Un modèle de rat de surcharge de pression induit modéré remodelage et dysfonction systolique par opposition à l’insuffisance cardiaque systolique manifeste

Résumé

Nous décrivons la création d’un modèle de rat de surcharge de pression induite transformant modéré et le dysfonctionnement systolique tôt où les voies de transduction de signal impliquées dans le déclenchement du processus de remodelage sont activées. Ce modèle animal aidera à identifier les cibles moléculaires pour l’application précoce des stratégies thérapeutiques anti-remodelage pour l’insuffisance cardiaque.

Résumé

En réponse à une blessure, comme l’infarctus du myocarde, une hypertension prolongée ou un agent cardiotoxique, le cœur s’adapte d’abord par l’activation des voies de transduction du signal, pour contrecarrer, à court terme, pour la perte cardiaque de myocyte et ou l’augmentation du stress mural. Cependant, l’activation prolongée de ces voies devient préjudiciable menant à l’initiation et à la propagation du remodelage cardiaque menant aux changements dans la géométrie ventriculaire gauche et aux augmentations des volumes ventriculaires gauches ; un phénotype vu dans les patients présentant l’insuffisance cardiaque systolique (HF). Ici, nous décrivons la création d’un modèle de rat de surcharge de pression induite transformant modéré et le dysfonctionnement systolique précoce (MOD) en montant le baguage aortique (AAB) via un clip vasculaire avec une zone interne de 2 mm². La chirurgie est réalisée chez 200 g de rats Sprague-Dawley. Le phénotype de HF de MOD se développe à 8-12 semaines après AAB et est caractérisé non invasivement par le moyen de l’échocardiographie. Les travaux précédents suggèrent l’activation des voies de transduction de signal et l’expression de gène altérée et la modification post-translationnelle des protéines dans le phénotype de HF de MOD qui imitent ceux vus dans le HF systolique humain ; par conséquent, faire du phénotype DE HF de MOD un modèle approprié pour la recherche translationnelle afin d’identifier et de tester des cibles thérapeutiques potentielles anti-remodelage dans HF. Les avantages du phénotype de HF de MOD comparé au phénotype systolique manifeste de HF est qu’il permet l’identification des cibles moléculaires impliquées dans le processus de remodelage tôt et l’application tôt des interventions thérapeutiques. La limitation du phénotype de HF de MOD est qu’il ne peut pas imiter le spectre des maladies menant au HF systolique dans l’homme. En outre, il est un phénotype difficile à créer, comme la chirurgie AAB est associée à des taux élevés de mortalité et d’échec avec seulement 20% des rats opérés développant le phénotype désiré de HF.

Introduction

L’insuffisance cardiaque (HF) est une maladie répandue et est associée à une morbidité et une mortalité élevées¹. Les modèles de surcharge de pression des rongeurs (PO), produits par le baguage aortique ascendant ou transversal, sont couramment utilisés pour explorer les mécanismes moléculaires menant à la HF et pour tester de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans le HF. Ils imitent également les changements vus dans l’HF humain secondaire à l’hypertension systémique prolongée ou à la sténose aortique grave. Après PO, la paroi ventriculaire gauche (LV) augmente progressivement en épaisseur, un processus connu sous le nom d’hypertrophie concentrique de LV (LVH), pour compenser et adapter l’augmentation du stress de mur de LV. Cependant, cela est associé à l’activation d’un certain nombre de voies de signalisation inadaptées, qui conduisent à des dérangements dans le cyclisme de calcium et l’homéostasie, métabolique et extracellulaire matrice remodelage et les changements dans l’expression des gènes ainsi que l’apoptose améliorée et l’autophagie^2,3,4,5,6. Ces changements moléculaires constituent le déclencheur de l’initiation et de la propagation du remodelage myocardique et de la transition vers un phénotype décompensé de HF.

Malgré l’utilisation de souches de rongeurs consanguines et la normalisation de la taille du clip et de la technique chirurgicale, il existe une variabilité phénotypique énorme dans la structure de la chambre LV et la fonction dans les modèles de baguage aortique^7,8,9. La variabilité phénotypique rencontrée après PO dans le rat, souche Sprague-Dawley, est décrite ailleurs^10,11. De ceux-ci, deux phénotypes de HF sont rencontrés avec l’évidence du remodelage myocardique et l’activation des voies de transduction de signal menant à un état de stress oxydatif accru. Ceci est associé au remodelage métabolique, à l’expression des gènes altérés et aux changements dans la modification posttranslationnelle des protéines, jouant tout à fait un rôle dans le processus de remodelage^10,12. Le premier est un phénotype de remodelage modéré et de dysfonctionnement systolique précoce (MOD) et le second est un phénotype de HF systolique manifeste (HFrEF).

Le modèle DE PO de HF est avantageux par rapport au modèle d’infarctus du myocarde (MI) de HF parce que les contraintes circumferentielles et méridionales induites par le PO sont réparties de façon homogène sur tous les segments du myocarde. Cependant, les deux modèles souffrent de variabilité dans la sévérité de PO^10,11 et dans la taille infarctus^13,14 avec une inflammation intense et des cicatrices au site infarctus¹⁵ ainsi que l’adhésion à la paroi thoracique et les tissus environnants, qui sont observés dans le modèle MI de HF. En outre, le modèle HF induit par le rat PO est difficile à créer car il est associé à des taux élevés de mortalité et d’échec¹⁰, avec seulement 20% des rats opérés développant le phénotype de HF^{MOD 10}.

Le MOD est un phénotype HF attrayant et constitue une évolution du phénotype HFrEF traditionnellement créé car il permet le ciblage précoce des voies de transduction du signal qui jouent un rôle dans le remodelage myocardique, en particulier quand il se rapporte à des perturbations dans la dynamique mitochondriale et la fonction, le métabolisme myocardial, le cycle du calcium et le remodelage de matrice extracellulaire. Ces processus pathophysiologiques sont très évidents dans le phénotype de HF de MOD^11. Dans ce manuscrit, nous décrivons comment créer les phénotypes MOD et HFrEF et nous abordons les pièges tout en effectuant la procédure ascendante de baguage aortique (AAB). Nous avons également élaboré sur la meilleure façon de caractériser par l’échocardiographie les deux phénotypes HF, MOD et HFrEF, et comment les différencier d’autres phénotypes qui ne parviennent pas à développer PO grave ou qui développent po sévère et remodelage concentrique, mais sans remodelage excentrique significatif.

Protocole

Toutes les méthodes et procédures décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’École de médecine de l’Université tulane.

1. Outils et instruments pour la création du modèle AAB

1. Obtenir des désinfectants, comme 70 % d’alcool isopropyl et de povidone-iode.
2. Obtenez de la kétamine et de la xylazine pour l’anesthésie et la buprénorphine pour l’analgésie.
3. Obtenez un coussin chauffant et un sous-bloc jetable à forte absorption avec les dimensions de 18 pouces x 30 pouces.
4. Obtenez un rouleau de ficelle 100% coton, une bande et une tondeuse à cheveux.
5. Obtenir une planche en plastique de 20 cm x 25 cm, l’épaisseur varie entre 3-5 mm.
6. Obtenir un illuminateur de fibre optique Z-LITE.
7. Obtenir un ventilateur mécanique pour les petits animaux (p. ex., SAR-830/AP).
8. Obtenez 2-0 et 3-0 Vicryl sutures effilés et nylon 3-0 suture monofilament, tampons de gaze stériles et stériles extra larges pointes de coton et gants stériles.
9. Obtenez 16 G d’angiocath pour l’intubation.
10. Achetez les outils chirurgicaux suivants.
    1. Obtenez une ligature Hemoclip en acier inoxydable Weck et des clips de ligature en acier inoxydable.
    2. Obtenir des ciseaux d’iris fin durcis.
    3. Obtenir des forceps Adson.
    4. Obtenez deux forceps Graefe incurvés.
    5. Obtenez un halsted-Mosquito Hemostats-straight forceps.
    6. Obtenir un porte-aiguille Mayo-Hegar.
    7. Obtenez un rétracteur de poitrine d’Alm avec des dents émoussées.
11. Utilisez et obtenez un autoclave et un stérilisateur perlé.

2. Procédure chirurgicale de baguage aortique ascendante

1. Anesthésiez l’animal avec une injection intraperitonéale d’un mélange de 75-100 mg/kg de kétamine et de 10 mg/kg de Xylazine.
   REMARQUE : Prévoyez quelques minutes pour que l’animal soit complètement sous sédatif et flasque. Si la dose anesthésique n’est pas suffisante et que l’animal se déplace toujours dans la cage, réinjectez à l’animal la même dose anesthésique après avoir accordé suffisamment de temps, environ 5-10 minutes entre les injections ultérieures. La plupart des animaux ont besoin de 1-2 injections pour atteindre la sédation profonde et l’anesthésie.
2. Rasez les cheveux sur le site chirurgical situé à la zone thoracique latérale droite sous l’aisselle droite.
3. Stabiliser l’animal en scotchant doucement les quatre membres sur la planche en plastique. Ensuite, effectuer l’intubation endotrachéale avec un angiocath de 16 G. Après que l’animal a été intubé avec succès, initier la ventilation mécanique avec des volumes de marée de 2 ml à 50 cycles/min et FiO₂ de 21%. Recherchez l’élévation symétrique de la paroi thoracique à chaque respiration.
4. Tournez l’animal lentement pour s’allonger sur son côté latéral gauche, puis pliez la queue d’une manière en forme de U et stabilisez-la en l’encochant doucement à la planche en plastique. Ensuite, allez-y et désinfectez la zone rasée avec l’application topique de povidone-iode.
5. Infiltrer la peau au site d’incision avec 50/50 mélange par volume de 1-2% Lidocaine/0.25-0.5% Bupivacaine comme analgésie préventive avant de faire l’incision.
6. Effectuer une incision horizontale droite de la peau, 1-2 centimètres de long, dans la zone axillaire droite 1 cm au-dessous de l’aisselle droite. Ensuite, disséquez la couche musculaire thoracique jusqu’à ce qu’elle atteigne la cage thoracique thoracique. Faire une thoracotomie de 1 cm entre la cage thoracique de 2^et 3^rd.
   1. Tout en disséquant la couche musculaire de la poitrine, soyez prudent et évitez les blessures de l’artère axillaire droite, qui passe sous l’aisselle droite.
      REMARQUE : La thoracotomie exécutée entre le^1er et le 2^nd rib comporte le risque de bander l’artère brachiocéphalique droite au lieu de l’aorte ascendante. La thoracotomie entre la^3ème et la quatrième côte rend difficile de visualiser et de bander l’aorte ascendante, comme l’opérateur sera à la recherche de l’oreillette droite.
      REMARQUE : Évitez d’étendre la thoracotomie trop medially vers le sternum pour éviter de disséquer et de blesser l’artère mammaire interne droite.
7. Disséquer les deux lobes de la glande thymus doucement et les pousser à part sur le côté. Ensuite, identifiez l’aorte ascendante et isolez-la du cava supérieur par dissection émoussée par l’intermédiaire d’un Foréfe incurvé.
   REMARQUE : Une manipulation significative de la glande thymus la rendra enflée et rendra difficile la visualisation de l’aorte ascendante.
   1. Disséquez le cava supérieur de vena de l’aorte avec une précaution supplémentaire pour éviter les blessures ou la rupture du cava supérieur de vena, qui est fatale. Cela peut être la partie la plus délicate de la procédure et on s’attend à ce qu’il se produise de temps en temps, même dans les mains les plus expérimentées, mais souvent avec les débutants et les apprenants.
8. Soulevez doucement l’aorte ascendante avec un Foréfe incurvé et placez le clip vasculaire autour de l’aorte ascendante.
   1. Ajuster l’outil de ligature des hémoclips vasculaires via une pièce prédécoupée en plastique de 7 po pour obtenir un clip vasculaire de la zone interne désirée de 1,5 mm² ou 2 mm², selon le modèle HF souhaité.
9. Suture le thorax via une suture Vicryl 2-0 monofilament. Puis suture la couche musculaire de la poitrine via une suture 3-0 Vicryl cône. Puis suture l’incision de la peau par un nylon 3-0 suture monofilament.
10. Administrer une combinaison des médicaments suivants après l’achèvement de la chirurgie pendant 48-72 heures pour servir d’analgésie dans la période postopératoire: 1) Buprénorphine 0.01-0.05 mg/kg sous-cutanée tous les 8-12h, 2) Meloxicam 2 mg/kg sous-cutanée tous les 12h, et 3) Morphine 2,5 mg/kg sous-cutanée tous les 2-4h au besoin pour une douleur intense.
    REMARQUE : Laissez l’animal récupérer sur un coussin chauffant sous surveillance régulière. Une fois que l’animal montre des signes de rétablissement de l’anesthésie (capable de respirer spontanément - sans preuve de haletant ou d’utilisation de muscles accessoires pendant plus de deux minutes - et a de bons réflexes, des extrémités rouges et chaudes), extubate l’animal et le retourner à la cage.

3. Échocardiographie

1. Sedate l’animal avec l’injection intraperitonéale de 80-100 mg/kg de kétamine. Assurer une sédation adéquate pour l’acquisition appropriée d’images d’écho de bonne qualité.
   REMARQUE : L’utilisation de l’isoflurane comme anesthésique est déconseillée pour son effet cardiodépresseur, particulièrement dans le réglage de la surcharge de pression grave et pourrait donner une fausse impression de dilatation de LV et de dysfonctionnement systolique qui résout une fois que l’animal est hors anesthésique.
   1. Soyez prudent et administrez la moitié ou même un tiers de la dose de kétamine chez les animaux qui semblent dyspnéniques et tachypnériques avec suspicion qu’ils ont développé le phénotype HFrEF.
2. Raser les cheveux de la poitrine, antérieurement, dans l’animal complètement sous sédatif.
3. Posez l’animal sur le dos et stabilisez-le sur la planche en plastique.
4. Acquérir 2D parasternal long axe et 2D parasternal short axis view clips au niveau du muscle papillaire. Aussi, obtenir des images en mode M de la vue courte de l’axe parasternal au niveau du muscle papillaire pour mesurer l’épaisseur septale et postérieure de la paroi LV dans la diastole ainsi que le diamètre fin-diastolique et fin-systolique de LV.
   1. Acquérir des images ou des clips à une fréquence cardiaque de 370 à 420 battements par minute pour assurer une évaluation appropriée de la taille et de la fonction de LV. L’acquisition d’images à des fréquences cardiaques plus basses conduira à une fausse impression de la fonction LV déprimée et de la dilatation de LV.
      REMARQUE : L’acquisition d’images/clips d’axe parasternal 2D raccourcis mènent à de fausses mesures. Pour des raisons de contrôle de la qualité, assurez-vous que le sommet LV et l’angle aorto-mitral sont visualisés dans la même coupe de plan.
   2. Acquérir 2D courte vue parasternale de l’axe images / clips au niveau du muscle papillaire mi. Cela servira de référence pour obtenir des mesures de série fiables et de Vbl subséquent tout en suivant les animaux au fil du temps tout au long de la période d’étude.
5. Obtenez des images en mode M dans une longue vue parasternale de l’axe au niveau de la valve aortique pour évaluer le diamètre relatif aortique à gauche de l’atrium (LA) à la systole de fin.
   REMARQUE : Les animaux avec les phénotypes de MOD et de HFrEF devraient montrer l’évidence de la dilatation de LA avec le rapport LA/Ao étant '1.25 et 'lt;1.5 dans le phénotype de HF de MOD et 1.5 dans le phénotype de HFrEF¹⁰.

Résultats

La caractérisation des phénotypes de HF, qui se développent 8-12 semaines suivant AAB, pourrait être facilement exécutée par l’échocardiographie. Les images représentatives en mode M de Sham, Semaine 3 post-AAB, MOD et phénotypes HFrEF sont présentées dans la figure 1A. La figure 1B et la figure 1C montrent la taille du clip vasculaire pour la créat...

Discussion

Suivant PO lié à AAB chez le rat, le LV subit un remodelage concentrique en augmentant l’épaisseur de la paroi de LV, connue sous le nom de LVH concentrique, comme mécanisme compensatoire pour contrer l’augmentation du stress de mur de LV. L’augmentation de l’épaisseur du mur LV se remarque au cours de la première semaine suivant LAB et atteint son épaisseur maximale à 2-3 semaines après l’AAB. Pendant cette période, l’activation des voies de transduction de signal maladaptive mène à l’élargiss...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adson forceps	F.S.T.	11019-12	surgical tool
Alm chest retractor with blunt teeth	ROBOZ	RS-6510	surgical tool
Graefe forceps, curved	F.S.T.	11152-10	surgical tool
Halsted-Mosquito Hemostats, straight	F.S.T.	13010-12	surgical tool
Hardened fine iris scissors, straight	Fine Science Tools F.S.T.	14090-11	surgical tool
hemoclip traditional-stainless steel ligating clips	Weck	523435	surgical tool
Mayo-Hegar needle holder	F.S.T.	12004-18	surgical tool
mechanical ventilator	CWE inc	SAR-830/AP	mechanical ventilator for small animals
Weck stainless steel Hemoclip ligation	Weck	533140	surgical tool