Um modelo de rato de sobrecarga de pressão induzida remodelação moderada e disfunção sistólica em oposição à insuficiência cardíaca sistólica overt

Resumo

Descrevemos a criação de um modelo de rato de sobrecarga de pressão induzida remodelação moderada e disfunção sistólica precoce onde as vias de transdução de sinal envolvidas no início do processo de remodelação são ativadas. Este modelo animal ajudará na identificação de alvos moleculares para a aplicação de estratégias terapêuticas precoces anti-remodelação para insuficiência cardíaca.

Resumo

Em resposta a uma lesão, como infarto do miocárdio, hipertensão prolongada ou agente cardiotóxico, o coração se adapta inicialmente através da ativação de vias de transdução de sinal, para neutralizar, a curto prazo, a perda de miócitos cardíacos e ou o aumento do estresse na parede. No entanto, a ativação prolongada dessas vias torna-se prejudicial levando à iniciação e propagação da remodelagem cardíaca levando a mudanças na geometria ventricular esquerda e aumentos nos volumes ventriculares esquerdos; um fenótipo visto em pacientes com insuficiência cardíaca sistólica (HF). Aqui, descrevemos a criação de um modelo de rato de sobrecarga de pressão induzida por remodelação moderada e disfunção sistólica precoce (MOD) por banda aórtica ascendente (AAB) através de um clipe vascular com uma área interna de 2 mm². A cirurgia é realizada em 200 g de ratos Sprague-Dawley. O fenótipo MOD HF desenvolve-se 8-12 semanas após a AAB e é caracterizado não invasivamente por meio de ecocardiografia. Trabalhos anteriores sugerem a ativação de vias de transdução de sinal e a expressão genética alterada e modificação pós-translacional de proteínas no fenótipo MOD HF que imitam aquelas vistas em HF sistólico humano; portanto, tornando o fenótipo MOD HF um modelo adequado para pesquisas translacionais para identificar e testar potenciais alvos terapêuticos anti-remodelação em HF. As vantagens do fenótipo MOD HF em comparação com o fenótipo hf sistólico é que permite a identificação de alvos moleculares envolvidos no processo de remodelação precoce e a aplicação precoce de intervenções terapêuticas. A limitação do fenótipo MOD HF é que ele pode não imitar o espectro de doenças que levam ao HF sistólico em humanos. Além disso, é um fenótipo desafiador a ser criado, pois a cirurgia AAB está associada a altas taxas de mortalidade e falha com apenas 20% dos ratos operados desenvolvendo o fenótipo HF desejado.

Introdução

A insuficiência cardíaca (FF) é uma doença prevalente e está associada à alta morbidade e mortalidade¹. Os modelos de sobrecarga de pressão de roedores (PO) de HF, produzidos por bandas aórticas ascendentes ou transversais, são comumente usados para explorar mecanismos moleculares que levam ao HF e para testar potenciais novos alvos terapêuticos em HF. Eles também imitam mudanças observadas no HF humano secundário à hipertensão sistêmica prolongada ou estenose aórtica grave. Após po, a parede ventricular esquerda (LV) aumenta gradualmente em espessura, um processo conhecido como hipertrofia LV concêntrica (LVH), para compensar e adaptar-se ao aumento do estresse da parede LV. No entanto, isso está associado à ativação de uma série de vias de sinalização mal adaptáveis, que levam a desarranjos no ciclismo de cálcio e homeostase, remodelação da matriz metabólica e extracelular e alterações na expressão genética, bem como apoptose e autofagia^{aprimoradas 2,3,4,5,6}. Essas mudanças moleculares constituem o gatilho para a iniciação e propagação da remodelagem do miocárdio e transição para um fenótipo HF decompensado.

Apesar do uso de cepas de roedores inadeados e da padronização do tamanho do clipe e da técnica cirúrgica, há uma tremenda variabilidade phenotípica na estrutura da câmara lv e função nos modelos de banda aórtica^7,8,9. A variabilidade faitípica encontrada após po em rato, cepa Sprague-Dawley, é descrita em outro lugar^10,11. Desses, dois fenótipos de HF são encontrados com evidências de remodelação do miocárdio e ativação de vias de transdução de sinal levando a um estado de estresse oxidativo aumentado. Isso está associado à remodelação metabólica, à expressão genética alterada e às alterações na modificação pós-tralácida das proteínas, desempenhando um papel no processo de remodelação^10,12. O primeiro é um fenótipo de remodelação moderada e disfunção sistólica precoce (MOD) e o segundo é um fenótipo de HF sistólico sobreaberto (HFrEF).

O modelo PO de HF é vantajoso sobre o modelo de infarto do miocárdio (MI) de HF porque as tensões de parede circunferencial e merirental induzidas por PO são distribuídas de forma homogênea em todos os segmentos do miocárdio. No entanto, ambos os modelos sofrem de variabilidade na gravidade da PO^10,11 e no tamanho do infarto^13,14 juntamente com inflamação intensa e cicatrizes no local do infarto^15, bem como adesão à parede torácica e tecidos circundantes, que são observados no modelo MI de HF. Além disso, o modelo hf induzido por perfto de rato po é desafiador de criar, pois está associado a altas taxas de mortalidade e falha¹⁰, com apenas 20% dos ratos operados desenvolvendo o fenótipo MOD HF¹⁰.

O MOD é um fenótipo HF atraente e constitui uma evolução do fenótipo HFrEF tradicionalmente criado, pois permite o direcionamento precoce de vias de transdução de sinal que desempenham um papel na remodelação do miocárdio, especialmente quando se refere a perturbações na dinâmica e função mitocondrial, metabolismo miocárdico, ciclismo de cálcio e remodelação da matriz extracelular. Estes processos fisiopatológicos são altamente evidentes no fenótipo MOD HF¹¹. Neste manuscrito, descrevemos como criar os fenótipos MOD e HFrEF e abordamos armadilhas enquanto executamos o procedimento de banda aórtica ascendente (AAB). Também elaboramos sobre como melhor caracterizar pela ecocardiografia os dois fenótipos hf, MOD e HFrEF, e como diferenciá-los de outros fenótipos que não desenvolvem PO grave ou que desenvolvem po severo e remodelação concêntrica, mas sem remodelagem excêntrica significativa.

Protocolo

Todos os métodos e procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Tulane.

1. Ferramentas e instrumentos para criação de modelos AAB

1. Obter desinfetantes, como 70% álcool isopropílico e povidone-iodo.
2. Obtenha cetamina e xilazina para anestesia e buprenorfina para analgesia.
3. Obtenha uma almofada de aquecimento e subpad descartável de absorção pesada com as dimensões de 18 polegadas x 30 polegadas.
4. Obtenha um rolo de fio de algodão 100%, uma fita e um cortador de cabelo.
5. Obter uma placa plástica de 20 cm x 25 cm, faixa de espessura entre 3-5 mm.
6. Obtenha um iluminador de fibra óptica Z-LITE.
7. Obter um ventilador mecânico para animais de pequeno porte (por exemplo, SAR-830/AP).
8. Obtenha suturas de aper de vicryl 2-0 e 3-0 e sutura de monofilamento de nylon 3-0, almofadas de gaze estéreis e pontas de algodão extra grandes estéreis e luvas estéreis.
9. Obtenha angiocath de 16 G para intubação.
10. Compre as seguintes ferramentas cirúrgicas.
    1. Obtenha uma ligadura hemoclip de aço inoxidável Weck e clipes de ligadura de aço inoxidável.
    2. Obter uma tesoura de íris fina endurecida.
    3. Obtenha fórceps Adson.
    4. Obtenha dois fórceps graefe curvos.
    5. Obtenha um hemostats-hemostats-straight de mosquito halsted.
    6. Obtenha um suporte de agulha Mayo-Hegar.
    7. Obtenha um retrátil alm com dentes contundentes.
11. Utilize e obtenha uma autoclave e um esterilizador de bicos.

2. Procedimento cirúrgico de banda aórtica ascendente

1. Anestesiar o animal com uma injeção intraperitoneal de uma mistura de 75-100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de Xilazina.
   NOTA: Aguarde alguns minutos para que o animal esteja completamente sedado e flácido. Se a dose anestéstica não for suficiente e o animal ainda estiver se movendo na gaiola, reinje o animal com a mesma dose anestéstica depois de permitir tempo suficiente, cerca de 5-10 minutos entre as injeções subsequentes. A maioria dos animais necessita de 1-2 injeções para alcançar sedação profunda e anestesia.
2. Raspe o cabelo no local cirúrgico localizado na área torácica lateral direita sob a axila direita.
3. Estabilize o animal batendo suavemente todos os quatro membros na placa de plástico. Em seguida, realize a intubação endotraqueal com um angiocath de 16 G. Após a intubação do animal, inicie a ventilação mecânica com volumes de maré de 2 mL a 50 ciclos/min e FiO₂ de 21%. Procure o aumento simétrico na parede torácica a cada respiração.
4. Gire o animal lentamente para deitar no lado esquerdo lateral e, em seguida, dobre a cauda de forma em U e estabilize-o batendo-o suavemente na placa de plástico. Em seguida, vá em frente e desinfete a área raspada com aplicação tópica de povidone-iodo.
5. Infiltrar-se na pele no local da incisão com mistura de 50/50 em volume de 1-2% lidocaína/0,25-0,5 % bupivacaína como analgesia preventiva antes de fazer a incisão.
6. Realize uma incisão horizontal da pele direita, de 1-2 centímetros de comprimento, na área axilar direita 1 cm abaixo da axila direita. Em seguida, disseque a camada muscular torácica até atingir a caixa torácica. Faça uma toracotomia de 1 cm entre a caixa^torácica 2 e^3.
   1. Ao dissecar a camada muscular do peito, tenha cuidado e evite lesões na artéria axilar direita, que corre por baixo da axila direita.
      NOTA: A toracotomia realizada entre a^1ª e a^2ª costela traz o risco de agrupar a artéria braquicefálica direita em vez da aorta ascendente. A toracotomia entre a^3ª e a quarta costela dificulta a visualização e a banda da aorta ascendente, pois o operador estará olhando para o átrio certo.
      NOTA: Evite estender a toracotomia muito mediadamente em direção ao esterno para evitar dissecar e ferir a artéria mamária interna direita.
7. Disseque os dois lóbulos da glândula timo suavemente e empurre-os para longe do lado. Em seguida, identifique a aorta ascendente e isole-a da veia cava superior por dissecção contundente através de um fórceps graefe curvo.
   NOTA: A manipulação significativa da glândula timo a deixará inchada e dificultará a visualização da aorta ascendente.
   1. Disseque a veia cava superior da aorta com cuidado extra para evitar lesões ou ruptura da veia cava superior, que é fatal. Esta pode ser a parte mais complicada do procedimento e espera-se que aconteça de tempos em tempos mesmo nas mãos mais experientes, mas muitas vezes com iniciantes e aprendizes.
8. Levante suavemente a aorta ascendente com um fórceps graefe curvo e coloque o clipe vascular em torno da aorta ascendente.
   1. Ajuste a ferramenta de ligadura do hemoclipe vascular através de uma peça plástica pré-cortada de 7" para obter um clipe vascular da área interna desejada de 1,5 mm² ou 2 mm², dependendo do modelo HF desejado.
9. Suturar o tórax através de uma sutura de monofilamento Vicryl 2-0. Em seguida, sutura a camada muscular do peito através de uma sutura 3-0 Vicryl. Em seguida, sutura a incisão da pele através de uma sutura de monofilamento nylon 3-0.
10. Administrar uma combinação dos seguintes medicamentos após a conclusão da cirurgia por 48-72 horas para servir como analgesia no período pós-operatório: 1) Buprenorfina 0,01-0,05 mg/kg subcutâneamente a cada 8-12h, 2) Meloxicam 2 mg/kg subcutâneamente a cada 12h, e 3) Morfina 2,5 mg/kg subcutâneamente a cada 2-4h conforme necessário para dor severa.
    NOTA: Deixe o animal se recuperar em uma almofada de aquecimento sob monitoramento regular. Uma vez que o animal apareça sinais de recuperação da anestesia (capaz de respirar espontaneamente - sem evidência de ofegante ou uso de músculos acessórios por mais de dois minutos - e tiver bons reflexos, extremidades vermelhas e quentes), extubar o animal e devolvê-lo à gaiola.

3. Ecocardiografia

1. Sedao o animal com injeção intraperitoneal de 80-100 mg/kg de cetamina. Garantir sedação adequada para aquisição adequada de imagens eco de boa qualidade.
   NOTA: O uso de isoflurano como anestésico é desencorajado para seu efeito cardiodepressor, especialmente na configuração de sobrecarga de pressão severa e pode dar uma falsa impressão de dilatação lv e disfunção sistólica que resolve uma vez que o animal está fora anestésico.
   1. Tenha cuidado e administre metade ou até mesmo um terço da dose de cetamina em animais que parecem disspneicos e taquipneicos com a suspeita de que eles desenvolveram o fenótipo HFrEF.
2. Raspe o cabelo do peito, anteriormente, no animal completamente sedado.
3. Coloque o animal de costas e estabilize-o na placa de plástico.
4. Adquira eixo longo parasternal 2D e clipes de visão de eixo curto parasternal 2D ao nível do músculo papilar. Além disso, obtenha imagens do modo M a partir da visão curta do eixo parasternal ao nível do músculo papilar para medir a espessura da parede septal e posterior de LV em diastole, bem como lv extremidade-diastólica e diâmetro sistólica final.
   1. Adquira imagens ou clipes a uma freqüência cardíaca de 370 - 420 batidas por minuto para garantir uma avaliação adequada do tamanho e função de LV. A aquisição de imagens a taxas cardíacas mais baixas levará a uma falsa impressão de função LV deprimida e dilatação lv.
      NOTA: A aquisição de imagens/clipes de visualização de eixoparasternal 2D encurtados por abreviação de 2D levam a medições falsas. Para fins de controle de qualidade, certifique-se de que o ápice LV e o ângulo aorto-mitral sejam visualizados dentro do mesmo corte de plano.
   2. Adquira imagens/clipes de visualização de eixo parasternal curto 2D ao nível do músculo papilar médio. Isso servirá como referência para obter medições de LV seriais e subseqüentes confiáveis enquanto acompanha os animais ao longo do tempo durante o período de estudo.
5. Obter imagens do modo M em uma visão de eixo parasternal longo no nível da válvula aórtica para avaliar o diâmetro relativo do ártrico a esquerdo (LA) na sístole final.
   NOTA: Os animais com os fenótipos MOD e HFrEF devem apresentar evidências de dilatação la com razão LA/Ao sendo ≥1,25 e <1,5 no fenótipo MOD HF e ≥1,5 no fenótipo HFrEF¹⁰.

Resultados

A caracterização dos fenótipos de HF, que se desenvolvem de 8 a 12 semanas após a AAB, poderia ser facilmente realizada através da ecocardiografia. Imagens representativas do modo M de Sham, Semana 3 pós-AAB, MOD e hfref fenótipos são apresentadas na Figura 1A. A Figura 1B e a Figura 1C estão mostrando o tamanho do clipe vascular para a criação do fen?...

Discussão

Após po relacionado à AAB em rato, o LV passa por remodelação concêntrica aumentando a espessura da parede LV, conhecida como LVH concêntrica, como um mecanismo compensatório para neutralizar o aumento do estresse da parede LV. O aumento da espessura da parede LV torna-se perceptível durante a primeira semana após a AAB e atinge sua espessura máxima em 2-3 semanas após o AAB. Durante esse período, a ativação de vias de transdução de sinal mal adaptáveis leva ao alargamento progressivo do LV com aumentos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adson forceps	F.S.T.	11019-12	surgical tool
Alm chest retractor with blunt teeth	ROBOZ	RS-6510	surgical tool
Graefe forceps, curved	F.S.T.	11152-10	surgical tool
Halsted-Mosquito Hemostats, straight	F.S.T.	13010-12	surgical tool
Hardened fine iris scissors, straight	Fine Science Tools F.S.T.	14090-11	surgical tool
hemoclip traditional-stainless steel ligating clips	Weck	523435	surgical tool
Mayo-Hegar needle holder	F.S.T.	12004-18	surgical tool
mechanical ventilator	CWE inc	SAR-830/AP	mechanical ventilator for small animals
Weck stainless steel Hemoclip ligation	Weck	533140	surgical tool