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要約

ここでは、軽度から中等度の外傷性脳損傷の神経生物学的および病態生理学的影響を調査するためのげっ歯類のための爆風波モデルのプロトコルを提示する。圧力センサーを備えたガス駆動のベンチトップセットアップを確立し、爆風による軽度から中等度の外傷性脳損傷の信頼性と再現性の発生を可能にしました。

要約

外傷性脳損傷(TBI)は、大規模な公衆衛生上の問題です。軽度のTBIは、神経外傷の最も一般的な形態であり、米国で多数の医療訪問を占めています。現在、TBIに利用可能なFDA承認の治療法はありません。軍事関連の爆風誘発性TBIの発生率の増加は、効果的なTBI治療の緊急の必要性をさらに強調する。したがって、ヒト芽球関連TBIの側面を再現する新しい前臨床TBI動物モデルは、軽度から中等度のTBIの根底にある神経生物学的および病態生理学的プロセスの研究努力、ならびにTBIに対する新規治療戦略の開発を大きく前進させるであろう。

ここでは、軽度から中等度の芽球誘発性TBIの分子的、細胞的、および行動的影響の調査のための信頼性が高く再現可能なモデルを提示する。我々は、一貫した試験条件を保証するために圧電圧力センサを備えたガス駆動ショックチューブからなるベンチトップセットアップを使用して、げっ歯類における閉頭、爆風誘発軽度のTBIのためのステップバイステップのプロトコルを説明する。私たちが確立したセットアップの利点は、比較的低コスト、インストールの容易さ、使いやすさ、高スループット容量です。この非侵襲的TBIモデルのさらなる利点には、ブラストピーク過圧のスケーラビリティと制御された再現可能な結果の生成が含まれます。このTBIモデルの再現性と関連性は、神経生物学的、神経病理学的、神経生理学的および行動学的分析を含む多くの下流アプリケーションで評価されており、軽度から中等度のTBIの病因の根底にあるプロセスの特性評価のためのこのモデルの使用を支持している。

概要

外傷性脳損傷(TBI)は、米国だけで毎年200万回以上の病院訪問を占めています。自動車事故、スポーツイベント、または転倒によって一般的に生じる軽度のTBIは、すべてのTBI症例の約80%を占めています1。軽度のTBIは、患者は最初の侮辱の数日後や数ヶ月で明白な症状を経験しないことが多いため、「静かな病気」と考えられていますが、人生の後半で深刻なTBI関連の合併症を発症する可能性があります2。さらに、爆風誘発性軽度のTBIは軍人の間で蔓延しており、慢性CNS機能不全と関連している3,4,5,6。芽球関連軽度TBIの発生率の上昇により7,8、軽度のTBIに関連する神経生物学的および病態生理学的プロセスの前臨床モデリングは、TBIに対する新規治療介入の開発における焦点となっている。

歴史的に、TBI研究は、重篤なヒトTBI症例の数が比較的少ないにもかかわらず、主に重度の形態の神経外傷に焦点を当ててきた。制御された皮質衝撃(CCI)9,10および流体パーカッション傷害(FPI)11モデルを含む、重篤なヒトTBIの前臨床げっ歯類モデルが開発されており、これらは両方とも信頼できる病態生理学的効果を生み出すために十分に確立されている12,13。これらのモデルは、TBIにおける神経炎症、神経変性、およびニューロン修復について今日知られていることの基礎を築いた。TBIの病態生理学に関するかなりの知識が開発されているが、TBIに対して利用可能な有効なFDA承認の治療法は現在存在しない。

より最近では、TBI研究の焦点は、効果的な治療介入を開発するという究極の目標を掲げて、TBI関連病理のより広いスペクトルを含むように拡大されている。それにもかかわらず、測定可能な効果を示した軽度のTBIの前臨床モデルはほとんど確立されておらず、軽度のTBIスペクトルを調査した研究はごくわずかです2,14,15。軽度のTBIがすべてのTBI症例の大多数を占めるため、新しい治療戦略を開発するために、ヒトの状態の病因および神経病態生理学の研究を促進するために、軽度のTBIの信頼できるモデルが緊急に必要である。

生物医学エンジニアや航空宇宙物理学者と協力して、軽度から中等度のTBIのためのスケーラブルでクローズドヘッドブラストウェーブモデルを確立しました。この前臨床げっ歯類モデルは、軍事戦闘、スポーツイベント、自動車事故、転倒で得られた人間の軽度のTBIに関連する爆風波や加速/減速運動などの力力学の影響を調べるために特別に開発されました。爆風波はヒトで軽度のTBIを引き起こす力力ダイナミクスと相関するため、このモデルは、ポンド/平方インチ(psi)*ミリ秒(ms)として測定されるインパルスで一貫したフリードランダー波形を生成するように設計されています。インパルスレベルは、前臨床調査を実施するために、マウスおよびラットについて定義された肺致死率曲線を下回るようにスケーリングされます16,17,18。さらに、このモデルは、動物の頭の急速な回転力によるクーデターおよびコントレクティブ傷害の調査を可能にする。この種の傷害は、軍人および民間人集団の両方で観察されるものを含む、いくつかのタイプの臨床TBI提示に固有のものである。したがって、この汎用性の高いモデルは、TBIの複数の臨床提示を包含するニーズに適合する。

ここで提示された前臨床モデルは、多数の先行研究によって実証されているように、臨床的軽度TBIに関連する信頼性が高く再現可能な病態生理学的変化を生じる17、19、20、21、22、23。このモデルを用いた研究では、低強度の芽球波を受けたラットが、神経炎症、軸索損傷、微小血管損傷、神経細胞損傷に関連する生化学的変化、および短期可塑性およびシナプス興奮性の欠損を示すことが示されました19。しかし、この軽度のTBIモデルは、中等度から重度の侵襲的TBIモデルを用いた研究で一般的に観察されている組織損傷、出血、血腫および挫傷19を含む巨視的な神経病理学的変化を誘発しなかった10,24。以前の研究19,21,22,23は、この前臨床モデルが、軽度および中等度のTBIの病因の根底にある神経生物学的および病態生理学的プロセスを特徴付けるために使用され得ることを示している17,19,20,21,22,23。 このモデルはまた、新しい治療化合物および戦略の試験、ならびに効果的なTBI介入の開発のための新規で適切な標的の同定を可能にする19,21,22,23。

このモデルは、げっ歯類の分子、細胞、行動の結果に対する爆風波と急速な回転力によって誘発される影響を調べるために開発されました。ここで提示された爆風波モデルと同様に、ガス駆動の過圧波を用いて軽度から中等度のTBIを再現しようとする多くの前臨床モデルが開発されている2,14,17,25,26,27,28。他のモデルの制限のいくつかが含まれます:動物は金網のガーニーに固定され、頭は衝撃時に固定されます。末梢器官は脳に加えて波にさらされ、多発性外傷の交絡変数を作り出す。また、モデルは大きくて静止しているため、重要なパラメータを変更して、人間のTBIを連想させるより良いモデル条件に適応させることが制限されます。

このベンチトップのガス駆動ショックチューブセットアップの利点は、取得およびランニングコストが比較的低コストであること、および設置と使いやすさです。さらに、このセットアップにより、マウスとラットの両方で、ハイスループットな操作と制御された再現可能なブラスト波と in vivo 結果の生成が可能になります。一貫した試験条件(すなわち、一定のブラスト波および過圧)を制御するために、セットアップには圧力センサが装備されています。TBIに対するこのモデルの利点には、傷害の重症度のスケーラビリティと、軽度のTBIが非侵襲的で閉鎖的な頭部処置を使用して誘導されることが含まれる。ピーク過圧とそれに続く脳損傷は、より厚いポリエステル膜とともに、一貫したスケーラブルな方法で増加します17。TBIの重症度を膜厚によってスケーリングする能力は、特定の転帰尺度(例えば、神経炎症)が明らかになるレベルを決定するための有用なツールである。末梢器官に保護遮蔽を提供することで、肺または胸部損傷などの全身損傷の交絡変数を回避または低減することによって、軽度のTBIメカニズムへの集中的な調査も可能になる。さらに、この設定により、爆風波が頭部に当たる/貫通する方向(すなわち、正面から、側面、上または下)を選択できるため、さまざまな種類のTBI誘発侮辱を調査できます。ここで説明する軽度から中等度のTBIを誘導する標準的な手順は、急速な回転力によるクーデターおよびコントレクエイプ傷害と組み合わせた爆風波傷害の影響を評価するために、側方暴露を使用する。さらに、もっぱら爆風誘発傷害を調査するために、このモデルではトップダウン爆風波ばく露を採用することができる。

プロトコル

このプロトコルは、シンシナティ大学とウェストバージニア大学の動物ケアガイドラインに準拠しています。動物を含むすべての手順は 、施設動物 ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、 実験動物のケアおよび使用のためのガイドの原則に従って実施された。

1. ブラストTBIセットアップのインストール

  1. スチール製駆動およびドライバセクションからなるショックチューブ、ポリエステルメンブレン、固定ボルト、圧力センサ、周辺臓器を保護するポリ塩化ビニル(PVC)パイプシールド、9.53mm高圧油圧ラインとクイック接続オスおよびメスアタッチメント、高流量ガスレギュレータ、壁掛けブラケット付きガスボンベなど、セットアップに必要なすべての作業部品を入手してください( 図1A、B および 材料表)。
    注:ここで使用される駆動およびドライバセクション(図2および材料表を参照)の仕様は、マウスに軽度から中等度のTBIを誘導するために、一貫した短時間のスケールブラスト波(図3C、Dを参照)を生成するために確立されています。この目的のために、テーパ設計(6°テーパ)の短いドライバセクションが選択されました。駆動部と駆動部の長さと直径は、ブラスト波29、30、31、32、圧縮波18、または衝撃波ダイナミクス33を具体的に研究するように変更することができます。ラットを用いた実験では、ショックチューブの寸法を、関連する身体スケーリングパラメータ17を保持するに従って同等の力をもたらすように適合させる必要があります(材料表を参照)。
  2. セットアップの個々の作業部品を、動物実験用に承認された実験室スペースの安定した清掃が容易な表面(好ましくはげっ歯類に使用するためのステンレス鋼)に固定された機械スライドテーブルに取り付けます。
    注:ブラスト波実験では、かなりのレベルのノイズが生成されます。したがって、騒音が他の実験/実験室グループと干渉しない吸音実験室空間内の場所を選択してください。
    1. PVCパイプシールドをショックチューブのセットアップに垂直に固定して、げっ歯類の体が完全に覆われ、頭だけが突き出るようにします。
      注:ここで説明する軽度から中等度のTBIを誘導するための標準的な手順では、頭部の中心はマウスの駆動部の端部から5cmに位置する。
    2. OSHAおよび他のすべての関連する安全規制に従って、セットアップのすぐ近くにある壁掛けガスボンベ。
      注:圧縮空気、ヘリウムまたは窒素ガスは、げっ歯類ショックチューブモデルでブラスト波を生成するために一般的に使用されます。ここに提示されたすべてのデータは、このガスがより短い期間にわたってより高い過圧を生成するため、ヘリウムを使用して生成されており34、マウスの被験者に適切なスケーリングを可能にする。

2.圧力センサー記録を使用したセットアップとブラスト波特性の評価。

  1. ショックチューブを用意します。
    1. 一貫した破裂を確実にするために、ポリエステル膜を曲げたり亀裂を生じさせたりすることなく慎重に切断してください。
    2. 駆動セクションとドライバセクションの間にメンブレンを挿入します。接続ボルトを締め付けてセクションを固定します。
    3. システムが気密で、メンブレンが運転部と駆動部の間にしっかりと固定されていることを確認します。
    4. 9.53mm高圧油圧ホースを介してガスタンクを接続し、アタッチメントをショックチューブにすばやく接続します
      メモ:ドライバセクションと駆動セクションは、セクション間の膜の完全なシールを可能にするために、正確な公差に機械加工されています。これにより、ガス漏れがなく、あらゆる形態のガスケット/Oリング材料の使用が排除され、生成された波形の一貫性が向上します。
  2. ブラスト波を監視するための圧力センサを取り付けます( 図1C参照)。
    1. ヘッド配置領域に 1 つの圧力センサーを配置し、衝撃管の出口に 3 つのセンサーを配置します ( 図 1C および 2 を参照)。
    2. ブラストウェーブの実行直前に、圧力センサーから記録を開始します。センサ信号コンディショナとデータ収集ボードを使用して、圧力波データを毎秒50万フレームで記録します( 材料表を参照)。
      注:OHSA承認のイヤーマフを着用して、適切な聴覚保護を確保してください。
    3. 圧縮ガスタンクのメインバルブを完全に開き、ガスの流れが突然の急速な圧力スパイクを発生させます。
      注:ガス過圧はポリエステル膜を破裂させ、駆動部内で圧縮波に遷移し、ヘッド配置領域の方向にチューブから出る衝撃波を放出します。
    4. 処置の直後にガスの流れを止めなさい。
      メモ:セットアップには、ガスの流れを自動的かつ迅速に停止するためのスプリングリターンバルブを装備することができます。
    5. カスタム記述コンピュータプログラムを使用して圧力波の記録を分析し、ピーク過圧を決定し、データをグラフ化します。データは、各センサで個別にグラフ化することも、互いに重ね合わせて、生成された波の平面性を示すこともできます( 図3C、Dを参照)。
      注:解析は技術的には、より容易に入手可能なソフトウェアを使用して行うことができますが、データセットが大きいため、これらのプログラムはプロットの生成に長い遅延があります。
  3. 指定されたTBI研究の目的に適切な実験条件を確立し、モデルがフリードランダー波に匹敵するピーク過圧、持続時間、およびインパルス測定で一貫したブラスト波を生成することを確認します( 図3参照)。前述のコンピュータソフトウェアを使用して、これらのパラメータを確認します。
    1. 手順 2.1.1 を繰り返して、セットアップを調整します。2.2.5 まで。圧力波の記録を使用して、セットアップに調整が必要かどうかを判断します(代表的なデータについては 、図3を参照してください)。
    2. セットアップを変更します (必要な場合)。
      注:ブラスト波の特性は、セットアップのマイナーな変更によって調整できます。例えば、被駆動部の端部までのヘッドの距離は、ヘッドのレベルで爆風波力に影響する。ポリエステル膜の厚さはピーク過圧のレベルを決定し、膜が厚いほどピークレベルが増加します( 図3A、Bを参照)。さらに、このセットアップにより、爆風波が頭部に当たる/貫通する方向(すなわち、正面オン、サイド、トップまたはアンダー)を選択できるため、ブラスト波傷害を単独で、またはクーデターと組み合わせて、急速な回転力によるコントレク傷害など、さまざまな側面を調査することができます。
    3. 手順 2.1.1 ~ 2.2.4 を繰り返して、必要なブラスト波特性 (必要な場合) を確立し、再現性を制御します。
    4. 異なる厚さのポリエステル膜で手順2.1.1~2.2.4を繰り返して、セットアップのスケーラビリティを評価します(代表的なデータについては、 図3A、Bを参照してください)。

3. げっ歯類における実験セットアップの準備と軽度のTBIの誘導

注:TBI実験開始の30分〜1時間前にげっ歯類を保持領域に移して順応させる。手順の異音の影響を最小限に抑える保持領域を選択します。

  1. 実験に必要なすべての材料を準備し、適切な設置のためのセットアップを確認します(例えば、研究の目的に応じてパラメータを調整します)(〜5〜10分)。
    注:傷害の重症度は、ポリエステル膜の厚さを選択することによって調整することができる。我々の研究に基づいて、25.4〜102μmの膜厚がマウスの軽度から中等度のTBIに利用されている35。我々は以前、ラットにおいて軽度から中等度のTBIを生成するために、厚さ76.2〜127μmの膜を利用した19。
    1. ポリエステルメンブレンを慎重に切断し、駆動部とドライバ部の間に挿入し、接続ボルトを締め付けて固定します。
    2. クイックリリース継手を使用して、ガスタンクをショックチューブに接続します。メンブレンがドライバーセクションと駆動セクションの間にしっかりと固定されていることを確認します。
    3. 衝撃管の出口に 3 つの圧力センサーを 120° 離して配置し、ステップ 2.2.2 および 2.2.5 で説明したように、TBI 誘導中のブラスト波特性を監視します。
    4. ショックチューブ装置の端部からの距離が、設置されたマイクロメータを使用して各被験者に対して正しいことを確認する。げっ歯類の頭の位置(すなわち、位置、距離)を研究内で一定に保ち、一貫した傷害評価を可能にする。
      注: 1.2.1 で述べたように、爆風波が頭部に当たる方向を選択することで、さまざまな種類の傷害を誘発できます。ここで説明する軽度から中等度のTBIを誘導する手順のために、身体は、爆風波が頭の側面に衝突するショックチューブに対して垂直に配置される。この設定では、頭部は自由な移動性を許容され、したがって、爆風波および急速な回転力にさらされ、クーデターおよびコントレクープ効果の発生を可能にする。
    5. ソフトウェアのグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)を使用して、圧力センサーから記録を開始します。
  2. セットアップにおける麻酔とげっ歯類の位置決め
    1. げっ歯類を収容室から移し、酸素中の4%イソフルランで麻酔を誘発し、酸素中に2%イソフルランで維持して苦痛と痛みを軽減する。
      注:先に進む前に、動物がつま先や尾のピンチに反応しないことを確認してください。麻酔の誘導が、偽対照を含むすべての実験動物について一貫していることを確認してください。この手順は、麻酔の低レベルかつ短い期間を必要とします.
    2. 完全に麻酔をかけられたげっ歯類をクッション性のあるPVCパイプシールドに入れて、末梢器官を爆風波から保護します。
      注:対照被験者は麻酔をかけられ、セットアップの近くに配置されますが、ブラスト波に直接さらされることはありません。コントロールがショックチューブから発生するノイズにさらされていることを確認します。
    3. げっ歯類の頭部を頭部配置領域内に置き、遮蔽装置に直接組み込まれた支持体またはガーゼパッドのいずれかによって下から支持する。個々のげっ歯類の解剖学的構造に従って頭部の位置合わせを決定し、後頭顆を保護シールドの端に合わせる。
      注:死亡率を下げるために、圧力波を脳幹に直接向けることは避けてください。脳幹および頸部脊髄の呼吸中枢への損傷は、TBI36、37、38のげっ歯類モデルにおける呼吸異常および死にさえも寄与することが知られている。
  3. げっ歯類の爆風波への暴露。
    1. 圧縮ガスタンクのメインバルブを素早く開き、膜を破裂させる圧力スパイクを生成し、圧力波の発生を確認する大きな爆発を生成します。膜は、実験後に除去すると視覚的に破裂する。
      注:高速カメラを使用して、げっ歯類が経験する回転加速度のクーデターおよびコントレクエフェクトをキャプチャし、さらなる分析を行うことができます。
    2. 爆発を聞いた直後にガスの流れを止めてください。
  4. 爆風被曝からの回復
    1. 爆風波暴露後、げっ歯類を装置から取り出し、その側のショックチューブに直接隣接する平らな面に置きます。
    2. 被験者を監視して、正しい反射時間(RRT)を決定します。ストップウォッチを使用して、爆風の暴露から本来の右反射を取り戻すまでの時間を記録します。( 図4A参照)。
    3. 被験者が正しい反射を取り戻したらすぐに、それぞれの家のケージに入れ、そこで次の24時間、有害反応(発作、呼吸困難、身体開口部からの出血)を監視します。
    4. 最初のモニタリング期間の後、被験者は、研究者の選択の様々な生化学的、神経病理学的、神経生理学的、および行動学的アッセイを用いて分析することができる(下記参照)。
  5. 次の実験のためのセットアップとスペースを準備します。
    1. 洗剤でセットアップをきれいにして臭いを取り除きます。

4. 爆風波/回転力および制御にさらされるげっ歯類の下流用途

注:以前の研究では、爆風波および回転力に曝露した後の様々な時点での軽度から中等度のTBIの影響を、生化学的、神経病理学的、神経生理学的、および行動学的分析を含む下流のアプリケーションを用いてげっ歯類において評価した19。

  1. 生化学分析
    1. 定義された実験時点(軽度のTBI後数時間〜数日)で、組織(例えば、脳、血液)を採取し、記載されるような標準的なプロトコールを用いた生化学的分析を行う19。
    2. 組織を生化学的分析(すなわち、イムノブロッティング、ELISAなど)に使用して、神経生物学的および病態生理学的プロセスに対する軽度のTBIの影響を評価する。
  2. 神経病理学的解析
    1. 定義された実験時点(軽度のTBI後の数時間〜数日)で、げっ歯類を生理食塩水に続いて4%パラホルムアルデヒド溶液で経心的に灌流し、記載されているように組織を固定する19。
      注:一部の用途はパラホルムアルデヒド固定と互換性がありません(例えば、銀染色、免疫組織化学のためのいくつかの抗体)。
    2. 解剖学的、組織学的、分子的解析に灌流された固定組織を使用して、神経炎症、神経変性、および記載されているような神経化学的変化を含む軽度のTBIに関連する神経病理学的変化を評価します19。
  3. 脳スライスにおける神経生理学的解析
    1. 定義された実験時点(軽度のTBI後数時間から数日)で、げっ歯類を断頭によって屠殺し、脳を除去し、記載されているように脳スライスを調製する19。
    2. 基底シナプス特性およびシナプス可塑性に対する軽度のTBIの影響を評価するために、記載されているように電気生理学的記録19 を行う。
  4. 行動分析
    1. 定義された実験時点(軽度のTBI後の数時間から数日)で、運動機能(例えば、野外、ロタロッド、自発運動活動; 図4D参照)および学習および記憶(例えば、恐怖条件付け、バーンズ迷路、モリス水迷路)を含む行動性能を評価する。

結果

ブラスト波セットアップのスケーラビリティは、25.4、50.8、76.2 μmの3つの異なる膜厚を使用してテストされました。ピーク圧力レベルは、圧電圧力センサを用いてショックチューブ装置のヘッド配置領域および出口において評価された(図 1 および 図2を参照のこと)。ピーク圧力は、両方のセンサ位置で膜厚と一致して増加し(図3A

ディスカッション

ここでは、費用対効果が高く、セットアップと実行が容易で、高スループットで信頼性が高く、再現性のある実験結果を可能にする前臨床軽度TBIモデルを紹介します。このモデルは、末梢器官に保護シールドを提供し、軽度のTBIメカニズムへの集中的な調査を可能にしながら、全身損傷の交絡変数を制限する。対照的に、他の爆風モデルは末梢器官に損傷を与えることが知られている

開示事項

著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。

謝辞

我々は、TBIモデルの開発に貢献したR. Gettens、N. St. Johns、P. Bennet及びJ. Robsonに感謝する。Brain & Behavior Research Foundation(F.P.およびM.J.R.)からのNARSAD Young Investigator Grants、Darrell K. Royal Research Fund for Alzheimer's Disease(F.P.)からの研究助成金、PhRMA Foundation Award(M.J.R.)がこの研究を支援しました。この研究は、米国薬学教育財団(A.F.L.およびB.P.L.)の博士前フェローシップを通じて支援されました。

資料

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