静脈奇形に対する患者由来異種移植片モデル

要約

静脈奇形のマウス異種移植片モデルを生成するための詳細なプロトコルを提示する。このモデルは、超活性化TIE2および/またはPIK3CA遺伝子変異を含む患者由来内皮細胞の皮下注射に基づいている。異種移植病変はVM患者組織の組織病理学的特徴を密接に再現する。

要約

静脈奇形(VM)は、拡張され、しばしば機能不全の静脈をもたらす静脈ネットワークの発達障害から生じる血管異常である。本稿の目的は、ヒトVMを模倣し、患者の異質性を反映することができるマウス異種移植片モデルの確立を慎重に説明することである。内皮細胞(EC)における非遺伝性(体性 )TEK(TIE2) および PIK3CA 突然変異を超活性化することは、VMにおける病理学的血管拡大の主な要因として同定されている。以下のプロトコルは、変異体TIE2および/またはPIK3CAを発現する患者由来ECの分離、精製および拡張について説明する。これらのECは、免疫不全性の高胸腺マウスの後部に皮下に注入され、神経血管チャネルを生成する。TIE2またはPIK3CA変異株ECで発生した病変は、VM患者組織の注射および再構成の7\u20129日以内に目に見えて血管化される。このVM異種移植モデルは、VMの形成と拡張を推進する細胞および分子メカニズムを調査するための信頼性の高いプラットフォームを提供します。また、このモデルは、ヒトVMに見られる異常な血管拡大を防止する新規薬剤候補の有効性をテストする翻訳研究に役立つ。

概要

血管系の発達における欠陥は静脈奇形(VM)を含む多くの疾患の根本的な原因である。VMは、静脈の異常な形態形成および拡張を特徴とする先天^{性疾患である。}VM組織および内皮細胞(EC)に関する重要な研究は、チロシンキナーゼ受容体TIE2をコードするTEKとPIK3CAの2つの遺伝子における機能獲得変異を同定^{2,3,4,した。}これらの体細胞変異は、PI3K/AKTを含む主要な血管新生/増殖シグナル伝達経路のリガンド非依存性ハイパー活性化をもたらし、それによって拡張された拡張静脈³をもたらす。これらの重要な遺伝的発見にもかかわらず、異常な血管新生を引き起こすその後の細胞および分子メカニズムと拡大した血管チャネルの形成はまだ完全には理解されていない。

正常および病理学的血管新生の間に、既存の血管ネットワークおよびECから新しい血管が芽生える、増殖、移動、細胞外マトリックス(ECM)リモデリングおよび管腔形成⁶を含む重要な細胞プロセスの配列を受ける。ECの2次元および3次元(2D/3D)インビトロ培養は、これらの細胞特性を個別に調査するための重要なツールです。それにもかかわらず、宿主微小環境内で病理学的血管の拡大を再現するマウスモデルの需要は明確であり、翻訳研究のための標的薬の前臨床評価のための効率的なプラットフォームを提供する。

最新の状態では、TIE2機能獲得変異に関連するVMのトランスジェニックマウスモデルは報告されていない。現在のトランスジェニックVMマウスモデルは、活性化変異PIK3CA p.H1047R p.H1047R^33,55のユビキタスまたは組織制限発現に依存する。これらのトランスジェニック動物は、このホットスポットPIK3CA突然変異の全身または組織特異的な効果に関する重要な洞察を提供する。これらのモデルの限界は、初期致死をもたらす病理学的血管ネットワークの形成である。したがって、これらのマウスモデルは、突然変異事象の散発的な発生およびVM病理の局在的性質を完全に反映していない。

反対に、患者由来の異種移植片モデルは、患者由来の病理組織または細胞を免疫不全マウス⁷に移植または注入することに基づいている。異種移植片モデルは、疾患の発症と新しい治療薬⁸の発見に関する知識を広げるための強力なツールです。さらに、患者由来の細胞を使用すると、科学者は突然変異異質性を再現して患者の異型のスペクトルを研究することができます。

ここでは、アチミックヌードマウスの後ろに、TIE2および/またはPIK3CAの変異体を構成的に活性な形態を発現する患者由来VM ECを皮下に注入するプロトコルについて説明する。注入された血管細胞は、以前の血管異種移植片モデル^{9、10、1110}に記載されているように血管新生⁹を促進するためにECMフレームワークに懸濁される。^,11これらのVM ECは、重要な形態形成を受け、支持細胞の不在時に肥大した、浸透した病理学的血管を生成する。VMの記載された異種移植片モデルは、制御不能な内腔の膨張を阻害する能力に対する標的薬物の前臨床評価のための効率的なプラットフォームを提供する。

プロトコル

患者組織サンプルは、シンシナティ小児病院医療センター(CCHMC)、がんおよび血液疾患研究所の機関政策に基づく承認された機関審査委員会(IRB)の下で、腫瘍および血管異常を有する患者からの組織サンプルおよびデータの収集およびリポジトリからのインフォームド・コンセントに基づいて参加者から得られ、臨床調査委員会の承認を得た。以下に記載されているすべての動物の手順は、CCHMC制度動物のケアと使用委員会によって見直され、承認されています。

1. 材料・ストックソリューションの準備

1. 完全な内皮細胞増殖培地(EGM)の調製
   1. キットに存在する以下の成長因子を含む内皮基底培地(EBM)を補う(材料表参照):ヒト線維芽細胞成長因子-β(hFGF-β)、血管内皮成長因子(VEGF)、長Arg3インスリン様成長因子-I(R3-IGF-I)、アスコルビン酸、表皮成長因子(EGF)、ギタマイシンスルフェーゼおよびアゲンタマイシンスルフェス、およびサンギン-スルフェスと³1%ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(PSG)溶液と20%ウシ胎児血清(FBS)を加えます。
      注: ヒドロコルチゾンを追加することはお勧めしません。
   2. 滅菌は、0.2 μmボトルトップフィルターを通して、50 mL円錐形のチューブに0.2 μmボトルとアリコメディアを通して溶液をフィルターし、4°Cで1週間または-20°Cで最大1年間貯蔵します。
2. コラゲナーゼAストック溶液を準備する
   1. 50 mg/mL コラゲナーゼ A ストック溶液をリン酸緩衝塩水 (PBS) で調製します。
   2. 滅菌は、0.2 μmフィルターとシリンジを備えた層流フードの下で溶液をフィルターし、100 μLのアリコートを-20 °Cで保管します。
3. 組織採取培地(緩衝剤A)
   1. 0.927 gの塩化カルシウム二水和物(CaCl_2.2H2O)と1gの硫酸ヘプタヒドリル(MgSO_4.7H2 O)を500mLの蒸留水に加えて_、Ca2+/Mg2+ストック液を調製します。²⁺²⁺滅菌は、0.2 μmボトルトップフィルターを通してオートクレーブガラスボトルに溶液をフィルターし、室温(RT)で保管します。
   2. 10% Ca²⁺/Mg²⁺ 溶液と2%FBSとダルベッコの修正イーグルミディアム(DMEM)を補います。
   3. 滅菌は、0.2 μmフィルターとシリンジを用いた層流フードの下で溶液をろ過し、-20°Cで5 mLのアリコートを貯蔵する。
4. 組織培養プレートのフィブロネクチンコーティング
   1. 5.3gの炭酸ナトリウム_(Na2CO3;0.1M)を脱イオン₃水500mLに溶解して、コーティングバッファー(バッファB)を調製します。バッファーの pH を 1 M 塩酸 (HCl) を使用して 9.4 に調整します。0.2 μmボトルトップフィルターを通してオートクレーブガラスボトルにラミナーフローフードの下でフィルターを入れ、RTで保管します。
   2. コーティングの場合、ピペット2 mL/5 mL/10 mLのバッファBの60mm/100 mm/145mmの組織培養プレート毎にそれぞれ。1 μg/cm² のヒト血漿フィブロネクチン精製タンパク質溶液を加え、液をプレートにそっと分配します。
   3. 37°Cでインキュベートプレート、20分間_5%CO2。
   4. 吸引緩衝Bを、細胞を培養する前にPBSでプレートを洗浄する。

2. VM患者組織からの内皮細胞の分離

1. 固体VM組織からのECの分離
   注: VM 組織は、IRB 承認プロトコルの下で手術^12,,13を脱バルクすることによって切除されます。
   1. 洗浄VM組織(組織サンプル重量は、通常、0.5 gと1.5 gの間の範囲)PBSで5%のPSGで。
   2. ティッシュを100mm細胞培養皿に移し、滅菌外科的解剖ツールを用いてティッシュサンプルを小片に分け、50 mL円錐形の管に移す。
   3. 1mg/mLの最終濃度のためにバッファAの5mLに100μLのコラゲターゼAストック溶液を加え、これを組織に加え、37°Cで30分間、5分ごとに内容物を振りながら細かく消化します。
   4. 50 mL円錐管内の6mmの滑らかな表面の害虫粉砕機を使用して、RTで消化した組織を慎重に粉砕します。
   5. 0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)と2%のPSGを補った冷たいPBSの5 mLを加えながら、害虫を使用して消化した組織を慎重に粉砕し続けます。この手順を 4 回繰り返します。
   6. 100 μmの細胞ストレーナーを通して50 mLの円錐チューブに溶液をフィルターし、組織断片を除去します。
   7. 遠心分離機細胞懸濁液はRTで400 x g で5分間、ステップ2.3に進みます。
2. 患者硬化療法から得られた病変血からのVM ECの分離
   1. IRB承認プロトコルの下で硬化療法からヒトVM病変血液を得る。
   2. PBSで希薄な病変血液(サンプル量は通常0.5mL~5mL)、最終容積は40mLに及ぶ。
   3. 遠心分離機細胞懸濁液をRTで200xgで5分間懸濁した。 g
3. 初期細胞めっき
   1. 上清を捨て、EGMの1mLで単細胞ペレットを再懸濁する。
   2. フィブロネクチンコーティング(1 μg/cm²)100 mmプレートと種子1 mLの細胞懸濁液に、9 mLの完全なEGMを加えます。
   3. 加湿した5%CO2雰囲気中で37°Cの細胞を₂インキュベートする。
   4. 1日おきに2mLのメディアを取り除き、2 mLの無菌濾過FBSを加えます。
   5. 細胞培養が40\u201250%の合流度に達すると、培地をEGMを完了するように変更します。通常、細胞がこの合流に達するまでに 2\u20123 週間かかります。
   6. ECコロニーの出現を毎日観察してください。それらは典型的な「石畳のような」形態によって認識することができる(図1A)。3\u20125 の間の EC コロニーは各サンプルに現れます。
   7. 個々の EC コロニーが互いに触れ始めるまで、別の 5\u20127 日に対して、1 日おきにメディアを変更します。
4. 個々の EC コロニーの手動分離
   1. ECコロニーを収穫するには、PBSの5 mLでプレートを洗浄し、手動で血清ピペットで吸引します。
   2. プレートを顕微鏡に持って行き、蓋と底部の両方にマーキングペンを使用して複数のECコロニーの位置を丸で囲み、層流フードに戻します。
   3. 印が付いた領域に0.05%トリプシン-EDTA溶液の50 μLをピペット化することによってECコロニーを取り外します。
   4. 小さなセルスクレーパーまたはピペットチップを使用して、プレートから細胞を静かに削ります。
   5. プレートを最も近いエッジに傾け、マークされた領域ごとに1 mLのEGMですすいでセルを収集します。
   6. ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用してセルの数を数えます。
   7. 収集したECコロニーを1 x 10⁴ 細胞^/cm2 の密度で、新鮮なEGMを含むフィブロネクチンコーティング(1 μg/cm²)細胞培養皿にプレートします。翌日、EGM を完了するようにメディアを変更します。
   8. 細胞が80%の合流度に達するまで、2\u20123週の間、1日おきにEGMを完了するように培地を変更します。
   9. 2 mLのエプシンを37°Cで100mm皿あたり100mm皿あたり2 mLで2 mL2mL2分間、EGM 4 mLを加えてトリプシンを中和します。
   10. 細胞懸濁液を1つの15 mL円錐形チューブに集め、遠心分離機をRTで400 x g で5分間回収します。上清を吸引し、EGMの2mLで細胞を再懸濁する。
   11. ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用してセルの数を数えます。得られる典型的な細胞数は、100mm細胞培養プレートあたり1 x¹⁰⁶ 細胞または100mm組織培養板当たり2 x¹⁰⁶ 細胞である。
   12. 細胞を5分間RTで400xgで遠心分離gして細胞を吸引した。ステップ 3.2.1 に進みます。

3. 内皮細胞の選択と拡張

1. 抗CD31結合磁気ビーズの調製
   1. 反CD31結合磁気ビーズを含むバイアルを30sの渦。必要なビーズの数は8 x 10⁶ ビーズ/2 x 10⁶ セルです。
   2. PBSに0.1%BSAを含む1mLの洗浄液で所望の量の抗CD31結合磁気ビーズを1.5 mLマイクロ遠心チューブで洗浄します。
   3. マイクロ遠心分離チューブを細胞分離マグネットに1分間置きます。
   4. 上清を吸引し、洗浄工程を繰り返す。
2. 内皮細胞の精製とめっき
   1. 2.4.12で得られた細胞ペレットを500 μLの洗浄液で再懸濁し、PBSで0.1%BSAを含有する。
   2. 磁気ビーズを含むマイクロ遠心分離管に細胞溶液を加え、十分に再懸濁します。
   3. 4°Cで20分間、緩やかな傾きでインキュベートします。
   4. PBSに0.1%BSAの500 μLを加え、よく混ぜます。
   5. チューブを細胞分離マグネットの上に1分間置きます。
   6. ビーズに触れることなく、細胞のCD31陰性分率を含む液体のすべてを穏やかに吸引する。
   7. PBSで1mLの0.1%BSAでCD31陽性細胞分画を含むビーズペレットを洗浄し、磁気分離を繰り返します。
   8. 洗浄と磁気分離工程を最低3回繰り返し、CD31陽性細胞分画を精製する。
   9. 精製した内皮細胞を15 mL円錐形チューブに再懸濁し、RTで400 x g で5分間スピンダウンします。
   10. EGMの1 mLで上清を除去し、細胞ペレットを再懸濁します。
   11. フィブロネクチンコーティング(1 μg/cm²)100 mmプレートと種子1 mLの細胞懸濁液に、9 mLの完全なEGMを加えます。この初期シード処理では、まだ一部の磁性ビーズがセルに取り付けられていることに注意してください。ほとんどのビーズは細胞の膨張中に洗い流されますが、少数のビーズが初期の通路に持続する可能性があります。
   12. 加湿した5%CO2雰囲気中で37°Cの細胞を₂インキュベートする。
   13. 細胞が80%の合流度に達するまで、一日おきに培地を交換する(図1B)。
3. 内皮細胞拡張
   1. 細胞が80%の合流度に達したら、2 mL 0.05%トリプシン-EDTAを37°Cで100mm皿あたり2 mLで2分間取り外します。
   2. EGMの4 mLを加えることによってトリプシンを中和し、15 mLの円錐形の管に細胞を集める。
   3. 5分間RTで400 x g で遠心分離機。
   4. 上清を吸引し、EGMの2mLで細胞を再懸濁し、ヘミック計または自動細胞計数で細胞数をカウントする。
   5. 1 x 10⁴ 細胞/cm²の密度で145 mmフィブロネクチンコーティング(1 μg/cm²)の組織培養プレートにシード細胞。
   6. 目的のセル数が満たされるまでセルの通過を続けます。コンフルエント145mm組織培養プレートには約8\u20129 x 10⁶ 細胞が含まれ、必要な細胞数は1回の注射あたり2.5 x 10⁶ 細胞であると考えてください。異種移植のためには、継ぎ道3と8の間の細胞のみを考慮すべきである。

4. VM患者由来異種移植プロトコル

注:このプロトコルでは、5\u20126週齢、男性免疫不全、無地ヌードFoxn1^{nuマウスを} 使用しています。

すべての動物の手順は、機関動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されなければなりません。

1. 注射前日の材料の調製
   1. プレチルシリンジ、針、およびピペットの先端 -20 °Cの冷凍庫で一晩。
   2. ゲルの粘度の増加を避けるために、4°Cに置かれた氷のバケツの上に一晩基質膜細胞外マトリックス(BMEM)をゆっくりと解凍します。
2. 注射のための細胞懸濁液の調製
   1. 5 mLのプレウォームド 0.05% トリプシン EDTA を 37 °C で 37 °C で 2 分間トリプシンします。
   2. 5 mLのEGMを加えてトリプシンを中和し、細胞を15 mL円錐形チューブに集めます。
   3. 5分間RTで400 x g で遠心分離機。
   4. 上清を吸引し、EGMの3mLで細胞を再懸濁し、ヘミック計または自動細胞カウンターを用いて細胞数をカウントする。
   5. 計画されたすべての注入に必要なセルの総数を決定します。
      注: 推奨されるセル数は、1 回のインジェクションあたり 2.5 x 10^{6 セル} です。通常、技術的な重複のために、各マウスで合計 2 回の注射が実行されます。シリンジへの移動中の損失を考慮して、細胞数の10%超過を計算する必要があります。
   6. 計算されたセル数を含む体積を新しい50 mL円錐形チューブおよびペレット細胞に、RTで400 x g で5分間遠心して移動します。
   7. 上清を吸引し、少量(約50\u201270 μL)を残してペレットを緩めます。
3. シリンジ調製
   1. 20 μL/注入の余分なボリュームを計算して、シリンジへの転送中の損失を考慮します。細胞ペレットを氷上での注入につき220μLのBMEMで再懸濁する。細胞懸濁液の注入された容積は、病変当たり200μLである。
   2. 均質な細胞懸濁液を得るために氷の上に十分に細胞懸濁液を混ぜ、泡を作成することを避ける。
   3. 1 mLピペットと1 mLシリンジを使用して、同時にシリンジのプランジャーを引っ張りながら吸引力によってシリンジ開口部にBMEM細胞混合物をピペット。
   4. ルアーは26G x 5/8インチの無菌針を注射器にロックし、注射前に準備した注射器を氷の上に平らに保ちます。
4. マウスへの皮下注射
   1. イオブルラン気化器を使用して、1 L/minの流量で5%イオブルラン/酸素混合物でマウスを麻酔します。動物の適切なセドレーション(例えば、つま先のピンチに反応しない)を確保する。鼻コーンを介して送達される1.5%のイオブルラン/酸素の連続投与によって麻酔を維持する。
   2. マウスを胃の上に置き、移植が起こる背中の領域を露出させ、70%エタノールで注射領域を消毒する。
   3. 準備したシリンジをそっとロールし、落ち着いた細胞を再中断します。注射器の針の端に泡をフリックし、すべての気泡の除去を確実にするために細胞懸濁液の少量を排出します。
      注:マウスの左側と右側のマウスごとに2回の注射を行うことができます。
   4. つまんで、親指と人差し指を使用して「テントのような」構造を作成し、皮膚のすぐ下に皮下に針を挿入します。針が筋肉組織への注入を防ぐためにつままれた皮膚を解放することによって、皮膚の深さだけであることを確認してください。
   5. 45°の角度で針を保持する慎重に細胞懸濁液の200 μLを注入して、小さな球状の質量を作り出します(図1C)。
   6. スケールでマウスの体重を記録し、マウスに耳をタグ付けし、ケージに戻ります。
   7. 沈めに続くマウスを監視して、正常な活性に戻ることを確認します。
5. 病変成長モニタリング
   1. キャリパーを使用して、各プラグの長さと幅を測定します(図1D)。
   2. 病変の収集まで1日おきに測定を文書化する。

5. 組織の収集と処理

1. CO2チャンバーに9日後にマウスを安楽死₂させ、死を確認するためにバイタルサインを確認する。マウスを安楽死させる二次的な方法としてマウスに子宮頸部脱臼を行う。
2. 外科的鉗子とはさみを使用して解剖することによって、マウスの側面から異種移植病変/プラグを収穫する。
   注:プラグ内の血液で満たされた血管の破裂を防ぐためには、解剖ツールで病変プラグに触れないようにし、皮膚などの過度の周囲の組織をプラグに取り付けたままにすることが重要です。
3. 切除された病変をPBSに浸して洗浄する。
4. カメラでカメラステージを設定します。プラグをルーラーとまな板に合わせます。全てのプラグの画像を撮って、病変の総血管を記録する(図1E)。
5. RTで一晩10%ホルマリンに沈めることによってプラグを固定します。
6. 翌日PBSでプラグを洗い、70%エタノールに移します。
7. パラフィン埋め込み用の病変プラグ(病理コア)を処理する。

6. 病変切除

1. ミクロトームを使用して、収集したマウス病変から5μmのセクションを正に帯電したスライドに切り取ります。
   注:その後の分析では、プラグの中央のセクション(組織に約50\u201270 μm)が重要です。
2. パラフィンを60°Cで1時間溶融してから染色します。
3. 化学ヒュームフローフードの下で、組織を逆パラフィン化し、再水和します。そのため、10分間のキシレン、100%エタノール(EtOH)5分間、3分間90%EtOH、および3分間80%EtOHでインキュベートスライド。
4. 脱イオン水で5分間滑り落ちる。

7. ヘマトキシリンとエオシン(H&E)

1. 2分間のヘマトキシリンのインキュベートセクション。
2. 汚れた瓶にスライドを入れ、水が透明になるまで水道水の安定した流れによってシンクで洗い流します。
3. 脱水和物は、1分間70%EtOH、1分間80%のEtOH、1分間90%EtOH、1分間100%EtOH、1分間100%EtOHで組織を順次インキュベートしてスライドします。
4. 30 sのためのエオシンYの染色セクション。
5. 溶液が明確になるまで、新鮮な100%EtOHでリンス。
6. 2分間、キシレンでインキュベートスライド。スライドを煙のフードの下で5\u201210分間乾燥させます。
7. 異種移植片のセクションの上に永久的な、非水性の取付け媒体の滴を分配し、上にカバースリップを置く。
8. イメージングの前にスライドを一晩乾燥させます。

8. 免疫検査

1. トリスベースの0.6 gと0.5 M EDTAから500 mLの脱イオン水の1 mLを秤量することにより、抗原回収バッファー(Tris-EDTA)を調製します。1 M HCl を使用して pH を 9.0 に調整し、250 μL の Tween-20 を追加します。
2. 抗原検索バッファーを備えたビーカー内の非パラフィン化組織スライド(ステップ6.2\u20126.3)をインキュベートし、加熱ブロックで攪拌し、95°Cで20分間攪拌する。
3. ビーカーを加熱ブロックから取り出し、溶液を35°Cに冷却し、PBSで3分間洗浄します。
4. 5%正常な馬の血清中のブロック組織切片は、RTで30分間PBSで行う。
5. 20 μg/mLのビオチン化UEA-IをPBSの5%の正常な馬の血清に希釈して、ビオチン化されたウレックスエウロパエウス・アググルチニン-I(UEA-I)の働く溶液を準備します。
6. セクションごとのUEA-Iの働く解決のPipet 50\u2012100 μLおよび加湿室のRTで1時間のインキュベート。
7. PBSで2回3分間スライドを洗浄します。
8. RTで5分間の過酸化水素3%のクエンチスライドセクション。
9. PBSで2回3分間スライドを洗浄します。
10. PBSで5%の正常な馬の血清でストレプトアビジンわさびペルオキシダーゼ共役の5μg/mLを準備します。
11. 各ティッシュの滑り口のPipet 50\u2012100 μLおよび加湿の部屋のRTで1時間のインキュベート。
12. PBSで2回3分間スライドを洗浄します。
13. メーカーの指示に従って3,3'Diaminobenzidine(DAB)溶液を準備し、セクションごとに50\u2012100 μLを追加します。
14. 10\u201215分のインキュベートセクションは、2\u20125分ごとに汚れの開発をチェックし、監視します。
15. PBSで3回3分間スライドを洗います。
16. ヘマトキシリンを1滴加え、3分間インキュベートします。
17. 汚れた瓶にスライドを入れ、水が透明になるまで水道水の安定した流れによってシンクで洗い流します。
18. 80%のEtOHで1分間、90%のEtOHで1分間、1分間100%EtOH、キシレンで2分間連続してインキュベートスライド。
19. スライドを煙のフードの下で5\u201210分間乾燥させます。
20. 異種移植片のセクションの上に永久的な、非水性の取付け媒体の滴を分配し、上にカバースリップを置く。
21. イメージングの前にスライドを一晩乾燥させます。

9. ヒト由来血管チャネルの解析

注:VM病変の血管は、血管領域および血管密度を測定することによって定量される。定量化のために考慮されるのは、UEA-I陽性のヒト由来の血管チャネルのみです。

1. 20倍の倍率(高出力フィールド[HPF])で明視野顕微鏡で病変部ごとに4〜5枚の画像を撮ります。オーバーラップを避けるために、病変部内のX平面パターンでHPF画像を撮影します(図1F-H)。撮影した画像にスケールバーを含めます。
2. HPF イメージをイメージ J ([ファイル] > [開く] ) で開きます。スケールバーのピクセルを次のように調整します。直線ツールを使用して、スケール バーを表示します。測定したピクセルを mm に変換するには、[ 分析 ] > [ スケールの設定] をクリックします。
3. [ 解析 ] > [ 計測値の設定] をクリックし、[ エリア ] と [オーバーレイに追加] を選択します。
4. 分析/測定 を使用して、HPF の合計フィールド 領域を測定します。ステップ9.8で定量化するためにこの測定を保存します。
5. フリーハンド選択ツールを使用して、UEA-I⁺ 血管チャネルを手動で概説します。
   注:血管チャネルは、UEA-I⁺ - ECが血液細胞を含む可能性のある領域として定義されます。
6. [分析] > [メジャー]をクリックして、概説されている UEA-I⁺血管領域 (mm²/HPF) を定量化します。
7. 1つのプラグ内で取られた5つのHPFすべてに対してこの測定を繰り返します。
8. 全5つのHPFの全血管面積を平均する。得られたHPF当たりの血管面積は、その後HPFフィールド面積^(mm2、ステップ9.5)で分割され、パーセント(%)として表される。
9. 血管密度の定量については、取られた各HPFのUEA-I+⁺血管チャネル数を数える。血管密度は、HPF領域当たりにカウントされるUEA-I+血管チャネルの平均数(血管/mm2)である。^{+ 2}

結果

本プロトコルは、免疫不全ヌードマウスの後部への患者由来ECの皮下注射に基づいてVMのマウス異種移植片モデルを生成するプロセスを説明する。内皮細胞コロニーは、VM組織または病変血液から最初の細胞分離後4週間以内に収穫することができる(図1A、B)。注射の翌日、異種移植病変プラグは約80\u2012100 mm²の表面積をカバーする。私たちの手の中では、TIE2/PIK3CA変異ECを?...

ディスカッション

ここでは、VMの患者由来異種移植片モデルを生成する方法について説明する。このマウスモデルは、研究者が病理学的ルーメンの拡大をより深く理解することを可能にする優れたシステムを提示し、VMの治療のためのより効果的で標的療法の開発に役立ちます。これは、毛細血管リンパ性静脈奇形¹⁶のような他のタイプの血管異常を調査するために容易に適応することができ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males	Envigo	069(nu)/070(nu/+)	Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)	Vector Laboratories	B-1065	Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM)	Thermo Fisher	974106	Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA)	BSA	A7906-50MG	Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)	Sigma	C7902-500G	Cell culture
Caliper	Electron Microscopy Sciences	50996491	Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)	Life Technologies	11155D	EC separation
Cell strainer (100 μM)	Greiner	542000	Cell culture
Collagenase A	Roche	10103578001	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL)	Greiner	07 000 241	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL)	Greiner	07 000 239	Cell culture
Coplin staining jar	Ted Pella	21029	Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm)	Fisher Scientific	12545E	Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)	Vector Laboratories	SK-4105	Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-027-CV	Cell culture
DynaMag-2	Life Technologies	12321D	EC separation
Ear punch	VWR	10806-286	Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0)	Life Technologies	15575-020	Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)	Lonza	CC-3162	Cell culture
Eosin Y (alcohol-based)	Thermo Scientific	71211	Histological anlaysis
Ethanol	Decon Labs	2716	Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone	GE Healthcare	SH30910.03	Cell culture
Filter tip 1,250 μL	MidSci	AV1250-H	Multiple steps
Filter tip 20 μL	VWR	10017-064	Multiple steps
Filter tip 200 μL	VWR	10017-068	Multiple steps
Formalin buffered solution (10%)	Sigma	F04586	Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable)	SKC FILMS	DHCN015	Cell culture
Hematoxylin	Vector Hematoxylin	H-3401	Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)	Sigma	FC010-10MG	Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)	Sigma	H1009	Histological anlaysis
ImageJ Software			Analysis
Isoflurane, USP	Akorn Animal Health	59399-106-01	Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Sigma	M1880-500G	Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)	Corning	356237	Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	VWR	87003-294	EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)	Fisher Scientific	1255015-CS	Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles	Becton Dickinson (BD)	BD305115	Subcutaneous injection
Normal horse serum	Vector Laboratories	S-2000	Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)	Corning	30-009-CI	Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount)	Vector Laboratories	H-5000	Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain	Thomas Scientific	3431F55	EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994	Cell culture
Scale	VWR	65500-202	Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml)	VWR	89130-898	Cell culture
Serological pipettes (5ml)	VWR	89130-896	Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3)	Sigma	223530	Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC	Vector Laboratories	SA-5004	Cell culture
Syringe (60ml)	BD Biosciences	309653	Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM)	Corning	431219	Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock)	Becton Dickinson (BD)	BD-309628	Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)	Greiner	664160	Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm)	Greiner	639160	Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm	Eppendorf	30701119	Cell culture
Tris-base (Trizma base)	Sigma	T6066	Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %)	Life Technologies	15250061	Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)	Corning	25-052-Cl	Cell culture
Tween-20	Biorad	170-6531	Histological anlaysis
Wheaton bottle	VWR	16159-798	Cell culture
Xylenes	Fisher Scientific	X3P-1GAL	Histological anlaysis