LarvaSPA, Eine Methode zur Montage von Drosophila Larva für Langzeit-Zeitraffer-Imaging

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Montage von Drosophila-Larven, um länger als 10 h ununterbrochene Zeitraffer-Bildgebung bei intakten lebenden Tieren zu erreichen. Diese Methode kann verwendet werden, um viele biologische Prozesse in der Nähe der Larvenkörperwand abzubilden.

Zusammenfassung

Live Imaging ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung zellbiologischer Fragen. Die Drosophila Larve eignet sich besonders für in vivo Live-Bildgebung, da die Larvenkörperwand und die meisten inneren Organe transparent sind. Die kontinuierliche Live-Bildgebung intakter Drosophila-Larven über 30 min war jedoch eine Herausforderung, da es schwierig ist, Larven lange Zeit nicht invasiv zu immobilisieren. Hier präsentieren wir eine Larvenmontagemethode namens LarvaSPA, die eine kontinuierliche Bildgebung von lebenden Drosophila-Larven mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung für länger als 10 Stunden ermöglicht. Bei diesem Verfahren werden Larven teilweise mit einem UV-reaktiven Kleber am Deckschein befestigt und zusätzlich die Larvenbewegung mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Block zurückgeschraubt. Diese Methode ist mit Larven in Entwicklungsstadien vom zweiten Instar bis zum wandernden dritten Instern kompatibel. Wir zeigen Anwendungen dieser Methode bei der Untersuchung dynamischer Prozesse von Drosophila somatosensorischen Neuronen, einschließlich Dendritenwachstum und verletzungsinduzierter Dendritendegeneration. Diese Methode kann auch angewendet werden, um viele andere zelluläre Prozesse zu studieren, die in der Nähe der Larvenkörperwand passieren.

Einleitung

Die Zeitraffer-Live-Bildgebung ist eine leistungsstarke Methode zur Untersuchung dynamischer zellulärer Prozesse. Die räumlichen und zeitlichen Informationen, die von Zeitrafferfilmen bereitgestellt werden, können wichtige Details für die Beantwortung zellbiologischer Fragen aufdecken. Die Drosophila Larve ist ein beliebtes In-vivo-Modell für Untersuchungen mit Live-Bildgebung, weil ihre transparente Körperwand eine nichtinvasive Bildgebung der inneren Strukturen^1,2ermöglicht. Darüber hinaus stehen in Drosophila zahlreiche genetische Werkzeuge zur Fluoreszenz zur Kennzeichnung anatomischer Strukturen und Makromoleküle zur Verfügung³. Jedoch, langfristige Zeitraffer-Bildgebung von Drosophila Larven ist eine Herausforderung. Im Gegensatz zu stationären frühen Embryonen oder Pupas bewegen sich Drosophila-Larven ständig, was eine Immobilisierung für die Live-Bildgebung erforderlich macht. Effektive Möglichkeiten zur Immobilisierung lebender Drosophila-Larven umfassen die Montage in Halocarbonöl mit Chloroform^4,anästhesieren mit Isofluran- oder Dichlorvos-Lösung⁵, und das Komprimieren zwischen dem Deckelrutsch und dem Mikroskopschlitten⁶. Obwohl einige dieser Methoden für die Mikroskopie verwendet wurden, keine von ihnen ist wirksam für langfristige Live-Bildgebung. Andere Methoden wurden für die Bildgebung von Körperwandneuronen in kriechenden Larven mittels konventioneller konfokaler Mikroskopie oder Lichtbogenmikroskopie^7,8,9entwickelt. Diese Methoden sind jedoch nicht ideal für die Überwachung der zellulären Dynamik aufgrund der Bewegung der Larven.

Neue Methoden wurden entwickelt, um eine langfristige Zeitraffer-Bildgebung von Drosophila-Larven zu erreichen. Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) "Larvenchip" können Drosophila-Larven durch vakuumgenerierte Absaugung in einer spezialisierten Mikrokammer ohne Anästhesisierung effektiv immobilisiert werden. Diese Methode bietet jedoch keine hohe zeitliche Auflösung für zellbiologische Studien und hat strenge Einschränkungen für die Tiergröße¹⁰. Eine andere Methode mit einem Anästhesisierungsgerät erreicht Live-Bildgebung von Drosophila Larven an mehreren Zeitpunkten und wurde angewendet, um neuromuskuläre Knoten^{11,12,13,14,15,16}. Diese Methode erlaubt jedoch auch keine kontinuierliche Bildgebung länger als 30 min und erfordert die wiederholte Verwendung von Desfluran, was die neuronale Aktivität hemmen und den untersuchten biologischen Prozess beeinflussen kann^17,18. Kürzlich wurde eine neue Methode, die mikrofluidische Vorrichtung und Kryoanesthesie kombiniert, verwendet, um Larven verschiedener Größen für kurze Zeiträume (Minuten) zu immobilisieren¹⁹. Diese Methode erfordert jedoch spezielle Geräte wie ein Kühlsystem und längere Immobilisierungsphasen erfordern eine wiederholte Kühlung der Larven.

Hier präsentieren wir eine vielseitige Methode zur Immobilisierung von Drosophila-Larven, die mit ununterbrochener Zeitraffer-Bildgebung länger als 10 h kompatibel ist. Bei dieser Methode, die wir "Larvenstabilisierung durch Partielle Befestigung" (LarvaSPA) nennen, wird die Larvenhaut an einem Deckblatt für die Bildgebung in einer kundenspezifischen Bildgebungskammer anhaften. Dieses Protokoll beschreibt, wie man die Bildkammer macht und wie man Larven in einer Vielzahl von Entwicklungsstadien montiert. Bei der LarvaSPA-Methode werden die gewünschten Körpersegmente mit einem UV-reaktiven Kleber am Deckschein befestigt. Ein PDMS-Quader übt zusätzlich Druck auf die Larven aus und verhindert so das Entweichen. Die Luft und Feuchtigkeit in der Bildkammer sichern das Überleben der teilweise immobilisierten Larven während der Bildgebung. Vorteile von LarvaSPA gegenüber anderen Techniken sind die folgenden: (1) Es ist die erste Methode, die eine kontinuierliche Live-Bildgebung intakter Drosophila-Larven für Stunden mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ermöglicht; (2) Die Methode hat weniger Beschränkungen für die Larvengröße; (3) Die Bildkammer und PDMS-Quader können zu minimalen Kosten hergestellt werden und sind wiederverwendbar.

Neben der Beschreibung der Larvenmontagemethode, bieten wir mehrere Beispiele für seine Anwendung für die Untersuchung der Dendritenentwicklung und Dendritendegeneration von Drosophila dendritischen Arborisation (da) Neuronen.

Protokoll

1. Herstellung der Bildgebungskammer

1. Der Metallrahmen kann aus einem Aluminiumblock in einer typischen Maschinenwerkstatt gefertigt werden. Die Spezifikationen des Rahmens sind in Abbildung 1Adargestellt.
2. Um die Bildkammer zu konstruieren, versiegeln Sie die Unterseite des Metallrahmens mit einem langen Abdeckschlupf (22 mm x 50 mm) und UV-Kleber(Abbildung 1A). Den UV-Kleber mit einer handgehaltenen UV-Lampe aushärten.

2. Herstellung von PDMS-Quadern

1. Bereiten Sie die Form für PDMS-Quader vor.
   1. Befestigen Sie Schichten von Verpackungsband an der Innenfläche einer rechteckigen (80 mm x 55 mm) Petrischale oder runden Zellkulturplatte. Verwenden Sie eine Schicht (0,063 mm dick) für zweite Instar-Larven, 2 Schichten (0,126 mm dick) für frühe dritte Insternlarven oder drei Schichten (0,189 mm dick) für spätdritte Instarlarven(Abbildung 1B).
   2. Schneiden Sie das Band in Streifen mit spezifischer Breite mit einer Rasierklinge: 1,5 mm für das 1-Schicht-Band und 2 mm für 2-Schicht- oder 3-Schicht-Band. Die Breite und Dicke des Streifens bestimmt die Größe der Larven, die der endgültige PDMS-Quader aufnehmen kann. Lassen Sie mindestens einen Abstand von 5 mm zwischen den beiden Streifen. Entfernen Sie die Bandschichten, die den Raum abdecken (Abbildung 1B).
   3. Entfernen Sie Staub von der Innenfläche der Platte mit Klebeband. Die Form ist einsatzbereit.
2. Bereiten Sie den PDMS-Mix vor.
   1. 7 g PDMS-Basis und 0,7 g Aushärtungsmittel (10:1-Verhältnis) in einem kleinen Behälter gründlich mischen.
   2. Legen Sie den Behälter mindestens 15 min in einen Vakuumaustrocknungsor, um Luft aus dem Gemisch zu entfernen.
   3. Etwa 5,5 g PDMS-Mischung langsam auf die Form gießen, um eine Dicke von 1–2 mm zu erreichen (Abbildung 1B).
   4. Legen Sie das PDMS-Gemisch mindestens 15 min im Vakuumaustrocknungsor wieder auf, um die verbleibenden Luftblasen aus der Mischung zu entfernen. Brechen Sie die letzten Blasen mit einer Pipettenspitze.
   5. Das PDMS auf einer ebenen Oberfläche in einem Wärmeinkubator bei 65 °C für 2 h aushärten.
   6. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das ausgehärtete PDMS entlang der Kante der Form zu lösen und von der Form zu lösen. Bewahren Sie das PDMS zwischen zwei Stücken großem Klebeband bei Raumtemperatur auf.
   7. Schneiden Sie das PDMS für frühe und späte dritte Instar-Larven in 8 mm x 2 mm x 1 mm Quader (entlang der gepunkteten Linien in Abbildung 1B) durch Positionierung der Nut, die durch den Bandstreifen (Schritt 2.1.2) in der Mitte der langen Seite des Quaders erzeugt wird (Abbildung 1B,C). Für zweite Instar-Larven den Quader auf 8 mm x 1 mm x 1 mm schneiden.

3. Montage von Larven für langzeitzeitliche Zeitraffer-Bildgebung

1. Bereiten Sie den oberen Deckelschlupf für die Montage vor.
   1. Wählen Sie sechs PDMS-Quader mit Nuten, die den Größen der Larven entsprechen. Befolgen Sie die empfohlene Nut und Größe von PDMS basierend auf den Schritten 2.1.1, 2.1.2 und 2.2.7.
   2. Entfernen Sie Staub von der Oberfläche des PDMS mit Klebeband.
   3. Befestigen Sie vier Stück doppelseitiges Klebeband (12 mm x 5 mm) auf einem langen Abdecksch (22 mm x 50 mm) zur späteren Befestigung von PDMS-Quadern. Die Leerzeichen zwischen den beiden Stücken doppelseitig liegendem Band sollten mit der Breite der PDMS-Nut identisch sein.
   4. Tragen Sie einen kleinen Tropfen UV-Kleber in die Nut jedes PDMS-Quaders auf und fügen Sie sechs kleine Tropfen UV-Kleber in den Raum zwischen dem doppelseitigen Klebeband auf dem Deckel.
2. Bereiten Sie die Larven für die Montage vor.
   1. Reinigen Sie die Larven mit einem Zangenpaar in Wasser, um Nahrung von der Körperoberfläche zu entfernen.
   2. Legen Sie saubere Larven auf ein kleines Stück befeuchtetes Tissuepapier in eine kleine (35 mm) Petrischale ohne Deckel. Legen Sie die kleine Petrischale in eine große (60 mm) Petrischale mit einem Stück Trockenpapier. In einer chemischen Haube 8–12 Tropfen (160–240 l) Isofluran e.V. mit einer Kunststoff-Transferpipette auf das Trockenepapier auftragen und den Deckel der großen Petrischale schließen.
   3. Warten Sie 2–3 min, während Sie die Larven überwachen. Nehmen Sie die Larven aus der großen Petrischale heraus, sobald ihre Mundhaken aufhören sich zu bewegen.
3. Montieren Sie die Tiere.
   1. Um Strukturen auf der Dorsalseite des Tieres abzubilden, legen Sie die immobilisierten Larven auf den UV-Kleber zwischen dem doppelseitigen Klebeband auf dem Deckblatt mit der dorsalen Nagelhaut, die dem Deckel zugewandt ist.
   2. Bedecken Sie jede Larve mit einem PDMS-Block und passen Sie den Stamm der Larve in die Nut des PDMS. Lassen Sie den Kopf und den Schwanz der Larve außerhalb der PDMS-Nut. Vermeiden Sie es, die Spappel der Larve durch den Kleber zu blockieren.
   3. Drücken Sie auf die Enden des PDMS-Blocks auf das doppelseitige Band, ohne Kraft auf die Nut anzuwenden. Ziehen Sie vorsichtig am Schwanz der Larve, um die Nagelhaut unter dem PDMS abzuflachen.
   4. Den UV-Kleber 4 min mit einer handgehaltenen UV-Lampe an der hohen Einstellung (bei ca. 0,07 mW/mm²⁾aushärten.
      VORSICHT: Schützen Sie die Augen mit einer Schutzbrille, während Sie die UV-Lampe verwenden.
   5. Drehen Sie den Coverslip auf den Kopf und wiederholen Sie Schritt 3.3.4.
   6. Befeuchten Sie ein kleines Stück Linsenpapier (15 mm x 30 mm) mit 20 l–30 l Wasser. Legen Sie das befeuchtete Linsenpapier an der Unterseite der Bildkammer (Abbildung 1A,D).
   7. Legen Sie den Deckelaufschub auf die Kammer, so dass die Larven nach innen in die Kammer blicken. Mit UV-Kleber an beiden Enden des Deckels an der Metalloberfläche anhaften (Abbildung 1A,D). Die Dorsalseite der Larven ist unter dem konfokalen Mikroskop zur Bildgebung bereit (Abbildung 1E).

4. Imaging

1. Bildlarven mit einem geeigneten Mikroskop. Alle in diesem Protokoll gezeigten Ergebnisse (Abbildung 2, Abbildung 3, Video S2, Video S3und Video S4) wurden mit einem konfokalen System mit einem 40x (1.30 NA) Ölobjektiv erworben.

5. Wiederherstellung von Bildkammer und PDMS-Quadern

1. Entfernen Sie nach der Bildgebung das Öl auf dem oberen Deckelmitrutsche mit einem Linsenpapier. Lösen Sie den oberen Deckelrutsch vom Metallrahmen, indem Sie mit einer Rasierklinge in den Raum zwischen dem Coverslip und dem Metallrahmen schneiden. Die Bildgebungskammer ist wiederverwendreif.
2. Lösen Sie die PDMS-Quader mit Zangen vom oberen Deckel. Rollen Sie die PDMS-Quader auf Klebeband, um Klebstoffrückstände und Staub zu entfernen. Die PDMS-Quader sind wiederverwendreif.

Ergebnisse

Die Larven-Bildkammer wird durch Verkleben eines maßgeschneiderten Metallrahmens und zweier Abdeckungen konstruiert. Das Design des Metallrahmens ist in Abbildung 1Aangegeben. Drosophila-Larven in der Kammer werden mit Hilfe von UV-Kleber und PDMS-Quadern am oberen Deckelbedeckungsslip aufgeklebt. Die Nut auf dem PDMS-Quader und das doppelseitige Band des Quaders wird befestigt, um den Raum für die Larven zu schaffen (Abbildung 1B,C). Das PDMS...

Diskussion

Hier beschreiben wir LarvaSPA, eine vielseitige Methode zur Montage lebender Drosophila-Larven für die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung. Diese Methode erfordert keine Wiederherstellung oder Wiedermontage von Larven, was eine unterbrechungsfreie Bildgebung ermöglicht. Es ist daher ideal für die Verfolgung biologischer Prozesse, die Stunden in Anspruch nehmen, wie Zerstitendegeneration und Regeneration. Diese Methode kann auch für die Bildgebung intrazellulärer Kalziumdynamik und subzelluläre Ereignisse wie Mi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6061 Aluminum bars	McMaster-Carr	9246K421
3M double-sided tape	Ted Pella, Inc.	16093
3M Scotch Packaging tape	3M		1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 Forceps	Fisher Scientific	50-241-34
Glass coverslip	Azer Scientific	1152250
Isoflurane	Midwest Veterinary Supply	193.33161.3
Leica Confocal Microscope	Leica	SP8 equipped with a resonant scanner
Lens paper	Berkshire	LN90.0406.24
Petri dishes (medium)	VWR	25373-085
Petri dishes (small)	VWR	10799-192
Razor blade	Ted Pella, Inc.	121-20
Rectangular petri dish	VWR	25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit)	Electron Microscopy Sciences	24236-10
Transferring pipette	Thermo Fisher Scientific	1371126
UV glue	Norland products	#6106, NOA 61	Refractive Index 1.56
UV lamp (Workstar 2003)	Maxxeon	MXN02003
Vacuum desiccator	Electron Microscopy Sciences	71232
Wipes	Kimberly-Clark	Kimwipes