüğe sahip canlı Drosophila larvalarının sürekli görüntülenmesine olanak tanıyan larvaspa adı verilen bir montaj yöntemi salıyoruz. Bu yöntem, uv-reaktif tutkal kullanarak coverslip'e kısmen larva takmayı ve ayrıca polidimethylsiloxane (PDMS) bloğu kullanarak larva hareketini kısıtlamayı içerir. Bu yöntem ikinci instar dan üçüncü instar wandering gelişim aşamalarında larvalar ile uyumludur. Drosophila somatosensoriyel nöronların dinamik süreçlerini incelerken bu yöntemin uygulamalarını gösteriyoruz, buna dendrit büyümesi ve yaralanmaya bağlı dendrit dejenerasyonu da dahil. Bu yöntem aynı zamanda larva gövde duvarı yakınında meydana gelen diğer birçok hücresel süreçleri incelemek için uygulanabilir.

Giriş

Hızlandırılmış canlı görüntüleme dinamik hücresel süreçleri incelemek için güçlü bir yöntemdir. Zaman atlamalı filmlerin sağladığı mekansal ve zamansal bilgiler hücre biyolojisi sorularını yanıtlamak için önemli ayrıntıları ortaya çıkarabilir. Şeffaf vücut duvarı iç yapıların noninvaziv görüntüleme için izin verir çünkü Drosophila larva canlı görüntüleme kullanarak araştırmalar için popüler bir in vivo modeli olmuştur1,2. Buna ek olarak, çok sayıda genetik araçlar Drosophila floresanca etiket anatomik yapılar ve makromoleküllermevcuttur 3. Ancak, Drosophila larvalarının uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesi zordur. Sabit erken embriyolar veya pupa aksine, Drosophila larvaları sürekli hareket, canlı görüntüleme için immobilizasyon gerektiren. Canlı Drosophila larvaları hareketsizleştirmenin etkili yolları arasında kloroform4ile halokarbon yağımontajı, izofluran veya Dichlorvos solüsyonukullanılarakanestezi 5 , ve kapak kaymave mikroskop slayt ı arasında sıkıştırma6. Bu yöntemlerden bazıları mikroskopi için kullanılmış olsa da, bunların hiçbiri uzun süreli canlı görüntüleme de etkili değildir. Konvansiyonel konfokal mikroskopi veya ışık sayfası mikroskobu7,8,9kullanılarak tarama larvalarında vücut duvarı nöronlarının görüntülenmesi için başka yöntemler geliştirilmiştir. Ancak, bu yöntemler larvaların hareketi nedeniyle hücresel dinamikleri izlemek için ideal değildir.

Drosophila larvalarının uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesini sağlamak için yeni yöntemler geliştirilmiştir. Bir polidimethylsiloxane kullanarak (PDMS) "larva çipi", Drosophila larva etkili anestezi olmadan özel bir mikrohazret vakum üretilen emme yoluyla immobilize edilebilir. Ancak, bu yöntem hücre biyolojisi çalışmaları için yüksek zamansal çözünürlük sunmuyor ve hayvan boyutu üzerinde sıkı sınırlamalar vardır10. Bir anestezi cihazı kullanarak başka bir yöntem birden fazla zaman noktalarında Drosophila larvacanlı görüntüleme elde ve nöromüsküler kavşaklar 11 çalışma için uygulanmıştır11,12,13,14,15,16. Ancak, bu yöntem aynı zamanda 30 dakikadan daha uzun süre sürekli görüntüleme için izin vermez ve tekrar tekrar desfluran kullanarak gerektirir, hangi nöral aktiviteyi inhibe edebilir ve biyolojik süreci etkileyebilir17,18. Son zamanlarda, mikroakışkan cihaz ve kriyoanestezi birleştiren yeni bir yöntem kısa süreler için çeşitli boyutlarda larvaları hareketsiz leştirmek için kullanılmıştır (dakika)19. Ancak, bu yöntem bir soğutma sistemi ve immobilizasyon uzun süre lervalar tekrarlanan soğutma gerektirir gibi özel cihazlar gerektirir.

Burada 10 saatten daha uzun süre kesintisiz zaman atlamalı görüntüleme ile uyumlu Drosophila larvaları hareketsiz hale getirmenin çok yönlü bir yöntemini salıyoruz. "Kısmi Bağlanmaya Göre Larva Stabilizasyonu" (LarvaSPA) dediğimiz bu yöntem, larva miğanınözel olarak yapılmış bir görüntüleme odasında görüntüleme için bir kapak kaymasına yapıştırılmasını içerir. Bu protokol, görüntüleme odasının nasıl yapılacağını ve larvaların çeşitli gelişim evrelerinde nasıl monte edilebildiğini açıklar. LarvaSPA yönteminde, istenilen gövde segmentleri UV-reaktif tutkal kullanılarak kapak kaymasına yapıştırılır. Bir PDMS kübik ayrıca larvalara basınç uygulayarak kaçışı önler. Görüntüleme odasındaki hava ve nem, görüntüleme sırasında kısmen hareketsiz olan larvaların hayatta kalmasını sağlar. LarvaSPA'nın diğer tekniklere göre avantajları şunlardır: (1) Yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip, bozulmamış Drosophila larvalarının saatlerce sürekli canlı görüntülenmesine olanak sağlayan ilk yöntemdir; (2) Yöntemin larva boyutu üzerinde daha az sınırlaması vardır; (3) Görüntüleme odası ve PDMS kübikler en az maliyetle imal edilebilir ve yeniden kullanılabilir.

Larva montaj yöntemini tanımlamanın yanı sıra, Drosophila dendritik arborization (da) nöronlarının dendritgelişimi ve dendriter dejenerasyonu için uygulamanın birkaç örneğini savuruyoruz.

Protokol

1. Görüntüleme odasının yapılması

  1. Metal çerçeve tipik bir makine mağazasında bir alüminyum blok inşa edilebilir. Çerçevenin özellikleri Şekil 1A'dagösterilmiştir.
  2. Görüntüleme odasını oluşturmak için metal çerçevenin altını uzun bir kapak kayması (22 mm x 50 mm) ve UV tutkal(Şekil 1A)kullanarak kapatın. Uv tutkalını el yapımı uv lambası kullanarak tedavi edin.

2. PDMS kübik yapma

  1. PDMS kübikler için kalıp hazırlayın.
    1. Ambalaj bandı katmanlarını dikdörtgen (80 mm x 55 mm) Petri kabının veya yuvarlak hücre kültür plakasının iç yüzeyine takın. İkinci instar larvaları için bir tabaka (0,063 mm kalınlığında), erken üçüncü yıldız larvaları için 2 kat (0,126 mm kalınlığında) veya geç üçüncü yıldız larvaları için üç kat (0,189 mm kalınlığında) kullanın (Şekil 1B).
    2. Bandı jiletle belirli genişlikte şeritler halinde kesin: 1 katmanlı bant için 1,5 mm ve 2 katmanlı veya 3 katmanlı bant için 2 mm. Şeridin genişliği ve kalınlığı, son PDMS kübikinin tutabileceği larvaların boyutunu belirler. İki şerit arasında en az 5 mm boşluk bırakın. Alanı kaplayan bant katmanlarını çıkarın (Şekil 1B).
    3. Yapışkan bant kullanarak plakanın iç yüzeyindeki tozu çıkarın. Kalıp kullanıma hazırdır.
  2. PDMS karışımını hazırlayın.
    1. Küçük bir kapta 7 g PDMS tabanını ve 0,7 g kür leme maddesini (10:1 oranı) iyice karıştırın.
    2. Karışımdan havayı çıkarmak için kabı en az 15 dakika vakum lu bir kurutucuya yerleştirin.
    3. Yavaş yavaş 1-2 mm kalınlığı(Şekil 1B)ulaşmak için kalıp üzerine PDMS karışımı yaklaşık 5,5 g dökün.
    4. PdMS karışımını, karışımdan kalan hava kabarcıklarını temizlemek için en az 15 dakika boyunca tekrar vakum kurutucuya yerleştirin. Bir pipet ucu ile son birkaç kabarcıklar break.
    5. PDMS'yi 65 °C'de bir ısı kuluçka makinesinde düz bir yüzeyde 2 saat boyunca tedavi edin.
    6. Küfün kenarı boyunca kürlenmiş PDMS gevşetmek ve kalıptan ayırmak için bir jilet kullanın. PDMS'yi oda sıcaklığında iki parça büyük yapışkan bant arasında saklayın.
    7. Erken ve geç üçüncü instar larvaları için PDMS'yi küboidin uzun tarafının ortasına bant şeridi (adım 2.1.2) tarafından oluşturulan oluk konumlandırarak 8 mm x 2 mmx 1 mm kübik küboidler (Şekil 1B'dekinoktalı çizgiler boyunca) kesin. İkinci yıldız larvaları için küboidi 8 mm x 1 mm x 1 mm'ye kesin.

3. Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme için larva montajı

  1. Montaj için üst kapak kaymasını hazırlayın.
    1. Larvaların boyutlarına uyan oluklara sahip altı PDMS kübik seçin. 2.1.1, 2.1.2 ve 2.2.7 adımlarını temel alan önerilen PDMS ritmini ve boyutunu izleyin.
    2. PDMS'nin yüzeyindeki tozu yapışkan bantla çıkarın.
    3. Daha sonra PDMS kübiklerini sabitlemek için uzun bir kapak kaymasına (22 mm x 50 mm) dört adet çift taraflı bant (12 mm x 5 mm) takın. Çift taraflı teyp iki adet arasındaki boşluklar PDMS oluk genişliği ile aynı olmalıdır.
    4. Her PDMS cuboid oluk içine UV tutkal küçük bir damla (~ 1.2 μL) uygulayın ve coverslip üzerinde çift taraflı bant arasındaki boşluğa UV tutkal altı küçük damla ekleyin.
  2. Larvaları montaja hazırlayın.
    1. Bir çift forceps kullanarak, vücut yüzeyinden gıda kaldırmak için su daki larvaları temizleyin.
    2. Bir kapak olmadan küçük bir (35 mm) Petri çanak nemlendirilmiş kağıt küçük bir parça üzerinde temiz larvayerleştirin. Küçük Petri kabını kuru mendil kağıdı içeren büyük (60 mm) petri kabına yerleştirin. Kimyasal bir başlıkta, plastik transfer pipet kullanarak kuru mendil kağıdına 8-12 damla (160-240 μL) uygulayın ve büyük Petri kabının kapağını kapatın.
    3. Larvaları izlerken 2-3 dk bekleyin. Ağız kancaları hareket etmeyi bıraktıktan sonra büyük Petri kabından larvaları çıkar.
  3. Hayvanları dağın.
    1. Hayvanın sırt tarafındaki yapıları görüntülemek için, hareketsiz edilmiş larvaları kapak kaymasına bakan dorsal mite ile kapak taki çift taraflı bant arasındaki UV tutkalının üzerine yerleştirin.
    2. Her larvayı bir PDMS bloğuyla kapatın ve larvanın gövdesini PDMS'nin oluğuna sığdırın. Larvanın başını ve kuyruğunu PDMS oluğunun dışında bırakın. Larvanın spiracles'ini tutkalla engellemekten kaçının.
    3. PDMS bloğunun uçlarına, oluk üzerinde kuvvet uygulamadan çift taraflı banda bastırın. PDMS altında miğde düzleştirmek için larva kuyruğunu yavaşça çekin.
    4. Yüksek ayarda (yaklaşık 0,07 mW/mm2)bir el UV lambası kullanarak 4 dakika boyunca UV tutkal Cure.
      DİkKAT: UV lambasını kullanırken gözleri güvenlik gözlükleri ile koruyun.
    5. Kapağı ters çevirin ve 3.3.4 adımını tekrarlayın.
    6. 20 μL-30 μL su ile küçük bir mercek kağıdını (15 mm x 30 mm) nemlendirin. Nemlendirilmiş mercek kağıdını görüntüleme odasının altına yerleştirin(Şekil 1A,D).
    7. Larvalar odanın içine bakacak şekilde kapak fişini odaya yerleştirin. Kapağın her iki ucunu da UV tutkal kullanarak metal yüzeye yapıştırın(Şekil 1A,D). Larvaların dorsal tarafı konfokal mikroskop altında görüntülemeye hazırdır (Şekil 1E).

4. Görüntüleme

  1. Uygun bir mikroskop ile görüntü larvaları. Bu protokolde gösterilen tüm sonuçlar(Şekil 2, Şekil 3, Video S2, Video S3, ve Video S4) 40x (1.30 NA) yağ hedefine sahip bir konfokal sistem kullanılarak elde edildi.

5. Görüntüleme odası ve PDMS kübiklerinin iyileşmesi

  1. Görüntülemeden sonra, bir lens kağıdı kullanarak üst kapak üzerinde yağ çıkarın. Üst kapağı metal çerçeveden ayırarak kapak ve metal çerçeve arasındaki boşluğu bir jiletle ayırın. Görüntüleme odası yeniden kullanıma hazır.
  2. PDMS kübiklerini üst kapaktan forceps ile ayırın. Tutkal kalıntısı ve toz kaldırmak için yapışkan bant üzerinde PDMS cuboids rulo. PDMS kübikleri yeniden kullanıma hazır.

Sonuçlar

Larva görüntüleme odası, özel yapım metal çerçeve ve iki kapak birbirine yapıştırılarak oluşturulur. Metal çerçevenin tasarımı Şekil 1A'dabelirtilmiştir. Oda içinde Drosophila larvaları UV tutkal ve PDMS kübikler yardımı ile üst coverslip yapıştırılır. PDMS kübik üzerindeki oluk ve kübik bant, larvaları tutmak için boşluk oluşturmak için bağlanır (Şekil 1B,C). PDMS ayrıca larva gövde duvarını düzleş...

Tartışmalar

Burada LarvaSPA, uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme için canlı Drosophila larvamontaj çok yönlü bir yöntem açıklar. Bu yöntem, larvaların kurtarılmasını veya yeniden monte edilmesini gerektirmez ve kesintisiz görüntüleme sağlar. Bu nedenle, dendrite dejenerasyonu ve rejenerasyon gibi tamamlanması saatler alan biyolojik süreçleri izlemek için idealdir. Bu yöntem aynı zamanda hücre içi kalsiyum dinamikleri ve mikrotübül büyümesi gibi hücre altı olayları görüntüleme i...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Teşekkürler

Biz LarvaSPA yönteminin önceki bir sürümünü kurmak için Lingfeng Tang teşekkür; Glenn Swan Cornell Olin Hall Machine mağazasında görüntüleme odasının önceki prototipleri yapmak için; Philipp Isermann metal çerçeveler inşa etmek ve PDMS kübik ler yapma konusunda öneriler sunmak için; Mikroskoplara erişim için Cornell BRC Görüntüleme tesisi (NIH hibe S10OD018516 tarafından finanse edilmektedir); Maria Sapar makalenin eleştirel okuması için. Bu çalışma, H.J.'e verilen Cornell Bursu ile desteklenmiştir; C.H.J. ve C.H.'ye verilen Bir Cornell başlangıç fonu ve NIH hibeleri (R01NS099125 ve R21OD023824) projeyi tasarladı ve deneyleri tasarladı. Deneyleri H.J. yaptı. Taslağı H.J. ve C.H. yazdı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
6061 Aluminum barsMcMaster-Carr9246K421
3M double-sided tapeTed Pella, Inc.16093
3M Scotch Packaging tape3M1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 ForcepsFisher Scientific50-241-34
Glass coverslipAzer Scientific1152250
IsofluraneMidwest Veterinary Supply193.33161.3
Leica Confocal MicroscopeLeicaSP8 equipped with a resonant scanner
Lens paperBerkshireLN90.0406.24
Petri dishes (medium)VWR25373-085
Petri dishes (small)VWR10799-192
Razor bladeTed Pella, Inc.121-20
Rectangular petri dishVWR25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit)Electron Microscopy Sciences24236-10
Transferring pipetteThermo Fisher Scientific1371126
UV glueNorland products#6106, NOA 61Refractive Index 1.56
UV lamp (Workstar 2003)MaxxeonMXN02003
Vacuum desiccatorElectron Microscopy Sciences71232
WipesKimberly-ClarkKimwipes

Referanslar

  1. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
  2. Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
  3. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
  4. Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
  5. Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
  6. Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
  7. He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
  8. Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
  9. Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
  10. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
  11. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
  12. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
  13. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
  14. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
  15. Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
  16. Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
  17. Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, 489-502 (2004).
  18. Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
  19. Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
  20. Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
  21. Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
  22. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  23. Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
  24. Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
  25. Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
  26. Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
  27. Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
  28. Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
  29. Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
  30. Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
  31. Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 156uzun s reli h zland r lm g r nt lemecanl g r nt lemein vivo g r nt lemelarvaSPAkonfokal mikroskopiDrosophila larvasv cut duvardendritik arborizasyonda n ronlarn rodejenerasyonn rogeli imh cre biyolojisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır