過圧過負荷のラットモデルは、過小収縮期心不全とは対照的に中程度のリモデリングと収縮期機能不全を誘発した

要約

我々は、リモデリングプロセスの開始に関与するシグナル伝達経路が活性化される中程度のリモデリングおよび初期の収縮機能不全を誘発した圧力過負荷のラットモデルの作成について述べている。この動物モデルは、心不全に対する早期治療用抗モデリング戦略を適用するための分子標的の同定に役立つ。

要約

心筋梗塞、長期高血圧、心毒性剤などの傷害に対して、心臓は最初にシグナル伝達経路の活性化を通じて適応し、短期的には心臓筋細胞喪失およびまたは壁ストレスの増加に対抗する。しかし、これらの経路の長時間の活性化は、心臓リモデリングの開始および伝播に悪影響を及ぼし、左心室の幾何学的形状の変化および左心室容積の増加をもたらす。収縮期心不全(HF)患者に見られる表現型。ここでは、2mm2の内部領域を有する血管クリップを介して大動脈バンディング(AAB)を昇順させることにより、中程度のリモデリングおよび初期の収縮期機能不全(MOD)を誘発した圧力過負荷²のラットモデルの作成について説明する。手術は200gスプレイグドーリーラットで行われます。MOD HF表現型はAAB後8~12週で発現し、心エコーによる非侵襲的特徴である。これまでの研究では、ヒトシストリックHFに見られるものを模倣するMOD HF表現型におけるシグナル伝達経路および遺伝子発現の変化および翻訳後修飾の活性化を示唆している。従って、MOD HF表現型を、HFにおける潜在的な治療用抗モデリング標的を同定し、試験するための翻訳研究に適したモデルにする。MOD HF表現型の利点は、初期のリモデリングプロセスに関与する分子標的の同定と治療介入の早期適用を可能にすることです。MOD HF表現型の制限は、ヒトにおける収縮期HFに至る疾患のスペクトルを模倣しないかもしれないということである。さらに、AAB手術は、所望のHF表現型を発症する手術ラットのわずか20%で高い死亡率と失敗率に関連しているので、作成することは困難な表現型です。

概要

心不全(HF)は流行している疾患であり、高い罹患率および死亡率¹に関連している。昇順または横大通り大動脈バンディングによって生成されるHFのげっ歯類圧力過負荷(PO)モデルは、HFにつながる分子メカニズムを探求し、HFの潜在的な新しい治療標的をテストするために一般的に使用される。彼らはまた、長期の全身性高血圧または重度の大動脈狭窄にヒトHF二次的に見られる変化を模倣する。POに続いて、左心室(LV)壁は徐々に厚さが増加し、同心円LV肥大(LVH)として知られるプロセスで、LV壁応力の増加を補い、適応させる。しかし、これは、カルシウムサイクリングおよび恒常性、代謝および細胞外マトリックスのリモデリングおよび遺伝子発現の変化、ならびに増強されたアポトーシスおよびオートファジー^{22、3、4、5、63,4,}における不適応シグナル伝達経路の活性化に関連している。^5,6これらの分子変化は、心筋リモデリングの開始と伝播の引き金となり、非補償HF表現型への移行を行う。

近親交配げっ歯類株の使用およびクリップサイズおよび外科技術の標準化にもかかわらず、大動脈バンディングモデル^{77、8、98,9}におけるLVチャンバー構造および機能には驚異的な平種変動がある。ラットのPO後に遭遇した表現性の変動性は、スプレイグ・ドーリー株、他の^10,11,11に記載されている。そのうち2つのHFの型は、心筋リモデリングの証拠と、酸化ストレスの高まりにつながるシグナル伝達経路の活性化に遭遇する。これは、代謝リモデリング、遺伝子発現の変化、およびタンパク質の翻訳後修飾の変化と関連しており、全てリモデリングプロセス^10,12,12において役割を果たす。1つ目は中程度のリモデリングと初期の収縮機能不全(MOD)の表現型であり、第2は、アプトシストリックHF(HFrEF)の表現型である。

HFのPOモデルは、PO誘導周波および経後壁応力が心筋のすべてのセグメントに均一に分布しているため、HFの心筋梗塞(MI)モデルよりも有利である。しかし、いずれのモデルも、HFのMIモデルで観察される胸壁および周囲組織への密着性と同様に、梗塞部位15における激しい炎症および瘢痕化と共に^,、PO10、11および梗塞サイズ^10,1113、14の重症度の変動に苦しんでいる。¹³¹⁴さらに、ラットPO誘導HFモデルは、高い死亡率および障害率¹⁰に関連し、手術ラットの20%だけがMOD HF表現型¹⁰を発症するので、作成するのが困難である。

MODは魅力的なHF表現型であり、特にミトコンドリアダイナミクスおよび機能の摂動、心筋代謝、カルシウム循環および細胞外マトリックスモデリングにおける摂動に関連する場合、心筋リモデリングに役割を果たすシグナル伝達経路の早期ターゲティングを可能にする従来のHFrEF表現型の進化を構成する。これらの病態生理学的プロセスは、MOD HF表現型¹¹において非常に明らかである。本稿では、MODおよびHFrEF表現型の作成方法を説明し、昇順大動脈バンディング(AAB)手順を実行する際の落とし穴に対処する。また、2つのHFフェノタイプであるMODとHFrEFを心エコーで最もよく特徴付ける方法と、重度のPOを開発できない他の型や、重度のPOと同心円状のリモデリングを開発するが、有意な偏心リモデリングを行わない他の型と区別する方法についても詳しく述べています。

プロトコル

ここで説明するすべての方法と手順は、トゥレーン大学医学部の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. AAB モデル作成のためのツールと計測器

1. 70%イソプロピルアルコールおよびポビドネヨウ素などの消毒剤を入手する。
2. 麻酔用ケタミンとキシラジン、鎮痛用ブプレノルフィンを入手します。
3. 18インチx30インチの寸法で加熱パッドと重い吸収性使い捨てアンダーパッドを取得します。
4. 綿ひもロール、テープ、ヘアクリッパーを100%取得します。
5. 20 cm x 25 cmのプラスチック板を得て、3-5 mmの間の厚さの範囲。
6. Z-LITE光ファイバー照明器を入手します。
7. 小動物用の機械式人工呼吸器(例えばSAR-830/AP)を入手してください。
8. 2-0および3-0のVicrylテーパー縫合糸およびナイロン3-0モノフィラメント縫合、無菌ガーゼパッドおよび無菌の超大型綿の先端および無菌手袋を得る。
9. 挿管のために16G血管カスを得る。
10. 以下の手術用具を購入してください。
    1. ウェックステンレス製のヘモクリップライゲーションとステンレススチール製の合字クリップを入手します。
    2. 硬化した細かい虹彩はさみを手に入れ。
    3. アドソン鉗子を取得します。
    4. 2つの湾曲したグレイフ鉗子を得る。
    5. ハルステッド・モスキート・ヘモスタット・ストレート・鉗子を入手する。
    6. メイヨーヘーガー針ホルダーを入手します。
    7. 鈍い歯を持つアルム胸部レトラクタを取得します。
11. オートクレーブとビード滅菌器を利用して入手してください。

2. 昇順大動脈バンディング手術

1. 75-100 mg/kgケタミンと10 mg/kgキシラジンの混合物の腹腔内注射で動物を麻酔します。
   注:動物が完全に鎮静され、フラクシッドされるまで数分かかります。麻酔薬の投与量が十分ではなく、動物がまだケージ内を移動している場合は、十分な時間を許した後、その後の注射の間に約5〜10分の間に同じ麻酔用量で動物を再注入する。ほとんどの動物は、深い沈下と麻酔を達成するために1-2の注射を必要とします。
2. 右脇の下の右横胸部に位置する外科部位の髪を剃る。
3. 4本の手足をプラスチックボードにそっとテーピングして、動物を安定させる。その後、16G血管スで気管内挿管を行う。動物が正常に挿管された後、50サイクル/分で2mLの潮量と21%のFiO₂で機械的換気を開始します。各呼吸で胸壁の対称的な上昇を探します。
4. ゆっくりと左横側に横たわる動物を回し、尾をU字型で曲げ、プラスチックボードにそっとテーピングして安定させます。その後、先に行くとポビドネヨウ素の局所適用で剃った領域を消毒します。
5. 切開部位の皮膚を1-2%リドカイン/0.25-0.5%ブピバカインを先制鎮痛として50/50ミックスで浸潤します。
6. 右腋窩下1cmの右腋窩領域で、右横の皮膚切開を1~2センチ行います。次いで、胸部肋骨ケージに到達するまで胸部筋層を解剖する。第2^と第3^の肋骨ケージの間に1cmの胸部切り出し術を行う。
   1. 胸の筋肉層を解剖しながら、注意して右腋窩動脈の損傷を避け、右脇の下を走る。
      注:1^番目と2^番目の肋骨の間で行われる胸部切開術は、上り大動脈の代わりに右の腕頭筋動脈を帯びるリスクを伴う。3^番目と4番目の肋骨の間の胸部切れは、オペレータが右心房を見ているため、上昇大起を視覚化してバンド化することが困難になります。
      注:右の乳腺動脈を解剖して傷付けないように、胸骨に向かってあまりにも内側の胸部を拡張する胸部を拡張しないでください。
7. 胸腺の2つの葉を優しく解剖し、側面に押し出します。次に、上昇大動脈を特定し、湾曲したグレイフ鉗子を介して鈍い解剖によって上の大動脈から分離する。
   注: 胸腺を大きく操作すると腫れ上がり、昇順大体を視覚化することが困難になります。
   1. 致命的である上の大静脈の怪我や破裂を避けるために、大動脈から上の大静脈を解剖する。これは手順の最もトリッキーな部分であり、ほとんどの経験豊富な手でも時々起こることが期待されていますが、多くの場合、初心者や学習者で起こります。
8. 湾曲したグレイフ鉗子で上昇大動脈を穏やかに持ち上げ、上昇大動脈の周りに血管クリップを置きます。
   1. プラスチックプレカット7"片を介して血管ヘモクリップライゲーションツールを調整して、所望の1.5mm²または2mm²の所望の内部領域の血管クリップを取得します。
9. Vicryl 2-0モノフィラメント縫合糸を介して胸郭を縫合する。その後、3-0ヴィクリルテーパー縫合糸を介して胸部の筋肉層を縫合する。次にナイロン3-0モノフィラメント縫合を介して皮膚切開を縫合する。
10. 術後の期間に鎮痛として機能する48-72時間の手術完了後に次の薬剤の組み合わせを投与する:1)ブプレノルフィン0.01-0.05 mg/kgは皮下8-12h、 2)メロキシカム2mg / kg皮下12h、および3)モルヒネ2.5mg/kgは、重度の痛みに必要に応じて2〜4hごとに皮下に。
    注:定期的な監視の下で加熱パッド上で回復するために動物を残します。動物が麻酔からの回復の兆候を示すと(2分以上のあえぎや補助筋肉の使用の証拠なしに自発的に呼吸することができ、良好な反射神経、赤と暖かい四肢を持っている)、動物を排泄し、ケージに戻します。

3. 心エコー検査

1. 80-100 mg/kgケタミンの腹腔内注射で動物を鎮静させます。良質のエコー画像を適切に取得するための適切なセデーションを確保します。
   注:麻酔薬としてのイゾフルランの使用は、特に重度の圧力過負荷の設定において、その心圧抑制効果のために推奨され、動物が麻酔薬から外れると解決するLV拡張および収縮期機能不全の誤った印象を与える可能性があります。
   1. 注意して、HFrEF表現型を発症した疑いを持って呼吸困難で頻性に見える動物のケタミンの用量の半分または1/1を投与してください。
2. 完全に鎮静した動物の胸の毛を前に剃ります。
3. 動物を背中に置き、プラスチックボードに安定させる。
4. 乳頭筋のレベルで2Dパラスターナル長軸と2Dパラスターナル短軸ビュークリップを取得します。また、短い寄節点の軸図から、乳頭筋のレベルからMモード画像を取得し、LV末端拡張期および収縮期直径だけでなく、拡張期におけるLV中隔および後壁厚さを測定する。
   1. LVサイズと機能の適切な評価を確実にするために、1分間に370〜420拍の心拍数で画像またはクリップを取得します。低心拍数で画像を取得すると、うつ病のLV機能とLV拡張の誤った印象につながります.
      注意:短縮された2D長いパラスターン軸ビューの画像/クリップを取得すると、誤った測定につながります。品質管理のために、LV頂点と大間僧帽角が同じ平面カット内で視覚化されていることを確認してください。
   2. 2D短い準船尾軸ビュー画像/クリップを中乳頭筋のレベルで取得します。これは、研究期間を通して動物を追っている間、信頼性の高いシリアルとその後のLV測定を得るための参考として機能します。
5. 大動脈弁のレベルで長いパラスターン軸ビューでMモード画像を取得し、終末期の左心房(LA)直径の相対大動脈を評価する。
   注:MODおよびHFrEF表現型を有する動物は、LA/Ao比がMOD HF表現型で1.25および<1.5であり、HFrEF表現型¹⁰で≥1.5であるLA拡張の証拠を示すべきである。

結果

AAB後8〜12週に発症するHF型の特徴付けは、心エコー検査を介して容易に行うことができた。シャム、第3週ポストAAB、MODおよびHFrEFの表形型の代表的なMモード画像を図1Aに示します。図1BBおよび図1Cは、それぞれ、MOD HF表現型およびHFrEF表現型の作成のための血管クリップサ?...

ディスカッション

ラットのAABに関連するPOに続いて、LVは、LV壁応力の増加に対抗するための補償機構として、同心LVHとして知られているLV壁厚を増加させることによって同心円リモデリングを行う。LV壁厚の増加はAABに続く最初の週の間に顕著になり、AAB後2-3週間で最大厚さに達する。この期間中、不適応なシグナル伝達経路の活性化は、LVボリュームの増加に伴うLVの進行性の拡大、偏心肥大またはリモデリ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adson forceps	F.S.T.	11019-12	surgical tool
Alm chest retractor with blunt teeth	ROBOZ	RS-6510	surgical tool
Graefe forceps, curved	F.S.T.	11152-10	surgical tool
Halsted-Mosquito Hemostats, straight	F.S.T.	13010-12	surgical tool
Hardened fine iris scissors, straight	Fine Science Tools F.S.T.	14090-11	surgical tool
hemoclip traditional-stainless steel ligating clips	Weck	523435	surgical tool
Mayo-Hegar needle holder	F.S.T.	12004-18	surgical tool
mechanical ventilator	CWE inc	SAR-830/AP	mechanical ventilator for small animals
Weck stainless steel Hemoclip ligation	Weck	533140	surgical tool