Modelo de onda de explosão de baixa intensidade para avaliação pré-clínica de lesão cerebral traumática leve de cabeça fechada em roedores

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo de um modelo de onda de explosão para roedores para investigar efeitos neurobiológicos e fisiodicos de lesão cerebral traumática leve a moderada. Estabelecemos uma configuração de banco-topo, movida a gás, equipada com sensores de pressão, permitindo uma geração confiável e reprodutível de lesão cerebral traumática leve a moderada induzida por explosão.

Resumo

Lesão cerebral traumática (TCE) é um problema de saúde pública em larga escala. O TBI leve é a forma mais prevalente de neurotrauma e é responsável por um grande número de consultas médicas nos Estados Unidos. Atualmente, não há tratamentos aprovados pela FDA disponíveis para TBI. O aumento da incidência de TBI relacionado a explosões e militares acentua ainda mais a necessidade urgente de tratamentos eficazes de TCE. Portanto, novos modelos de animais pré-clínicos de TCE que recapitulam aspectos do TBI relacionado à explosão humana avançarão muito os esforços de pesquisa nos processos neurobiológicos e fisioterapológicos subjacentes ao TBI leve a moderado, bem como o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a TBI.

Aqui apresentamos um modelo confiável e reprodutível para a investigação dos efeitos moleculares, celulares e comportamentais de TBI leve a moderada induzida por explosão. Descrevemos um protocolo passo-a-passo para TBI leve de cabeça fechada e induzido por explosão em roedores usando uma configuração de bancada composta por um tubo de choque movido a gás equipado com sensores de pressão piezoelétricas para garantir condições de teste consistentes. Os benefícios da configuração que estabelecemos são seu relativo baixo custo, facilidade de instalação, facilidade de uso e capacidade de alta produtividade. Outras vantagens deste modelo TBI não invasivo incluem a escalabilidade da sobrepressão do pico da explosão e a geração de resultados reprodutíveis controlados. A reprodutibilidade e relevância deste modelo TBI tem sido avaliada em uma série de aplicações a jusante, incluindo análises neurobiológicas, neuropatológicas, neurofisiológicas e comportamentais, apoiando o uso desse modelo para a caracterização de processos subjacentes à etiologia de TCE leve a moderada.

Introdução

A lesão cerebral traumática (TCE) é responsável por mais de dois milhões de visitas hospitalares por ano apenas nos Estados Unidos. TBI leve comumente resultante de acidentes de carro, eventos esportivos ou quedas representam aproximadamente 80% de todos os casos de ^TCE1. O TBI leve é considerado a "doença silenciosa", pois os pacientes muitas vezes não experimentam sintomas a ver com os dias e meses seguintes ao insulto inicial, mas podem desenvolver sérias complicações relacionadas ao TCE mais tarde na ^vida2. Além disso, o TCE leve induzido por explosão é prevalente entre os militares e tem sido associado à disfunção crônica do CNS3,4,5,6. Devido à crescente incidência de ^TBI7,8 leve relacionada à explosão, a modelagem pré-clínica dos processos neurobiológicos e fisiocessiológicos associados ao TCE leve tornou-se, assim, foco no desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas para TCE.

Historicamente, a pesquisa da TBI tem se concentrado principalmente em formas graves de neurotrauma, apesar do número relativamente menor de casos graves de TCE humanos. Foram desenvolvidos modelos de roedores pré-clínicos para TBI humano severo, incluindo os modelos de impacto cortical controlado (CCI)^9,10 e lesão de percussão fluida (FPI)¹¹, ambos bem estabelecidos para produzir efeitos fisiodicos ^{confiáveis12,13}. Esses modelos estabeleceram as bases para o que se sabe hoje sobre neuroinflamação, neurodegeneração e reparação neuronal em TBI. Embora o conhecimento considerável da fisiopatologia do TCE tenha sido desenvolvido, atualmente não há tratamentos eficazes e aprovados pela FDA disponíveis para tce.

Mais recentemente, o foco da pesquisa de TCE foi ampliado para incluir um espectro mais amplo de patologias relacionadas ao TBI com o objetivo final de desenvolver intervenções terapêuticas eficazes. No entanto, foram estabelecidos poucos modelos pré-clínicos para TCE leve que mostraram efeitos mensuráveis, e apenas um pequeno número de estudos investigou o espectro TBI leve2,14,15. Como a URB leve é responsável pela grande maioria de todos os casos de TCE, modelos confiáveis de TCE leve são urgentemente necessários para facilitar a pesquisa sobre a etiologia e a neuropafiologia da condição humana, a fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas.

Em conjunto com engenheiros biomédicos e físicos aeroespaciais, estabelecemos um modelo escalável de ondas de explosão de cabeça fechada para TBI leve a moderada. Este modelo de roedor pré-clínico foi desenvolvido especificamente para investigar os efeitos da dinâmica da força, incluindo ondas de explosão e movimento de aceleração/desaceleração, que estão associados ao TBI leve humano obtido em combate militar, eventos esportivos, acidentes de carro e quedas. À medida que as ondas de explosão se correlacionam com a dinâmica da força que causa tce-TBI leve em humanos, este modelo foi projetado para produzir uma forma de onda friedlander consistente com um impulso, que é medido como libras por polegada quadrada (psi)*milissegundo (ms). O nível de impulso é escalado para ficar abaixo das curvas de letalidade pulmonar definidas para ratos e ratos, a fim de realizar investigações pré-clínicas16,17,18. Além disso, este modelo permite a investigação de golpes e lesões contrecoup devido às rápidas forças rotacionais da cabeça do animal. Esse tipo de lesão é inerente a vários tipos de apresentações clínicas de TCE, incluindo aquelas observadas em populações militares e civis. Portanto, este modelo versátil se encaixa em uma necessidade que engloba múltiplas apresentações clínicas de TCE.

O modelo pré-clínico aqui apresentado produz alterações fisiopatológicas confiáveis e reprodutíveis associadas ao TCE clínico leve, como demonstrado por uma série de estudos anteriores17,19,20,21,22,23. Estudos com este modelo mostraram que ratos submetidos a uma onda de explosão de baixa intensidade apresentaram neuroinflamação, lesão axonal, dano microvascular, alterações bioquímicas relacionadas à lesão neuronal e déficits em plasticidade de curto prazo e excitabilidade ^sináptica19. No entanto, este modelo leve de TCE não induziu alterações neuropatológicas macroscópicas, incluindo danos teciduais, hemorragia, hematoma e ^contusão19 que têm sido comumente observados em estudos usando modelos de TCE invasivos moderados a ^graves10,24. Pesquisas anteriores19,21,22,23 mostraram que esse modelo pré-clínico pode ser usado para caracterizar processos neurobiológicos e fisioterápicos subjacentes à etiologia do TBI17,19,20,21,22,23. Este modelo também permite o teste de novos compostos e estratégias terapêuticas, bem como a identificação de novas metas adequadas para o desenvolvimento de intervenções eficazes do TCE19,21,22,23.

Este modelo foi desenvolvido para investigar efeitos induzidos por ondas de explosão, bem como forças rotacionais rápidas em resultados moleculares, celulares e comportamentais em roedores. Análogo ao modelo de onda de explosão apresentado aqui, vários modelos pré-clínicos foram desenvolvidos que tentam recapitular tbi leve a moderado usando ondas de sobrepressão movidas a gás2,14,17,25,26,27,28. Algumas das limitações de outros modelos incluem: o animal é fixado em uma maca de malha de arame e a cabeça é imobilizada após o impacto; os órgãos periféricos são expostos à onda, além do cérebro, o que cria as variáveis de confusão do politraumatismo; e os modelos são grandes e estacionários, o que limita a mudança e adaptação de parâmetros críticos a melhores condições de modelo que lembram o TBI humano.

Os benefícios desta configuração de tubo de choque movido a gás são seu custo relativo baixo para despesas de aquisição e execução, bem como facilidade de instalação e uso. Além disso, a configuração permite a operação de alto rendimento e geração de ondas de explosão reprodutíveis controladas e resultados in vivo em camundongos e ratos. A fim de controlar condições de teste consistentes (ou seja, onda de explosão constante e sobrepressão) a configuração é equipada com sensores de pressão. As vantagens deste modelo para TCE incluem a escalabilidade da gravidade da lesão e que o TCE leve é induzido por um procedimento não invasivo de cabeça fechada. O pico de sobrepressão e a lesão cerebral subsequente aumentam com membranas de poliéster mais espessas de forma escalável ^{consistente17}. A capacidade de escalar a gravidade do TCE através da espessura da membrana é uma ferramenta útil para determinar o nível, no qual medidas específicas de desfecho (por exemplo, neuroinflamação) tornam-se evidentes. Fornecendo blindagem protetora para os órgãos periféricos, também permite a investigação focada em mecanismos leves de TCE, evitando ou reduzindo variáveis de confusão de lesões sistêmicas, como lesão pulmonar ou torácica. Além disso, essa configuração permite selecionar a direção, pela qual a onda de explosão atinge/penetra a cabeça (ou seja, frente a frente, lado, superior ou inferior) e, portanto, diferentes tipos de insultos indutores de TBI podem ser investigados. O procedimento padrão para induzir TBI leve a moderada descrito aqui emprega exposição lateral para avaliar os efeitos da lesão de onda de explosão em combinação com lesão de golpe e contrecoup devido a forças rotacionais rápidas. Além disso, a fim de investigar exclusivamente lesões induzidas por explosão, a exposição de ondas de explosão de cima para baixo pode ser empregada neste modelo.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Cincinnati e da Universidade da Virgínia Ocidental. Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Atenção e Uso de Animais (IACUC), e foram realizados de acordo com os princípios do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Instalação da configuração de TBI de explosão

1. Adquira todas as peças de trabalho necessárias para a configuração, incluindo: tubo de choque composto por seção de aço e condutor, membrana de poliéster, parafusos de fixação, sensores de pressão, escudo de tubulação de cloreto de polivinil (PVC) para proteger órgãos periféricos, linha hidráulica de alta pressão de 9,53 mm e conexão rápida de acessórios masculinos e femininos, regulador de gás de alto fluxo e um cilindro de gás com suporte de montagem de parede (ver Figura 1A, B e Tabela de Materiais).
   NOTA: As especificações da seção de driver e acionada utilizadas aqui (ver Figura 2 e Tabela de Materiais) foram estabelecidas para produzir uma onda de explosão escalonada de curta duração consistente (ver Figura 3C,D) para induzir TBI leve a moderada em camundongos. Para isso, foi selecionada uma seção de driver curto (6° taper) projetada em taper (6° taper). O comprimento e o diâmetro das seções acionadas e do driver podem ser modificados para pesquisar especificamente a onda de explosão 29,30,31,32, a onda ^{de compressão18} ou a dinâmica da onda de ^choque33. Para experimentos com ratos, as dimensões do tubo de choque precisam ser adaptadas para produzir forças comparáveis de acordo com os parâmetros de escala corporal ^{pertinentes17} (ver Tabela de Materiais).
2. Instale as peças de trabalho individuais da configuração em mesas de deslizamento de máquinas fixadas em uma superfície estável e fácil de limpar (de preferência aço inoxidável para uso em roedores) em espaço de laboratório aprovado para experimentos em animais.
   NOTA: Os experimentos de ondas de explosão produzem um nível considerável de ruído; portanto, escolha um local dentro do espaço de laboratório absorvedor de som, onde o ruído não interferirá com outros experimentos/grupos de laboratório.
   1. Fixar o escudo de pvc perpendicular à configuração do tubo de choque para que o corpo do roedor esteja totalmente coberto e apenas a cabeça se projeta.
      NOTA: Para que o procedimento padrão induza tbi leve a moderado descrito aqui, o centro da cabeça está localizado a 5 cm da extremidade da seção acionada para camundongos.
   2. Cilindro de gás de montagem de parede próximo à configuração de acordo com a OSHA e todas as outras normas de segurança pertinentes.
      NOTA: Ar comprimido, hélio ou gás nitrogênio são comumente usados para gerar as ondas de explosão em modelos de tubos de choque de roedores. Todos os dados aqui apresentados foram gerados utilizando hélio, pois este gás produz maior sobrepressão em uma duração mais ^curta34, permitindo o dimensionamento adequado para sujeitos murinos.

2. Avaliação das propriedades de configuração e onda de explosão usando gravações de sensores de pressão.

1. Prepare o tubo de choque.
   1. Corte cuidadosamente a membrana de poliéster sem dobrar e produzir fissuras, a fim de garantir uma ruptura consistente.
   2. Insira a membrana entre as seções acionadas e do motorista. Fixar as seções apertando os parafusos de conexão.
   3. Verifique se o sistema é hermético e a membrana está bem fixa entre as seções do motorista e das seções acionadas.
   4. Conecte o tanque de gás através de uma mangueira hidráulica de alta pressão de 9,53 mm e conecte rapidamente os acessórios ao tubo de choque
      NOTA: As seções do driver e dos conduzidos são usinadas a tolerâncias precisas, a fim de permitir uma vedação completa de membrana entre as seções. Isso não permite vazamento de gás e impede o uso de qualquer forma de material de junta/o-anel e permite maior consistência na forma de onda gerada.
2. Instale os sensores de pressão para monitorar as ondas de explosão (ver Figura 1C).
   1. Posicione um sensor de pressão na área de colocação da cabeça e três sensores na saída do tubo de choque (ver Figura 1C e 2).
   2. Inicie a gravação a partir de sensores de pressão, pouco antes da execução da onda de explosão. Registo os dados de onda de pressão em 500.000 quadros por segundo usando um condicionador de sinal de sensor e uma placa de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Use earmuffs aprovados pela OHSA para garantir a proteção auditiva adequada.
   3. Abra a válvula principal do tanque de gás comprimido totalmente para permitir que o fluxo de gás produza um pico de pressão súbita e rápida.
      NOTA: A sobrepressão do gás rompe a membrana de poliéster para liberar uma onda de choque que transita para uma onda de compressão dentro da seção acionada e sai do tubo na direção da área de colocação da cabeça.
   4. Desligue o fluxo de gás imediatamente após o procedimento.
      NOTA: A configuração pode ser equipada com uma válvula de retorno de mola para parar automaticamente e rapidamente o fluxo de gás.
   5. Analise as gravações de onda de pressão usando o programa de computador escrito personalizado para determinar o pico de sobrepressão e dados gráficos. Os dados podem ser gráficos com cada sensor individualmente ou sobreposto um ao outro para demonstrar a planaridade da onda gerada (ver Figura 3C,D).
      NOTA: A análise pode tecnicamente ser feita usando softwares mais facilmente disponíveis, mas devido aos grandes conjuntos de dados, esses programas têm longos atrasos na geração de parcelas.
3. Estabeleça condições experimentais adequadas para o objetivo do estudo TBI designado, e confirme que o modelo produz uma onda de explosão consistente com um pico de pressão, duração e medição de impulso comparável a uma onda friedlander (ver Figura 3). Verifique esses parâmetros usando o software de computador acima mencionado.
   1. Calibrar a configuração repetindo as etapas 2.1.1. para 2.2.5. e use as gravações de onda de pressão para determinar se a configuração precisa de ajuste (para dados representativos ver Figura 3).
   2. Modifique a configuração (se necessário).
      NOTA: As propriedades da onda de explosão podem ser ajustadas por pequenas modificações da configuração. Por exemplo, a distância da cabeça até o final da seção acionada impacta a força de onda de explosão no nível da cabeça. A espessura da membrana de poliéster determina o nível de sobrepressão máxima, com membranas mais grossas aumentando os níveis máximos (ver Figura 3A,B). Além disso, a configuração permite selecionar a direção pela qual a onda de explosão atinge/penetra a cabeça (ou seja, frente a frente, lado, superior ou inferior) e, portanto, diferentes aspectos podem ser investigados, como lesão de onda de explosão sozinho ou em combinação com golpe e lesão contrecoup devido a rápidas forças rotacionais.
   3. Repita as etapas 2.1.1 a 2.2.4 para estabelecer as propriedades desejadas de onda de explosão (se necessário) e controle para reprodutibilidade.
   4. Repetir passos 2.1.1 a 2.2.4 com membranas de poliéster de espessura diferente para avaliar a escalabilidade da configuração (para dados representativos ver Figura 3A,B).

3. Preparação de configuração experimental e indução de TCE leve em roedores

NOTA: Transfira roedores para a área de detenção de 30 min a 1 h antes do início dos experimentos de TCE para aclimatação. Selecione a área de retenção que seja minimamente afetada pelo ruído do procedimento.

1. Prepare todos os materiais necessários para o experimento e verifique a configuração para instalação adequada (por exemplo, ajuste parâmetros de acordo com o objetivo de estudo) (~5 – 10 minutos).
   NOTA: A gravidade da lesão pode ser ajustada selecionando a espessura da membrana de poliéster. Com base em nossos estudos, uma espessura de membrana de 25,4 a 102 μm é utilizada para TBI leve a moderada em ^{camundongos35}. Anteriormente, utilizamos membranas com espessura de 76,2 a 127 μm para produzir TBI leve a moderada em ^ratos19.
   1. Corte cuidadosamente a membrana de poliéster, insira-a entre as seções acionada e do motorista e fixe-a apertando os parafusos de conexão.
   2. Conecte o tanque de gás ao tubo de choque através do uso de encaixes de liberação rápida. Certifique-se de que a membrana está bem fixa entre as seções do motorista e do motorista.
   3. Coloque três sensores de pressão na saída do tubo de choque, com 120° de distância, para monitorar as propriedades da onda de explosão durante a indução de TBI, conforme descrito na etapa 2.2.2 e 2.2.5.
   4. Certifique-se de que a distância do aparelho do tubo de choque está correta para cada sujeito respectivo usando micrômetro instalado. Mantenha o posicionamento da cabeça do roedor (ou seja, posição, distância) constante dentro dos estudos para permitir uma avaliação consistente da lesão.
      NOTA: Conforme indicado em 1.2.1., diferentes tipos de lesão podem ser induzidas pela seleção da direção, na qual a onda de explosão impacta a cabeça. Para o procedimento induzir tbi leve a moderada descrito aqui, o corpo é colocado perpendicular ao tubo de choque que a onda de explosão impacta o lado da cabeça. Neste cenário, a cabeça é permitida mobilidade livre e, portanto, é exposta à onda de explosão e forças rotacionais rápidas permitindo a geração de efeitos de golpe e contrecoup.
   5. Inicie a gravação a partir dos sensores de pressão usando a interface gráfica do usuário (GUI) do software.
2. Anestesia e posicionamento de roedores na configuração
   1. Transfira os roedores da sala de espera e induza a anestesia com 4% de isoflurano em oxigênio e mantenha com 2% de isoflurano em oxigênio para reduzir a angústia e a dor.
      NOTA: Certifique-se de que o animal não está respondendo ao dedo do dedo do dedo ou ao aperto da cauda antes de prosseguir. Certifique-se de que a indução da anestesia é consistente para todos os animais experimentais, incluindo controles falsos. Este procedimento requer uma curta e baixa duração da anestesia.
   2. Coloque o roedor totalmente anestesiado no escudo do tubo de PVC com amortecimento para proteger órgãos periféricos da onda de explosão.
      NOTA: Os sujeitos de controle são anestesiados e colocados próximos à configuração, mas não estão diretamente sujeitos à onda de explosão. Certifique-se de que os controles estão sujeitos ao ruído gerado pelo tubo de choque.
   3. Coloque a cabeça do roedor dentro da área de colocação da cabeça e apoie-a de baixo, seja por um suporte embutido diretamente no aparelho de proteção ou por uma gaze. Determine o alinhamento da cabeça de acordo com a anatomia de cada roedor individual, com o condíle occipital alinhado com a borda da proteção.
      NOTA: Evite direcionar a onda de pressão diretamente para o tronco cerebral para diminuir a mortalidade. A lesão no centro respiratório do tronco cerebral e da medula espinhal cervical é conhecida por contribuir para anormalidades respiratórias e até mesmo morte em modelos de roedores de TBI36,37,38.
3. Exposição de roedores à onda de explosão.
   1. Abra rapidamente a válvula principal do tanque de gás comprimido para produzir um pico de pressão que rompe a membrana e produza uma forte explosão que confirma a geração de uma onda de pressão. A membrana será rompida visualmente quando removida após o experimento.
      NOTA: Uma câmera de alta velocidade pode ser usada para capturar os efeitos de golpe e contrecoup da aceleração rotacional experimentada pelo roedor para análise posterior.
   2. Desligue o fluxo de gás imediatamente após ouvir a explosão.
4. Recuperação da exposição a ondas de explosão
   1. Após a exposição à onda de explosão, remova o roedor do aparelho e coloque em uma superfície plana diretamente adjacente ao tubo de choque do lado.
   2. Monitore os sujeitos para determinar o tempo de reflexo de retardo (RRT). Use um cronômetro para registrar o tempo da exposição à onda de explosão até que recuperem o reflexo de direito inerente. (ver Figura 4A).
   3. Assim que os sujeitos recuperarem o reflexo de direito, coloque-os em sua respectiva gaiola doméstica, onde são monitorados para reações adversas (ou seja, convulsões, dificuldade para respirar, sangramento de um orifício corporal) pelas próximas 24 horas.
   4. Após o período inicial de monitoramento, os sujeitos podem ser analisados utilizando-se vários ensaios bioquímicos, neuropatológicos, neurofisiológicos e comportamentais da escolha do pesquisador (veja abaixo).
5. Prepare a configuração e o espaço para o próximo experimento.
   1. Limpe a configuração com detergente para remover o odor.

4. Aplicações a jusante para roedores expostos a ondas de explosão/forças rotacionais e controles

NOTA: Em estudos anteriores, os efeitos do TCE leve a moderado em vários pontos de tempo após a exposição a uma onda de explosão e forças rotacionais foram avaliados em roedores utilizando aplicações a jusante, incluindo análises bioquímicas, neuropatológicas, neurofisiológicas e ^{comportamentais19}.

1. Análise bioquímica
   1. Em pontos de tempo experimentais definidos (horas a dias pós-TBI leve), tecido de colheita (por exemplo, cérebro, sangue) para análise bioquímica utilizando protocolos padrão como ^descrito19.
   2. Utilizar tecido para análise bioquímica (ou seja, imunoblotting, ELISA, etc.) para avaliar o efeito de TCE leve em processos neurobiológicos e fisioterológicos.
2. Análise neuropatológica
   1. Em pontos de tempo experimentais definidos (horas a dias pós-leve TBI), roedores perfumados transcardialmente com solução salina seguido de 4% de solução paraformaldeída para fixação de tecido como ^descrito19.
      NOTA: Algumas aplicações não são compatíveis com fixação de paraformaldeído (por exemplo, coloração de prata, alguns anticorpos para imunohistoquímica).
   2. Use tecido fixo perfumado para análises anatômicas, histológicas e moleculares para avaliar alterações neuropatológicas associadas à TCE leve, incluindo neuroinflamação, neurodegeneração e alterações neuroquímicas como ^descrito19.
3. Análise neurofisiológica em fatias cerebrais
   1. Em pontos de tempo experimentais definidos (horas a dias pós-TBI leve), sacrificam roedores por decapitação, removem cérebro e preparam fatias cerebrais como ^descrito19.
   2. Realizar gravações eletrofisiológicas como ^descrito19 para avaliar o efeito de TCE leve em propriedades sinápticas basais e plasticidade sináptica.
4. Análise comportamental
   1. Em pontos de tempo experimentais definidos (horas a dias pós-TBI leve), avalie o desempenho comportamental, incluindo função motora (por exemplo, campo aberto, rotarod, atividade locomotor; ver Figura 4D) e aprendizagem & memória (por exemplo, condicionamento do medo, labirinto barnes, labirinto de água morris).

Resultados

A escalabilidade da configuração da onda de explosão foi testada usando três espessuras de membrana diferentes, 25,4, 50,8 e 76,2 μm. Os níveis de pressão máxima foram avaliados na área de colocação da cabeça e na saída do aparelho do tubo de choque usando sensores de pressão piezoelétrica (ver Figura 1 & Figura 2). As pressões máximas aumentam em concordância com a espessura da membrana em ambos os locais dos sensores (Fig...

Discussão

Apresentamos aqui um modelo de TCE leve pré-clínico que seja econômico, fácil de configurar e executar, e permite resultados experimentais de alta produtividade, confiáveis e reprodutíveis. Este modelo fornece proteção protetora aos órgãos periféricos para permitir uma investigação focada em mecanismos leves de TCE, limitando as variáveis de confusão da lesão sistêmica. Em contraste, outros modelos de explosão são conhecidos por infligir danos aos órgãos periféricos2,39,40.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3/8 SAE High Pressure Hydraulic Hose	Eaton Aeroquip	R2-6-6-36M	Available from Grainger
3/8'' Quick Connect Female Plugs	Karcher	KAR 86410440
3/8'' Quick Connect Male Plugs	Karcher	KAR 86410440
ANY-maze video tracking software	Stoelting Co.	ANY-maze software
Clear Mylar membrane	ePlastics.com	POLYCLR0.003	http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; Clear Mylar membrane is sold in various thicknesses. All are sold by vendor listed above.
Compound Slide Table (X2)	Grizzly Industrial	G5757
Deadman Gas Control Ball Valve	Coneraco Inc.	71-502-01	"Apollo", Available from Grainger
Driver and driven section (murine)	own design/production	n/a	For further information please contact the authors
Driver and driven section (rat)	own design/production	n/a	For further information please contact the authors
Ear Muffs	3M	37274	Available from Grainger
Gas Regulator - Hi Flow 3500-600-580	Harris	3003539
Helium Gas	AirGas	HE 300	Tanks are available in various sizes
Inhalation Anesthesia System	VetEquip	901806
Input Module	National Instruments	NI 9223
Isoflurane	Baxter	NDC 10019-360-40	Ordered by veterinarian
Laboratory Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	50-550-352
Labview version 12.0	National Instruments		Data Acquistion Software
Magnetic Dial Indicator/Micrometer	Grizzly Industrial	G9849
MATLAB	MathWorks		Software for pressure recording analysis
Oxygen Regulator	Medline	HCS8725M
PC for Data Processing	Dell
Polyvinylchloride Tubing - 25.4 mm	FORMUFIT	P001FGP-WH-40x3
Pressure sensors	PCB Piezotronics	102A05
Receiver USB Chassis	National Instruments	DAQ-9171
Sensor Signal Conditioner	PCB Piezotronics	482C series
Stainless NSF-Rated Mounting Table	Gridmann	GR06-WT2448
T Handle Allen Wrench - 3/16''	S&K	73310