LarvaSPA, un metodo per montare la larva della Drosophila per l'imaging time-Lapse a lungo termine

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per montare larve di Drosophila per ottenere più di 10 h di immagini ininterrotte intime in animali vivi intatti. Questo metodo può essere utilizzato per immaginare molti processi biologici vicino alla parete del corpo larvale.

Abstract

L'imaging dal vivo è un approccio prezioso per studiare le domande sulla biologia cellulare. La larva della Drosophila è particolarmente adatta per l'imaging vivo in vivo perché la parete larvale del corpo e la maggior parte degli organi interni sono trasparenti. Tuttavia, l'imaging live continuo di larve di Drosophila intatte per più di 30 min è stato impegnativo perché è difficile immobilizzare le larve per lungo tempo. Qui presentiamo un metodo di montaggio larvale chiamato LarvaSPA che consente l'imaging continuo di larve di Drosophila vive con alta risoluzione temporale e spaziale per più di 10 ore. Questo metodo prevede l'attaccamento parziale delle larve al coperchio utilizzando una colla UV-reattiva e inoltre un movimento larvale che trattiene utilizzando un blocco polidimetilsiloxane (PDMS). Questo metodo è compatibile con le larve in fase di sviluppo dal secondo instar al terzo instar errante. Dimostriamo l'applicazione di questo metodo nello studio dei processi dinamici dei neuroni somatosensoriali della Drosophila, tra cui la crescita dei dendrite e la degenerazione dei dendriti indotta da lesioni. Questo metodo può essere applicato anche per studiare molti altri processi cellulari che avvengono vicino alla parete del corpo larvale.

Introduzione

L'imaging live time-lapse è un metodo potente per studiare i processi cellulari dinamici. Le informazioni spaziali e temporali fornite dai filmati time-lapse possono rivelare dettagli importanti per rispondere alle domande della biologia cellulare. La larva della Drosophila è stata un modello in vivo diffuso per le indagini utilizzando l'imaging dal vivo perché la sua parete del corpo trasparente consente l'imaging non invasivo delle strutture interne^1,2. Inoltre, in Drosophila sono disponibili numerosi strumenti genetici per etichettare fluorescentmente strutture anatomiche e macromolecole³. Tuttavia, l'imaging a lungo termine delle larve della Drosophila è impegnativo. A differenza degli embrioni precoci stazionari o delle pupe, le larve di Drosophila si muovono costantemente, rendendo necessaria l'immobilizzazione per l'imaging dal vivo. Modi efficaci di immobilizzare le larve di Drosophila vive includono il montaggio in olio di alocarbonio con cloroformio⁴, anestesizzando utilizzando la soluzione isoflurane o Dichlorvos⁵, e la compressione tra il coperchio e il microscopio⁶. Anche se alcuni di questi metodi sono stati utilizzati per la microscopia, nessuno di essi è efficace per l'imaging dal vivo a lungo termine. Altri metodi sono stati sviluppati per l'imaging di neuroni della parete del corpo nelle larve striscianti utilizzando la microscopia confocale convenzionale o la microscopia a fogli di luce^7,8^,9. Tuttavia, questi metodi non sono ideali per monitorare la dinamica cellulare a causa del movimento delle larve.

Sono stati sviluppati nuovi metodi per ottenere l'imaging a lungo termine delle larve della Drosophila. Utilizzando un "chip larva" polidimetilsiloxane (PDMS), le larve di Drosophila possono essere efficacemente immobilizzate attraverso un'aspirazione generata dal vuoto in una microcamera specializzata senza anestesizzazione. Tuttavia, questo metodo non offre alta risoluzione temporale per gli studi di biologia cellulare e ha severe limitazioni sulla dimensione animale¹⁰. Un altro metodo che utilizza un dispositivo di anestesizzazione ha raggiunto l'imaging dal vivo delle larve di Drosophila in più punti temporali ed è stato applicato per studiare giunzioni neuromuscolari^11,12,13,14^,15,16. Tuttavia, questo metodo inoltre non consente l'imaging continuo per più di 30 min e richiede l'uso di desflurane ripetutamente, che può inibire l'attività neurale e influenzare il processo biologico studiato^17,18. Recentemente, un nuovo metodo che combina dispositivo microfluidico e crioanestesia è stato utilizzato per immobilizzare larve di varie dimensioni per brevi periodi di tempo (minuti)¹⁹. Tuttavia, questo metodo richiede dispositivi specializzati come un sistema di raffreddamento e lunghi periodi di immobilizzazione richiedono il raffreddamento ripetuto delle larve.

Qui presentiamo un metodo versatile per immobilizzare le larve di Drosophila che è compatibile con l'imaging time-lapse ininterrotto per più di 10 h. Questo metodo, che chiamiamo "Stabilizzazione larva per attaccamento parziale" (LarvaSPA), prevede l'adesione della cuticola larvale a un coperchio per l'imaging in una camera di imaging costruita su misura. Questo protocollo descrive come fare la camera di imaging e come montare le larve in una varietà di stadi di sviluppo. Nel metodo LarvaSPA, i segmenti del corpo desiderati vengono apposti sul coperchio utilizzando una colla UV-reattiva. Un cuboide PDMS applica inoltre pressione alle larve, impedendo la fuga. L'aria e l'umidità nella camera di imaging assicurano la sopravvivenza delle larve parzialmente immobilizzate durante l'imaging. I vantaggi di LarvaSPA rispetto ad altre tecniche includono quanto segue: (1) È il primo metodo che consente l'imaging dal vivo continuo di larve di Drosophila intatte per ore ad alta risoluzione temporale e spaziale; (2) Il metodo ha meno limitazioni sulle dimensioni della larva; (3) La camera di imaging e i cuboidi PDMS possono essere fabbricati ad un costo minimo e sono riutilizzabili.

Oltre a descrivere il metodo di montaggio larvale, forniamo diversi esempi della sua applicazione per studiare lo sviluppo dei dendriti e la degenerazione dei dendrite dei neuroni dell'arborizzazione dendritica (da) della Drosophila.

Protocollo

1. Fare la camera di imaging

1. Il telaio in metallo può essere costruito da un blocco di alluminio in un tipico negozio di macchine. Le specifiche del telaio sono illustrate nella Figura 1A.
2. Per costruire la camera di imaging, sigillare la parte inferiore del telaio metallico utilizzando un long coverslip (22 mm x 50 mm) e colla UV (Figura 1A). Curare la colla UV utilizzando una lampada UV portatile.

2. Realizzazione di cuboidi PDMS

1. Preparare lo stampo per i cuboidi PDMS.
   1. Fissare strati di nastro da imballaggio alla superficie interna di una piastra di Petri rettangolare (80 mm x 55 mm) o di una piastra di coltura a cellule rotonde. Utilizzare uno strato (spesso 0,063 mm) per le larve a stella seconda, 2 strati (0,126 mm di spessore) per le prime larve della terza stella o tre strati (spesso0,189 mm) per larve della terza stella(Figura 1B).
   2. Tagliare il nastro in strisce di larghezza specifica con una lama da rasoio: 1,5 mm per il nastro a 1 strato e 2 mm per nastro a 2 strati o 3 strati. La larghezza e lo spessore della striscia determineranno la dimensione delle larve che il cuboide PDMS finale può contenere. Lasciare almeno uno spazio di 5 mm tra le due strisce. Rimuovere gli strati del nastro che coprono lo spazio (Figura 1B).
   3. Rimuovere la polvere dalla superficie interna della piastra utilizzando il nastro adesivo. Lo stampo è pronto per l'uso.
2. Preparare il mix PDMS.
   1. Mescolare 7 g di base PDMS e 0,7 g di agente di polimerità (rapporto 10:1) accuratamente in un piccolo contenitore.
   2. Mettere il contenitore in un desiccatore sottovuoto per almeno 15 min per rimuovere l'aria dalla miscela.
   3. Versare lentamente circa 5,5 g di miscela PDMS sullo stampo per raggiungere uno spessore di 1–2 mm (Figura 1B).
   4. Mettere nuovamente la miscela PDMS nel desiccatore sottovuoto per almeno 15 minuti per rimuovere le bolle d'aria rimanenti dalla miscela. Rompere le ultime bolle con una punta pipetta.
   5. Curare il PDMS su una superficie piana in un'incubatrice di calore a 65 gradi centigradi per 2 ore.
   6. Utilizzare una lama di rasoio per allentare il PDMS curato lungo il bordo dello stampo e staccarlo dallo stampo. Conservare il PDMS tra due pezzi di grande nastro adesivo a temperatura ambiente.
   7. Per le larve a stella presto e tardiva, tagliare il PDMS in cuboidi 8 mm x 2 mm x 1 mm (lungo le linee tratteggiate nella Figura 1B) posizionando la scanalatura creata dalla striscia di nastro (passaggio 2.1.2) al centro del lato lungo del cuboide (Figura 1B,C). Per le seconde larve instar, tagliare il cuboide a 8 mm x 1 mm x 1 mm.

3. Larve di montaggio per l'imaging time-lapse a lungo termine

1. Preparare il coperchio superiore per il montaggio.
   1. Scegli sei cuboidi PDMS con scanalature corrispondenti alle dimensioni delle larve. Seguire la scanalatura e le dimensioni consigliate di PDMS in base ai passaggi 2.1.1, 2.1.2 e 2.2.7.
   2. Rimuovere la polvere dalla superficie del PDMS con nastro adesivo.
   3. Attaccare quattro pezzi di nastro a doppia lato (12 mm x 5 mm) su un long coverslip (22 mm x 50 mm) per fissare i cuboidi PDMS in un secondo momento. Gli spazi tra i due pezzi di nastro a doppio lato devono essere uguali alla larghezza della scanalatura PDMS.
   4. Applicare una piccola goccia di colla UV nella scanalatura di ogni cuboide PDMS e aggiungere sei piccole gocce di colla UV nello spazio tra il nastro a due lati sulla copertina.
2. Preparare le larve per il montaggio.
   1. Utilizzando un paio di pinze, pulire le larve in acqua per rimuovere il cibo dalla superficie del corpo.
   2. Posizionare le larve pulite su un piccolo pezzo di carta velina inumidita in un piccolo piatto petri (35 mm) senza coperchio. Mettere il piccolo piatto Petri in un grande piatto Petri (60 mm) contenente un pezzo di carta velina secca. In un cappuccio chimico, applicare 8-12 gocce (160-240) di isoflurane sulla carta velina secca utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica e chiudere il coperchio del grande piatto Petri.
   3. Attendere 2-3 min durante il monitoraggio delle larve. Estrarre le larve dal grande piatto Petri una volta che la bocca si aggancia smette di muoversi.
3. Montare gli animali.
   1. Per immaginare strutture sul lato dell'animale, posizionare le larve immobilizzate sulla colla UV tra il nastro a due lati sulla coverslip con la cuticola dorsale rivolta verso la coverslip dorsale.
   2. Coprire ogni larva con un blocco PDMS e inserire il tronco della larva nella scanalatura del PDMS. Lasciare la testa e la coda della larva all'esterno della scanalatura PDMS. Evitare di bloccare gli spiracoli della larva dalla colla.
   3. Premere verso il basso sulle estremità del blocco PDMS sul nastro fronte/retro senza applicare la forza sulla scanalatura. Tirare delicatamente sulla coda della larva per appiattire la cuticola sotto la PDMS.
   4. Curare la colla UV per 4 min utilizzando una lampada UV portatile all'altezza (a circa 0,07 mW/mm²).
      AVVISO: Proteggere gli occhi con occhiali di sicurezza durante l'utilizzo della lampada UV.
   5. Capovolgere la coverslip a testa in giù e ripetere il passaggio 3.3.4.
   6. Inumidire un piccolo pezzo di carta lente (15 mm x 30 mm) con 20-L-30 l'acqua. Posizionare la carta lente inumidita nella parte inferiore della camera di imaging(Figura 1A,D).
   7. Posizionare il coperchio sulla camera in modo che le larve siano rivolte verso l'interno della camera. Aderire entrambe le estremità del coperchio alla superficie metallica utilizzando colla UV (Figura 1A,D). Il lato dorsale delle larve è pronto per l'imaging al microscopio confocale (Figura 1E).

4. Imaging

1. Larve di immagine con un microscopio appropriato. Tutti i risultati illustrati in questo protocollo (Figura 2, Figura 3, Video S2, Video S3e Video S4) sono stati acquisiti utilizzando un sistema confocale con un obiettivo di olio 40x (1.30 NA).

5. Recupero della camera di imaging e dei cuboidi PDMS

1. Dopo l'imaging, rimuovere l'olio sul coperchio superiore utilizzando una carta lente. Staccare il coperchio superiore dal telaio metallico tagliando nello spazio tra il coperchio e il telaio metallico con una lama di rasoio. La camera di imaging è pronta per il riutilizzo.
2. Scollegare i cuboidi PDMS dalla vessilla superiore con pinze. Arrotolare i cuboidi PDMS su nastro adesivo per rimuovere residui di colla e polvere. I cuboidi PDMS sono pronti per il riutilizzo.

Risultati

La camera di imaging della larva è costruita incollando un telaio metallico su misura e due copricoperture insieme. La progettazione del telaio metallico è specificata nella Figura 1A. Le larve di drosophila all'interno della camera sono aderitate alla coverslip superiore con l'aiuto di colla UV e cuboidi PDMS. La scanalatura sul cuboide PDMS e il nastro a due lati del cuboide è attaccato per creare lo spazio per contenere le larve (Figura 1B,C

Discussione

Qui descriviamo LarvaSPA, un metodo versatile per montare larve di Drosophila vive per l'imaging time-lapse a lungo termine. Questo metodo non richiede il recupero o il rimontaggio delle larve, consentendo l'imaging ininterrotto. È quindi ideale per tracciare i processi biologici che richiedono ore per essere completati, come la degenerazione e la rigenerazione dei dendriti. Questo metodo può essere utilizzato anche per l'imaging di dinamiche intracellulari del calcio ed eventi subcellulari come la crescita di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6061 Aluminum bars	McMaster-Carr	9246K421
3M double-sided tape	Ted Pella, Inc.	16093
3M Scotch Packaging tape	3M		1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 Forceps	Fisher Scientific	50-241-34
Glass coverslip	Azer Scientific	1152250
Isoflurane	Midwest Veterinary Supply	193.33161.3
Leica Confocal Microscope	Leica	SP8 equipped with a resonant scanner
Lens paper	Berkshire	LN90.0406.24
Petri dishes (medium)	VWR	25373-085
Petri dishes (small)	VWR	10799-192
Razor blade	Ted Pella, Inc.	121-20
Rectangular petri dish	VWR	25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit)	Electron Microscopy Sciences	24236-10
Transferring pipette	Thermo Fisher Scientific	1371126
UV glue	Norland products	#6106, NOA 61	Refractive Index 1.56
UV lamp (Workstar 2003)	Maxxeon	MXN02003
Vacuum desiccator	Electron Microscopy Sciences	71232
Wipes	Kimberly-Clark	Kimwipes