Low-Intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-Head Mild Traumatic Brain Injury bei Nagetieren

Zusammenfassung

Wir stellen hier ein Protokoll eines Blastwellenmodells für Nagetiere vor, um neurobiologische und pathophysiologische Wirkungen von leichten bis mittelschweren traumatischen Hirnverletzungen zu untersuchen. Wir haben ein gasbetriebenes Tisch-Setup etabliert, das mit Drucksensoren ausgestattet ist, die eine zuverlässige und reproduzierbare Erzeugung von blastinduzierten leichten bis mittelschweren traumatischen Hirnverletzungen ermöglichen.

Zusammenfassung

Schädel-Hirn-Trauma (TBI) ist ein großes Problem der öffentlichen Gesundheit. Mildes TBI ist die häufigste Form von Neurotrauma und macht eine große Anzahl von Arztbesuchen in den Vereinigten Staaten aus. Es gibt derzeit keine von der FDA zugelassenen Behandlungen für TBI. Die erhöhte Inzidenz von militärischen, explosionsinduzierten TBI unterstreicht die dringende Notwendigkeit wirksamer TBI-Behandlungen zusätzlich. Daher werden neue präklinische TBI-Tiermodelle, die Aspekte des blastenbedingten SHT beim Menschen rekapitulieren, die Forschungsanstrengungen zu den neurobiologischen und pathophysiologischen Prozessen, die leichten bis mittelschweren SHT zugrunde liegen, sowie die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien für TBI erheblich voranbringen.

Hier stellen wir ein zuverlässiges, reproduzierbares Modell zur Untersuchung der molekularen, zellulären und Verhaltenseffekte von leichten bis mittelschweren blasteninduzierten TBI vor. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für explosionsinduzierte leichte TBI mit geschlossenem Kopf bei Nagetieren unter Verwendung eines Tischaufbaus, der aus einem gasbetriebenen Schockrohr besteht, das mit piezoelektrischen Drucksensoren ausgestattet ist, um konsistente Testbedingungen zu gewährleisten. Die Vorteile des Setups, das wir etabliert haben, sind die relativ niedrigen Kosten, die einfache Installation, die Benutzerfreundlichkeit und die hohe Durchsatzkapazität. Weitere Vorteile dieses nicht-invasiven TBI-Modells sind die Skalierbarkeit des Blast-Peak-Überdrucks und die Generierung kontrollierter reproduzierbarer Ergebnisse. Die Reproduzierbarkeit und Relevanz dieses TBI-Modells wurde in einer Reihe von nachgelagerten Anwendungen bewertet, einschließlich neurobiologischer, neuropathologischer, neurophysiologischer und Verhaltensanalysen, die die Verwendung dieses Modells zur Charakterisierung von Prozessen unterstützen, die der Ätiologie von leichten bis mittelschweren TBI zugrunde liegen.

Einleitung

Schädel-Hirn-Trauma (TBI) macht allein in den Vereinigten Staaten jedes Jahr mehr als zwei Millionen Krankenhausbesuche aus. Leichte SHT-Werte, die häufig auf Autounfälle, Sportereignisse oder Stürze zurückzuführen sind, machen etwa 80 % aller ^{TBI-Fälle aus1.} Mildes SHT gilt als die "stille Krankheit", da Patienten in den Tagen und Monaten nach der ersten Beleidigung oft keine offensichtlichen Symptome haben, aber später im Leben ernsthafte TBI-bedingte Komplikationen entwickeln ^können2. Darüber hinaus ist blasteninduziertes mildes TBI unter Militärangehörigen weit verbreitet und wurde mit chronischer ZNS-Dysfunktion in Verbindung gebracht3,4,5,6. Aufgrund der steigenden Inzidenz von blastenbedingtem mildem ^TBI7,8 ist die präklinische Modellierung neurobiologischer und pathophysiologischer Prozesse im Zusammenhang mit leichtem SHT daher zu einem Schwerpunkt bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen für TBI geworden.

In der Vergangenheit hat sich die TBI-Forschung in erster Linie auf schwere Formen von Neurotraumata konzentriert, trotz der relativ geringeren Anzahl schwerer menschlicher TBI-Fälle. Es wurden präklinische Nagetiermodelle für schweres menschliches SHT entwickelt, einschließlich der Modelle Controlled Cortical Impact (CCI)9,10 und Fluid Percussion Injury (FPI)11, die beide gut etabliert sind, um zuverlässige pathophysiologische Wirkungen zu ^{erzielen12,13}. Diese Modelle haben den Grundstein für das gelegt, was heute über Neuroinflammation, Neurodegeneration und neuronale Reparatur bei TBI bekannt ist. Obwohl beträchtliche Kenntnisse über die Pathophysiologie von TBI entwickelt wurden, gibt es derzeit keine wirksamen, von der FDA zugelassenen Behandlungen für TBI.

In jüngerer Zeit wurde der Schwerpunkt der TBI-Forschung auf ein breiteres Spektrum von TBI-bezogenen Pathologien ausgeweitet, mit dem ultimativen Ziel, wirksame therapeutische Interventionen zu entwickeln. Dennoch wurden nur wenige präklinische Modelle für leichte TBI etabliert, die messbare Effekte gezeigt haben, und nur eine kleine Anzahl von Studien hat das milde ^TBI-Spektrum untersucht2,14,15. Da milde TBI die große Mehrheit aller TBI-Fälle ausmachen, werden zuverlässige Modelle für milde TBI dringend benötigt, um die Erforschung der Ätiologie und Neuropathophysiologie des menschlichen Zustands zu erleichtern, um neuartige therapeutische Strategien zu entwickeln.

In Zusammenarbeit mit biomedizinischen Ingenieuren und Luft- und Raumfahrtphysikern haben wir ein skalierbares, geschlossenes Blastwellenmodell für leichte bis mittelschwere TBI etabliert. Dieses präklinische Nagetiermodell wurde speziell entwickelt, um die Auswirkungen der Kraftdynamik zu untersuchen, einschließlich Explosionswellen und Beschleunigungs- / Verzögerungsbewegungen, die mit dem leichten SHT des Menschen verbunden sind, das bei militärischen Kämpfen, Sportveranstaltungen, Autounfällen und Stürzen erhalten wird. Da Explosionswellen mit der Kraftdynamik korrelieren, die beim Menschen leichte TBI verursacht, wurde dieses Modell entwickelt, um eine konsistente Friedlander-Wellenform mit einem Impuls zu erzeugen, der als Pfund pro Quadratzoll (psi) * Millisekunde (ms) gemessen wird. Das Impulsniveau wird skaliert, um unter definierte Lungenletalitätskurven für Mäuse und Ratten zu fallen, um präklinische Studien ^{durchzuführen16,17,18}. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell die Untersuchung von Putsch- und Contrecoup-Verletzungen aufgrund schneller Rotationskräfte des Tierkopfes. Diese Art von Verletzung ist verschiedenen Arten von klinischen TBI-Präsentationen inhärent, einschließlich derer, die sowohl bei der militärischen als auch bei der zivilen Bevölkerung beobachtet werden. Daher passt dieses vielseitige Modell zu einem Bedarf, der mehrere klinische Präsentationen von TBI umfasst.

Das hier vorgestellte präklinische Modell erzeugt zuverlässige und reproduzierbare pathophysiologische Veränderungen im Zusammenhang mit klinisch mildem SHT, wie eine Reihe früherer Studien gezeigt hat17,19,20,21,22,23. Studien mit diesem Modell zeigten, dass Ratten, die einer Blastenwelle niedriger Intensität ausgesetzt waren, Neuroinflammation, axonale Verletzungen, mikrovaskuläre Schäden, biochemische Veränderungen im Zusammenhang mit neuronalen Verletzungen und Defizite in der kurzfristigen Plastizität und synaptischen Erregbarkeit ^aufwiesen19. Dieses milde TBI-Modell induzierte jedoch keine makroskopischen neuropathologischen Veränderungen, einschließlich Gewebeschäden, Blutungen, Hämatomen und Prellungen19, die in Studien mit mittelschweren bis schweren invasiven TBI-Modellen häufig beobachtet ^wurden10,24. Frühere Forschungen19,21,22,23 haben gezeigt, dass dieses präklinische Modell verwendet werden kann, um neurobiologische und pathophysiologische Prozesse zu charakterisieren, die der Ätiologie von leichtem und mittelschwerem TBI17,19,20,21,22,23 zugrunde liegen. Dieses Modell ermöglicht auch die Erprobung neuer therapeutischer Verbindungen und Strategien sowie die Identifizierung neuartiger, geeigneter Ziele für die Entwicklung wirksamer TBI-Interventionen19,21,22,23.

Dieses Modell wurde entwickelt, um die durch Explosionswellen induzierten Effekte sowie schnelle Rotationskräfte auf molekulare, zelluläre und Verhaltensergebnisse bei Nagetieren zu untersuchen. Analog zum hier vorgestellten Blastwellenmodell wurde eine Reihe präklinischer Modelle entwickelt, die versuchen, leichte bis mittelschwere TBI mit gasgetriebenen Überdruckwellen 2,14,17,25,26,27,28 zu rekapitulieren. Einige der Einschränkungen anderer Modelle sind: Das Tier wird an einer Drahtgittergurney befestigt und der Kopf wird beim Aufprall immobilisiert; die peripheren Organe sind zusätzlich zum Gehirn der Welle ausgesetzt, wodurch die verwirrenden Variablen des Polytraumas erzeugt werden; und die Modelle sind groß und stationär, was das Ändern und Anpassen kritischer Parameter an bessere Modellbedingungen einschränkt, die an menschliches SHT erinnern.

Die Vorteile dieses Bench-Top-Gasstoßdämpferrohr-Setups sind die relativ niedrigen Kosten für Anschaffungs- und Betriebskosten sowie die einfache Installation und Verwendung. Darüber hinaus ermöglicht das Setup den Hochdurchsatzbetrieb und die Erzeugung von kontrollierten reproduzierbaren Blastwellen und In-vivo-Ergebnissen sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten. Zur Kontrolle gleichbleibender Prüfbedingungen (d.h. konstante Strahlwelle und Überdruck) ist der Aufbau mit Drucksensoren ausgestattet. Zu den Vorteilen dieses Modells für TBI gehören die Skalierbarkeit der Schwere der Verletzung und die Induktion eines leichten TBI durch ein nicht-invasives, geschlossenes Kopfverfahren. Spitzenüberdruck und anschließende Hirnverletzungen nehmen mit dickeren Polyestermembranen in konsistent skalierbarer Weise ^zu17. Die Fähigkeit, den Schweregrad der TBI durch die Membrandicke zu skalieren, ist ein nützliches Werkzeug, um das Niveau zu bestimmen, bei dem spezifische Ergebnismaße (z. B. Neuroinflammation) offensichtlich werden. Die Bereitstellung einer Schutzabschirmung für die peripheren Organe ermöglicht auch eine gezielte Untersuchung leichter TBI-Mechanismen, indem Störvariablen von systemischen Verletzungen, wie Lungen- oder Thoraxverletzungen, vermieden oder reduziert werden. Darüber hinaus ermöglicht dieser Aufbau die Auswahl der Richtung, in der die Explosionswelle den Kopf trifft / durchdringt (dh frontal, seitlich, oben oder unten) und daher können verschiedene Arten von TBI-induzierenden Beleidigungen untersucht werden. Das hier beschriebene Standardverfahren zur Induktion von leichtem bis mittelschwerem SHT verwendet eine seitliche Exposition, um die Auswirkungen einer Explosionswellenverletzung in Kombination mit einer Coup- und Contrecoup-Verletzung aufgrund schneller Rotationskräfte zu bewerten. Um ausschließlich blasteninduzierte Verletzungen zu untersuchen, kann in diesem Modell eine Top-Down-Blastwellenexposition eingesetzt werden.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Tierpflegerichtlinien der University of Cincinnati und der West Virginia University. Alle Verfahren mit Tieren wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) genehmigt und nach den Grundsätzen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

1. Installation des blast TBI-Setups

1. Erwerben Sie alle Arbeitsteile, die für das Setup erforderlich sind, einschließlich: Stoßrohr bestehend aus Stahlantriebs- und Treiberprofil, Polyestermembran, Sicherungsschrauben, Drucksensoren, Polyvinylchlorid (PVC) Rohrabschirmung zum Schutz peripherer Organe, 9,53 mm Hochdruckhydraulikleitung und Schnellanschluss-Stecker- und Buchsenaufsätze, Gasregler mit hohem Durchfluss und eine Gasflasche mit Wandhalterung (siehe Abbildung 1A, B und Materialtabelle).
   HINWEIS: Die Spezifikationen des hier verwendeten Antriebs- und Treiberabschnitts (siehe Abbildung 2 und Materialverzeichnis) wurden festgelegt, um eine konsistente kurzzeitige skalierte Blastwelle (siehe Abbildung 3C,D) zu erzeugen, um bei Mäusen leichte bis mittelschwere TBI zu induzieren. Zu diesem Zweck wurde ein konisch gestalteter (6° Taper) kurzer Treiberabschnitt gewählt. Die Länge und der Durchmesser der angetriebenen und Treiberabschnitte können modifiziert werden, um speziell die Strahlwelle ^29,30,31,32, die Kompressionswelle18 oder die Stoßwellendynamik33 zu erforschen. Für Versuche mit Ratten müssen die Abmessungen des Stoßrohrs angepasst werden, um vergleichbare Kräfte entsprechend den relevanten Körperskalierungsparametern zu ^erhalten17 (siehe Materialtabelle).
2. Installieren Sie die einzelnen Arbeitsteile des Aufbaus auf Maschinenschiebetischen, die auf einer stabilen, leicht zu reinigenden Oberfläche (vorzugsweise Edelstahl für den Einsatz bei Nagetieren) im für Tierversuche zugelassenen Laborraum befestigt sind.
   HINWEIS: Die Explosionswellenexperimente erzeugen einen beträchtlichen Geräuschpegel; Wählen Sie daher einen Ort innerhalb des schallabsorbierenden Laborraums, an dem Lärm andere Experimente / Laborgruppen nicht beeinträchtigt.
   1. Befestigen Sie die PVC-Rohrabschirmung senkrecht zum Stoßrohr, so dass der Körper des Nagetiers vollständig bedeckt ist und nur der Kopf hervorsteht.
      HINWEIS: Für das hier beschriebene Standardverfahren zur Induktion eines leichten bis mittelschweren SHT befindet sich die Mitte des Kopfes 5 cm vom Ende des getriebenen Abschnitts für Mäuse entfernt.
   2. Wandmontage Gasflasche in unmittelbarer Nähe zum Aufbau in Übereinstimmung mit OSHA und allen anderen relevanten Sicherheitsvorschriften.
      HINWEIS: Druckluft, Helium oder Stickstoffgas werden häufig verwendet, um die Explosionswellen in Nagetier-Stoßrohrmodellen zu erzeugen. Alle hier vorgestellten Daten wurden mit Helium erzeugt, da dieses Gas über eine kürzere Dauer einen höheren Überdruck ^erzeugt34, was eine angemessene Skalierung für murine Probanden ermöglicht.

2. Bewertung des Aufbaus und der Strahlwelleneigenschaften mithilfe von Drucksensoraufzeichnungen.

1. Bereiten Sie das Dämpferrohr vor.
   1. Schneiden Sie die Polyestermembran vorsichtig ab, ohne sich zu verbiegen und Risse zu erzeugen, um einen gleichmäßigen Bruch zu gewährleisten.
   2. Setzen Sie die Membran zwischen dem angetriebenen und dem Treiberabschnitt ein. Sichern Sie die Abschnitte, indem Sie die Verbindungsschrauben festziehen.
   3. Stellen Sie sicher, dass das System luftdicht ist und die Membran zwischen Treiber- und Antriebsabschnitten fest befestigt ist.
   4. Verbinden Sie den Gastank über einen 9,53 mm Hochdruck-Hydraulikschlauch und Schnellanbindungen an das Stoßdämpferrohr
      HINWEIS: Treiber- und angetriebene Abschnitte werden mit präzisen Toleranzen bearbeitet, um eine vollständige Abdichtung der Membran zwischen den Abschnitten zu gewährleisten. Dies ermöglicht keine Gasleckage und schließt die Verwendung jeglicher Form von Dichtungs- / O-Ring-Material aus und ermöglicht eine größere Konsistenz in der erzeugten Wellenform.
2. Installieren Sie die Drucksensoren zur Überwachung der Explosionswellen (siehe Abbildung 1C).
   1. Positionieren Sie einen Drucksensor im Bereich der Kopfplatzierung und drei Sensoren am Ausgang des Dämpferrohrs (siehe Abbildung 1C und 2).
   2. Starten Sie die Aufzeichnung von Drucksensoren, kurz bevor die Explosionswellenausführung ausgeführt wird. Zeichnen Sie die Druckwellendaten mit 500.000 Bildern pro Sekunde mit einem Sensorsignalkonditionierer und einer Datenerfassungsplatine auf (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Tragen Sie OHSA-zugelassene Ohrenschützer, um einen angemessenen Gehörschutz zu gewährleisten.
   3. Öffnen Sie das Hauptventil des Druckgastanks vollständig, damit der Gasfluss eine plötzliche, schnelle Druckspitze erzeugen kann.
      HINWEIS: Der Gasüberdruck reißt die Polyestermembran, um eine Stoßwelle freizusetzen, die innerhalb des angetriebenen Abschnitts in eine Kompressionswelle übergeht und das Rohr in Richtung des Kopfplatzierungsbereichs verlässt.
   4. Schalten Sie den Gasfluss unmittelbar nach dem Eingriff aus.
      HINWEIS: Das Setup kann mit einem Federrückschlagventil ausgestattet werden, um den Gasfluss automatisch und schnell zu stoppen.
   5. Analysieren Sie die Druckwellenaufzeichnungen mit einem benutzerdefinierten Computerprogramm, um Spitzenüberdruck und Diagrammdaten zu bestimmen. Die Daten können mit jedem Sensor einzeln grafisch dargestellt oder übereinander gelegt werden, um die Planarität der erzeugten Welle zu demonstrieren (siehe Abbildung 3C,D).
      HINWEIS: Die Analyse kann technisch mit leichter verfügbarer Software durchgeführt werden, aber aufgrund der großen Datensätze haben diese Programme lange Verzögerungen bei der Generierung von Diagrammen.
3. Festlegung experimenteller Bedingungen, die für das Ziel der vorgesehenen TBI-Studie angemessen sind, und Bestätigung, dass das Modell eine konsistente Blastwelle mit einer Spitzenüberdruck-, Dauer- und Impulsmessung erzeugt, die mit einer Friedlander-Welle vergleichbar ist (siehe Abbildung 3). Überprüfen Sie diese Parameter mit der oben genannten Computersoftware.
   1. Kalibrieren Sie das Setup, indem Sie die Schritte 2.1.1 wiederholen. bis 2.2.5. und verwenden Sie die Druckwellenaufzeichnungen, um festzustellen, ob der Aufbau angepasst werden muss (repräsentative Daten siehe Abbildung 3).
   2. Ändern Sie das Setup (falls erforderlich).
      HINWEIS: Die Blastwelleneigenschaften können durch geringfügige Änderungen des Setups angepasst werden. Zum Beispiel beeinflusst der Abstand des Kopfes zum Ende des angetriebenen Abschnitts die Strahlwellenkraft auf Höhe des Kopfes. Die Dicke der Polyestermembran bestimmt die Höhe des Spitzenüberdrucks, wobei dickere Membranen die Spitzenwerte erhöhen (siehe Abbildung 3A,B). Darüber hinaus ermöglicht der Aufbau die Auswahl der Richtung, in der die Explosionswelle den Kopf trifft / durchdringt (dh frontal, seitlich, oben oder unten), und daher können verschiedene Aspekte untersucht werden, wie z.B. Explosionswellenverletzung allein oder in Kombination mit Coup- und Contrecoup-Verletzungen aufgrund schneller Rotationskräfte.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1 bis 2.2.4, um die gewünschten Strahlwelleneigenschaften (falls erforderlich) festzulegen und die Reproduzierbarkeit zu steuern.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1 bis 2.2.4 mit Polyestermembranen unterschiedlicher Dicke, um die Skalierbarkeit des Aufbaus zu bewerten (repräsentative Daten siehe Abbildung 3A,B).

3. Vorbereitung des Versuchsaufbaus und der Induktion von leichtem SHT bei Nagetieren

HINWEIS: Bringen Sie Nagetiere 30 Minuten bis 1 Stunde vor Beginn der TBI-Experimente in den Haltungsbereich, um sich zu akklimatisieren. Wählen Sie den Haltebereich aus, der durch das Rauschen des Verfahrens minimal beeinträchtigt wird.

1. Bereiten Sie alle für das Experiment erforderlichen Materialien vor und überprüfen Sie den Aufbau auf ordnungsgemäße Installation (z. B. Anpassung der Parameter entsprechend dem Studienziel) (~ 5 – 10 Minuten).
   HINWEIS: Die Schwere der Verletzung kann durch Auswahl der Dicke der Polyestermembran eingestellt werden. Basierend auf unseren Studien wird eine Membrandicke von 25,4 bis 102 μm für leichte bis mittelschwere TBI in ^{Mäusen verwendet35}. Wir haben zuvor Membranen mit einer Dicke von 76,2 bis 127 μm verwendet, um leichte bis mittelschwere TBI bei Ratten zu ^erzeugen19.
   1. Schneiden Sie die Polyestermembran vorsichtig ab, setzen Sie sie zwischen den Antriebs- und Treiberabschnitten ein und sichern Sie sie durch Anziehen der Verbindungsschrauben.
   2. Verbinden Sie den Gastank mit dem Stoßdämpferrohr durch den Einsatz von Schnellverschlussarmaturen. Stellen Sie sicher, dass die Membran zwischen Treiber und angetriebenen Abschnitten fest fixiert ist.
   3. Platzieren Sie drei Drucksensoren am Ausgang des Stoßrohrs im Abstand von 120°, um die Explosionswelleneigenschaften während der TBI-Induktion zu überwachen, wie in Schritt 2.2.2 und 2.2.5 beschrieben.
   4. Stellen Sie sicher, dass der Abstand vom Ende der Stoßrohrvorrichtung für das jeweilige Motiv mit dem installierten Mikrometer korrekt ist. Halten Sie die Positionierung des Kopfes des Nagetiers (d. H. Position, Abstand) innerhalb der Studien konstant, um eine konsistente Bewertung der Verletzung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Wie in 1.2.1. angegeben, können verschiedene Arten von Verletzungen durch Auswahl der Richtung, in der die Explosionswelle auf den Kopf trifft, induziert werden. Für das hier beschriebene Verfahren zur Induktion eines leichten bis mittelschweren SHT wird der Körper senkrecht zum Stoßrohr platziert, in dem die Explosionswelle auf die Seite des Kopfes trifft. In dieser Umgebung ist der Kopf frei beweglich und daher der Explosionswelle und schnellen Rotationskräften ausgesetzt, die die Erzeugung von Coup- und Contrecoup-Effekten ermöglichen.
   5. Starten Sie die Aufzeichnung von den Drucksensoren über die grafische Benutzeroberfläche (GUI) der Software.
2. Anästhesie und Positionierung von Nagetieren im Setup
   1. Übertragen Sie Nagetiere aus dem Halteraum und induzieren Sie eine Anästhesie mit 4% Isofluran in Sauerstoff und halten Sie mit 2% Isofluran in Sauerstoff aufrecht, um Stress und Schmerzen zu reduzieren.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Tier nicht auf Zehen- oder Schwanzkneifen reagiert, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie sicher, dass die Induktion der Anästhesie für alle Versuchstiere, einschließlich Scheinkontrollen, konsistent ist. Dieses Verfahren erfordert eine geringe und kurze Anästhesiedauer.
   2. Legen Sie das vollständig betäubte Nagetier in die PVC-Rohrabschirmung mit Dämpfung, um periphere Organe vor der Explosionswelle zu schützen.
      HINWEIS: Kontrollpersonen werden betäubt und in der Nähe des Setups platziert, sind aber nicht direkt der Explosionswelle ausgesetzt. Stellen Sie sicher, dass die Bedienelemente dem Geräusch ausgesetzt sind, das vom Dämpferrohr erzeugt wird.
   3. Legen Sie den Kopf des Nagetiers in den Kopfplatzierungsbereich und stützen Sie ihn von unten, entweder durch eine direkt in die Abschirmvorrichtung eingebaute Stütze oder ein Mullpad. Bestimmen Sie die Kopfausrichtung entsprechend der Anatomie jedes einzelnen Nagetiers, wobei der Hinterhauptskondylus mit dem Rand der Schutzabschirmung ausgerichtet ist.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Druckwelle direkt auf den Hirnstamm zu richten, um die Mortalität zu verringern. Es ist bekannt, dass Verletzungen des Atemzentrums des Hirnstamms und des zervikalen Rückenmarks in Nagetiermodellen von TBI36,37,38 zu Atemanomalien und sogar zum Tod beitragen.
3. Exposition von Nagetieren gegenüber Blasenwellen.
   1. Öffnen Sie schnell das Hauptventil des Druckgastanks, um eine Druckspitze zu erzeugen, die die Membran bricht und eine laute Explosion erzeugt, die die Erzeugung einer Druckwelle bestätigt. Die Membran wird visuell gerissen, wenn sie nach dem Experiment entfernt wird.
      HINWEIS: Eine Hochgeschwindigkeitskamera kann verwendet werden, um die Coup- und Contrecoup-Effekte der Rotationsbeschleunigung des Nagetiers für weitere Analysen zu erfassen.
   2. Schalten Sie den Gasstrom unmittelbar nach dem Hören der Explosion aus.
4. Erholung von der Exposition gegenüber Explosionswellen
   1. Entfernen Sie das Nagetier nach der Explosionswellenexposition aus dem Gerät und legen Sie es auf eine ebene Oberfläche, die direkt neben dem Stoßrohr auf der Seite liegt.
   2. Überwachen Sie die Probanden, um die Zeit des Aufrichtenden Reflexes (RRT) zu bestimmen. Verwenden Sie eine Stoppuhr, um die Zeit von der Exposition gegenüber der Explosionswelle aufzuzeichnen, bis sie den inhärenten Aufrichtungsreflex wiedererlangen. (siehe Abbildung 4A).
   3. Sobald die Probanden ihren Aufrichtreflex wiedererlangt haben, legen Sie sie in ihren jeweiligen Hauskäfig, wo sie für die nächsten 24 Stunden auf Nebenwirkungen (z. B. Krampfanfälle, Atembeschwerden, Blutungen aus einer Körperöffnung) überwacht werden.
   4. Nach der anfänglichen Überwachungsphase können die Probanden mit verschiedenen biochemischen, neuropathologischen, neurophysiologischen und verhaltensbezogenen Assays nach Wahl des Forschers analysiert werden (siehe unten).
5. Bereiten Sie Setup und Platz für das nächste Experiment vor.
   1. Reinigen Sie das Setup mit Reinigungsmittel, um Geruch zu entfernen.

4. Nachgelagerte Anwendungen für Nagetiere, die Strahlwellen-/Rotationskräften und -steuerungen ausgesetzt sind

HINWEIS: In früheren Studien wurden die Wirkungen eines leichten bis mittelschweren SHT zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Exposition gegenüber einer Explosionswelle und Rotationskräften bei Nagetieren unter Verwendung nachgeschalteter Anwendungen, einschließlich biochemischer, neuropathologischer, neurophysiologischer und ^{Verhaltensanalysen19, untersucht.}

1. Biochemische Analytik
   1. Zu definierten experimentellen Zeitpunkten (Stunden bis Tage nach dem milden SHT) wird Gewebe (z. B. Gehirn, Blut) für die biochemische Analyse unter Verwendung von Standardprotokollen wie beschrieben ^geerntet19.
   2. Verwenden Sie Gewebe für die biochemische Analyse (z. B. Immunoblotting, ELISA usw.), um die Wirkung von leichtem SHT auf neurobiologische und pathophysiologische Prozesse zu beurteilen.
2. Neuropathologische Analyse
   1. Zu definierten experimentellen Zeitpunkten (Stunden bis Tage nach dem milden SHT) durchbluten Sie Nagetiere transkardial mit Kochsalzlösung, gefolgt von einer 4%igen Paraformaldehydlösung, um das Gewebe wie beschrieben zu ^fixieren19.
      HINWEIS: Einige Anwendungen sind nicht mit der Paraformaldehydfixierung kompatibel (z. B. Silberfärbung, einige Antikörper für die Immunhistochemie).
   2. Verwenden Sie durchblutetes, fixiertes Gewebe für anatomische, histologische und molekulare Analysen, um neuropathologische Veränderungen im Zusammenhang mit leichtem SHT zu beurteilen, einschließlich Neuroinflammation, Neurodegeneration und neurochemischen Veränderungen wie ^{beschrieben19.}
3. Neurophysiologische Analyse in Hirnschnitten
   1. Opfert man zu definierten experimentellen Zeitpunkten (Stunden bis Tage nach dem milden SHT) Nagetiere durch Enthauptung, entfernt das Gehirn und bereitet Gehirnscheiben wie beschrieben ^vor19.
   2. Durchführung elektrophysiologischer Aufzeichnungen wie ^{beschrieben19,} um die Wirkung von mildem SHT auf die basalen synaptischen Eigenschaften und die synaptische Plastizität zu beurteilen.
4. Verhaltensanalyse
   1. Bewerten Sie zu definierten experimentellen Zeitpunkten (Stunden bis Tage nach dem milden SHT) die Verhaltensleistung, einschließlich der motorischen Funktion (z. B. Freifeld, Rotarod, lokomotorische Aktivität; siehe Abbildung 4D) und des Lernens und Gedächtnisses (z. B. Angstkonditionierung, Barnes-Labyrinth, Morris-Wasserlabyrinth).

Ergebnisse

Die Skalierbarkeit des Blastwellenaufbaus wurde mit drei verschiedenen Membrandicken (25,4, 50,8 und 76,2 μm) getestet. Die Spitzendruckpegel wurden am Kopfplatzierungsbereich und am Ausgang des Stoßrohrapparates mit piezoelektrischen Drucksensoren bewertet (siehe Abbildung 1 & Abbildung 2). Spitzendrücke nehmen in Übereinstimmung mit der Membrandicke an beiden Sensorpositionen zu (Abbildung 3A,B), was zeigt, da...

Diskussion

Wir präsentieren hier ein präklinisches mildes TBI-Modell, das kostengünstig und einfach einzurichten und auszuführen ist und einen hohen Durchsatz, zuverlässige und reproduzierbare experimentelle Ergebnisse ermöglicht. Dieses Modell bietet eine Schutzabschirmung für periphere Organe, um eine gezielte Untersuchung leichter TBI-Mechanismen zu ermöglichen und gleichzeitig die Störvariablen der systemischen Verletzung zu begrenzen. Im Gegensatz dazu sind andere Blastenmodelle dafür bekannt, periphere Organe zu sch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3/8 SAE High Pressure Hydraulic Hose	Eaton Aeroquip	R2-6-6-36M	Available from Grainger
3/8'' Quick Connect Female Plugs	Karcher	KAR 86410440
3/8'' Quick Connect Male Plugs	Karcher	KAR 86410440
ANY-maze video tracking software	Stoelting Co.	ANY-maze software
Clear Mylar membrane	ePlastics.com	POLYCLR0.003	http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; Clear Mylar membrane is sold in various thicknesses. All are sold by vendor listed above.
Compound Slide Table (X2)	Grizzly Industrial	G5757
Deadman Gas Control Ball Valve	Coneraco Inc.	71-502-01	"Apollo", Available from Grainger
Driver and driven section (murine)	own design/production	n/a	For further information please contact the authors
Driver and driven section (rat)	own design/production	n/a	For further information please contact the authors
Ear Muffs	3M	37274	Available from Grainger
Gas Regulator - Hi Flow 3500-600-580	Harris	3003539
Helium Gas	AirGas	HE 300	Tanks are available in various sizes
Inhalation Anesthesia System	VetEquip	901806
Input Module	National Instruments	NI 9223
Isoflurane	Baxter	NDC 10019-360-40	Ordered by veterinarian
Laboratory Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	50-550-352
Labview version 12.0	National Instruments		Data Acquistion Software
Magnetic Dial Indicator/Micrometer	Grizzly Industrial	G9849
MATLAB	MathWorks		Software for pressure recording analysis
Oxygen Regulator	Medline	HCS8725M
PC for Data Processing	Dell
Polyvinylchloride Tubing - 25.4 mm	FORMUFIT	P001FGP-WH-40x3
Pressure sensors	PCB Piezotronics	102A05
Receiver USB Chassis	National Instruments	DAQ-9171
Sensor Signal Conditioner	PCB Piezotronics	482C series
Stainless NSF-Rated Mounting Table	Gridmann	GR06-WT2448
T Handle Allen Wrench - 3/16''	S&K	73310