Un modello di pressione indotto moderate rimodellamenti e disfunzione stolica rispetto al sovraccarico di insufficienza cardiaca systolica

Riepilogo

Descriviamo la creazione di un modello di ratto di sovraccarico di pressione indotto moderato rimodellamento e disfunzione sistolica precoce in cui vengono attivati i percorsi di trasduzione del segnale coinvolti nell'avvio del processo di rimodellamento. Questo modello animale aiuterà a identificare gli obiettivi molecolari per l'applicazione di strategie terapeutiche anti-rimodellamento precoce per l'insufficienza cardiaca.

Abstract

In risposta a una lesione, come l'infarto miocardico, l'ipertensione prolungata o un agente cardiotossico, il cuore inizialmente si adatta attraverso l'attivazione di percorsi di trasduzione del segnale, per contrastare, a breve termine, per la perdita di miociti cardiaci e o l'aumento dello stress della parete. Tuttavia, l'attivazione prolungata di questi percorsi diventa dannosa che porta all'avvio e alla propagazione del rimodellamento cardiaco che porta a cambiamenti nella geometria ventricolare sinistra e all'aumento dei volumi ventricolari sinistro; un fenotipo visto in pazienti con insufficienza cardiaca sistolica (HF). Qui, descriviamo la creazione di un modello di ratto di sovraccarico di pressione indotto rimodellamento moderato moderato e disfunzione sistolica precoce (MOD) salendo bande aortiche (AAB) tramite una clip vascolare con un'area interna di 2 mm². L'intervento viene eseguito in 200 g di ratti Sprague-Dawley. Il fenotipo MOD HF si sviluppa a 8-12 settimane dopo l'AAB ed è caratterizzato in modo non invasivo per ecocardiografia. Il lavoro precedente suggerisce l'attivazione delle vie di trasduzione del segnale e l'espressione genica alterata e la modifica post-traduzionale delle proteine nel fenotipo MOD HF che imitano quelle osservate nell'HF sistolico umano; pertanto, rendendo il fenotipo MOD HF un modello adatto per la ricerca traslazionale per identificare e testare potenziali obiettivi terapeutici anti-rimodellamento in HF. I vantaggi del fenotipo MOD HF rispetto al palese fenotipo HF sistolico sono che consente l'identificazione di obiettivi molecolari coinvolti nel processo di rimodellamento precoce e l'applicazione precoce di interventi terapeutici. La limitazione del fenotipo MOD HF è che non può imitare lo spettro di malattie che portano alla sistolica HF nell'uomo. Inoltre, è un fenotipo impegnativo da creare, in quanto la chirurgia AAB è associata ad alti tassi di mortalità e fallimento con solo il 20% dei ratti operai che sviluppano il fenotipo HF desiderato.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca (HF) è una malattia prevalente ed è associata ad alta morbilità e mortalità¹. I modelli di pressione-sovraccarico (PO) del roditore di HF, prodotti da bande aortiche ascendenti o trasversali, sono comunemente usati per esplorare i meccanismi molecolari che portano all'HF e per testare potenziali nuovi bersagli terapeutici in HF. Essi imitano anche i cambiamenti osservati nell'HF umano secondario a ipertensione sistemica prolungata o stenosi aortica grave. Dopo po, la parete ventricolare sinistra (LV) aumenta gradualmente di spessore, un processo noto come ipertrofia lV concentrica (LVH), per compensare e adattarsi all'aumento della sollecitazione della parete LV. Tuttavia, questo è associato con l'attivazione di una serie di vie di segnalazione disadattative, che portano a squilibramenti nel ciclismo di calcio e omeostasi, rimodellamento della matrice metabolica ed extracellulare e cambiamenti nell'espressione genica, nonché apoptosi migliorata e autofagia^2,3,4,5,6. Questi cambiamenti molecolari costituiscono l'innesco per l'avvio e la propagazione del rimodellamento miocardico e la transizione in un fenotipo HF scompensato.

Nonostante l'uso di ceppi di roditori inbred e la standardizzazione delle dimensioni della clip e della tecnica chirurgica, c'è un'enorme variabilità fenotipica nella struttura della camera LV e funzione nei modelli di fasciatura aortica^7,8,9. La variabilità fenotipica riscontrata dopo il PO nel ratto, ceppo Sprague-Dawley, è descritta altrove^10,11. Di questi, due fenotipi HF sono incontrati con prove di rimodellamento miocardico e attivazione di percorsi di trasduzione del segnale che portano ad uno stato di maggiore stress ossidativo. Ciò è associato al rimodellamento metabolico, all'espressione genica alterata e ai cambiamenti nella modifica post-traduzionale delle proteine, svolgendo complessivamente un ruolo nel processo di rimodellamento^10,12. Il primo è un fenotipo di rimodellamento moderato e disfunzione sistolica precoce (MOD) e il secondo è un fenotipo dell'HF sistolica palese (HFrEF).

Il modello PO di HF è vantaggioso rispetto al modello di infarto miocardico (MI) di HF perché le sollecitazioni circonferenziali e meridionali della parete indotta da PO sono distribuite omogeneamente in tutti i segmenti del miocardio. Tuttavia, entrambi i modelli soffrono di variabilità nella gravità di PO^10,11 e nella taglia infarto^13,14 insieme a infiammazione intensa e cicatrici nel sito infarto¹⁵ così come l'adesione alla parete toracica e ai tessuti circostanti, che sono osservati nel modello MI di HF. Inoltre, il modello HF indotto dal ratto PO è difficile da creare in quanto è associato ad alti tassi di mortalità e fallimento¹⁰, con solo il 20% dei ratti operati che sviluppano il fenotipo MOD HF¹⁰.

Il MOD è un fenotipo HF attraente e costituisce un'evoluzione del fenotipo HFrEF tradizionalmente creato in quanto consente di indirizzare precocemente le vie di trasduzione del segnale che svolgono un ruolo nel rimodellamento miocardico, soprattutto quando riguarda le perturbazioni nella dinamica mitocondriale e nella funzione, nel metabolismo miocardio, nel ciclismo a matrice del calcio e nel rimodellamento extracellulare. Questi processi patofisiologici sono altamente evidenti nel fenotipo MOD HF¹¹. In questo manoscritto, descriviamo come creare i fenotipi MOD e HFrEF e affrontiamo le insidie durante l'esecuzione della procedura di bande aortiche ascendenti (AAB). Elaboriamo anche su come caratterizzare al meglio con l'ecocardiografia i due fenotipi HF, MOD e HFrEF, e su come differenziarli da altri fenotipi che non riescono a sviluppare PO grave o che sviluppano PO e rimodellamento concentrico grave, ma senza significative rimodellate eccentriche.

Protocollo

Tutti i metodi e le procedure qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Tulane University School of Medicine.

1. Strumenti e strumenti per la creazione di modelli AAB

1. Ottenere disinfettanti, come 70% alcool isopropile e povidone-iodio.
2. Ottenere chetamina e xilazina per l'anestesia e buprenorphine per l'analgesia.
3. Ottenere un pad di riscaldamento e pesante assorbimento sottosolo usa e getta con le dimensioni di 18 pollici x 30 pollici.
4. Ottieni un rotolo di spago 100% di cotone, un nastro e un tagliacapelli.
5. Ottenere una scheda di plastica 20 cm x 25 cm, spessore gamma tra 3-5 mm.
6. Ottenere un illuminatore in fibra ottica z-LITE.
7. Ottenere un ventilatore meccanico per piccoli animali (ad esempio, SAR-830/AP).
8. Ottenere 2-0 e 3-0 Vicryl conici e sutura di molazione in nylon 3-0, pastiglie di garza sterili e sterili punte di cotone extra large e guanti sterili.
9. Ottieni 16 Ggiocath per l'intubazione.
10. Acquistare i seguenti strumenti chirurgici.
    1. Ottieni una legatura Hemoclip in acciaio inox Weck e clip di ligating in acciaio inox.
    2. Ottenere forbici iride fini indurite.
    3. Ottenere pinze Adson.
    4. Ottenere due pinze Graefe curve.
    5. Ottieni una pinza Halsted-Mosquito Hemostats-straight.
    6. Ottenere un portaago Mayo-Hegar.
    7. Ottenere un retrattore toracico Alm con denti smussati.
11. Utilizzare e ottenere un autoclave e uno sterilizzatore di perline.

2. Chirurgia chirurgica afasciatura ascendente

1. Anestesizzare l'animale con un'iniezione intraperitoneale di un mix di 75-100 mg/kg di Ketamina e 10 mg/kg Xylazine.
   NOTA: Lasciare qualche minuto per l'animale sia completamente sedato e flaccido. Se la dose anestetica non è sufficiente e l'animale è ancora in movimento nella gabbia, reiniettare l'animale con la stessa dose anestetica dopo aver concesso abbastanza tempo, circa 5-10 minuti tra le iniezioni successive. La maggior parte degli animali richiedono 1-2 iniezioni per ottenere sedazione profonda e anestesia.
2. Rasare i capelli sul sito chirurgico situato nella zona toracica laterale destra sotto l'ascella destra.
3. Stabilizzare l'animale toccando delicatamente tutti e quattro gli arti sulla scheda di plastica. Quindi eseguire l'intubazione endotracheale con un angiocath 16 G. Dopo che l'animale è stato intubato con successo, avviare la ventilazione meccanica con volumi di marea di 2 mL a 50 cicli/min e FiO₂ del 21%. Cercare l'aumento simmetrico nella parete del torace con ogni respiro.
4. Girare l'animale lentamente per sdraiarsi sul suo lato laterale sinistro, quindi piegare la coda in modo a forma di U e stabilizzarlo toccandolo delicatamente sulla scheda di plastica. Poi andare avanti e disinfettare l'area rasata con l'applicazione topica di povidone-iodio.
5. Infiltrare la pelle nel sito di incisione con 50/50 mix per volume di 1-2% Lidocaine/0.25-0.5 % Bupivacaine come analgesia preventiva prima di effettuare l'incisione.
6. Eseguire un'incisione cutanea orizzontale destra, lunga 1-2 centimetri, nell'area ascellare destra 1 cm sotto l'ascella destra. Quindi, sezionare lo strato muscolare toracico fino a raggiungere la gabbia toracica toracica. Fare una toracotomia di 1 cm tra la gabbia toracica 2^nd e 3^rd.
   1. Durante la dissezione dello strato muscolare del torace, fare attenzione ed evitare lesioni dell'arteria ascellare destra, che corre sotto l'ascella destra.
      NOTA: La toracotomia eseguita tra la 1^st e la^2nd costola comporta il rischio di fasciare l'arteria brachiocefalica destra invece dell'aorta ascendente. La toracotomia tra la 3^rd e la quarta costola rende difficile visualizzare e fascia l'aorta ascendente, come l'operatore sarà guardando l'atrio destro.
      NOTA: Evitare di estendere la toracotomia troppo medialmente verso lo sterno per evitare di sezionare e ferire l'arteria mammaria interna giusta.
7. Dissezionare delicatamente i due lobi della ghiandola del timo e spingerli a parte sul lato. Quindi identificare l'aorta ascendente e isolarla dalla vena cava superiore per dissezione smussata attraverso una pinze Graefe curve.
   NOTA: La manipolazione significativa della ghiandola del timo lo renderà gonfio e rende difficile visualizzare l'aorta ascendente.
   1. Dissezionare la vena cava superiore dall'aorta con particolare cautela per evitare lesioni o rotture della vena cava superiore, che è fatale. Questa può essere la parte più difficile della procedura e ci si aspetta che accada di volta in volta anche nelle mani più esperte, ma spesso con i principianti e gli studenti.
8. Sollevare delicatamente l'aorta ascendente con una pinze Graefe curve e posizionare la clip vascolare intorno all'aorta ascendente.
   1. Regolare l'utensile di legatura emoclip vascolare tramite un pezzo di plastica pre-tagliato da 7" per ottenere una clip vascolare dell'area interna desiderata di 1,5 mm² o 2 mm^2,a seconda di quale modello HF è desiderato.
9. Suturare il torace tramite una sutura monofilamento Vicryl 2-0. Quindi suturare lo strato muscolare del torace attraverso una sutura conica Vicryl 3-0. Quindi suturare l'incisione cutanea tramite una sutura monofilamento Nylon 3-0.
10. Somministrare una combinazione dei seguenti farmaci dopo il completamento dell'intervento chirurgico per 48-72 ore per servire come analgesia nel periodo post-operatorio: 1) Buprenorfina 0,01-0.05 mg/kg sottocutaneamente ogni 8-12h, 2) Meloxicam 2 mg/kg sottocutaneamente ogni 12h, e 3) morfina 2,5 mg/kg sottocutaneamente ogni 2-4h come necessario per un forte dolore.
    NOTA: Lasciare che l'animale si riprenda su una piastra di riscaldamento sotto regolare monitoraggio. Una volta che l'animale mostra segni di recupero dall'anestesia (in grado di respirare spontaneamente - senza prove di ansimante o uso di muscoli accessori per più di due minuti - e ha buoni riflessi, estremità rosse e calde), essetare l'animale e restituirlo alla gabbia.

3. Ecocardiografia

1. Sedare l'animale con iniezione intraperitoneale di 80-100 mg/kg di ketamina. Garantire una sedazione adeguata per una corretta acquisizione di immagini eco di buona qualità.
   NOTA: L'uso di isoflurane come anestetico è sconsigliato per il suo effetto cardiodepressore, soprattutto in impostazione di grave sovraccarico di pressione e potrebbe dare una falsa impressione di dilatazione LV e disfunzione sistolica che si risolve una volta che l'animale è fuori anestetico.
   1. Essere cauti e somministrare metà o anche un terzo della dose di chetamina negli animali che sembrano dispremocidi e tachicici con il sospetto di aver sviluppato il fenotipo HFrEF.
2. Rasare i capelli del petto, anteriormente, nell'animale completamente sedato.
3. Posare l'animale sulla schiena e stabilizzarlo sulla scheda di plastica.
4. Acquisire 2D parasternal long axis e 2D parasternal short axis view clip a livello del muscolo papillare. Inoltre, ottenere immagini in modalità M dalla breve vista dell'asse parasternale a livello del muscolo papillare per misurare lo setto LV e lo spessore della parete posteriore in diastole, nonché il diametro di diastolico finale e di fine sistolica LV.
   1. Acquisire immagini o clip a una frequenza cardiaca di 370 - 420 battiti al minuto per garantire una corretta valutazione delle dimensioni e della funzione LV. L'acquisizione di immagini a frequenza cardiaca più bassa porterà a una falsa impressione della funzione LV depressa e della dilatazione LV.
      NOTA: l'acquisizione di immagini/clip di visualizzazione dell'asse parasterna lungo accanito porta a false misurazioni. Ai fini del controllo qualità, assicurarsi che l'apice LV e l'angolo aorto-mitrale siano visualizzati all'interno dello stesso taglio piano.
   2. Acquisire immagini/clip dell'asse parasterntale corto 2D a livello del muscolo papillare medio. Questo servirà come riferimento per ottenere misurazioni seriali e successive affidabili mentre seguono gli animali nel tempo durante tutto il periodo di studio.
5. Ottenere immagini in modalità M in una vista dell'asse parasterna lungo a livello della valvola aortica per valutare il diametro dell'atrio a sinistra (Atrio) relativo all'atrio sinistro nella sistomia finale.
   NOTA: gli animali con fenotipi MOD e HFrEF dovrebbero mostrare prove di dilatazione LA/Ao con 1,25 e <1,5 nel fenotipo MOD HF e 1,5 nel fenotipo HFrEF¹⁰.

Risultati

La caratterizzazione dei fenotipi HF, che si sviluppano 8-12 settimane dopo l'AAB, potrebbe essere facilmente eseguita tramite ecocardiografia. Le immagini rappresentative della modalità M dei fenotipi Sham, Week 3 post-AAB, MOD e HFrEF sono presentate nella Figura 1A. Figura 1B e Figura 1C mostrano la dimensione della clip vascolare per la creazione del fenotip...

Discussione

In seguito all'AAB nel ratto, l'LV subisce una rimodellamento concentrico aumentando lo spessore della parete LV, noto come LVH concentrico, come meccanismo compensativo per contrastare l'aumento della sollecitazione della parete LV. L'aumento dello spessore della parete LV diventa evidente durante la prima settimana dopo AAB e raggiunge il suo spessore massimo a 2-3 settimane dopo AAB. Durante questo periodo di tempo, l'attivazione di percorsi di trasduzione del segnale disadattativo porta ad un progressivo allargamento...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adson forceps	F.S.T.	11019-12	surgical tool
Alm chest retractor with blunt teeth	ROBOZ	RS-6510	surgical tool
Graefe forceps, curved	F.S.T.	11152-10	surgical tool
Halsted-Mosquito Hemostats, straight	F.S.T.	13010-12	surgical tool
Hardened fine iris scissors, straight	Fine Science Tools F.S.T.	14090-11	surgical tool
hemoclip traditional-stainless steel ligating clips	Weck	523435	surgical tool
Mayo-Hegar needle holder	F.S.T.	12004-18	surgical tool
mechanical ventilator	CWE inc	SAR-830/AP	mechanical ventilator for small animals
Weck stainless steel Hemoclip ligation	Weck	533140	surgical tool