Un modello Xenotranest derivato dal paziente per la malformazione Venosa

Riepilogo

Presentiamo un protocollo dettagliato per generare un modello murine xenograft di malformazione venosa. Questo modello si basa sull'iniezione sottocutanea di cellule endoteliali derivate dal paziente contenenti mutazioni genetiche TIE2 e/o PIK3CA iper-attivanti. Le lesioni dello Xenotrapianto ricapitolano da vicino le caratteristiche istopatologiche del tessuto del paziente VM.

Abstract

La malformazione venosa (VM) è un'anomalia vascolare che deriva dallo sviluppo alterato della rete venosa con conseguente venatura dilatata e spesso disfunzionale. Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere attentamente la creazione di un modello murine xenograft che imita vm umano ed è in grado di riflettere l'eterogeneità del paziente. Le mutazioni TEK (TIE2) e PIK3CA non ereditarie iper-attivanti nelle cellule endoteliali (EC) sono state identificate come i principali fattori di allargamento della nave patologica nella VM. Il seguente protocollo descrive l'isolamento, la purificazione e l'espansione della EC derivata dal paziente che esprime il TIE2 mutante e/o PIK3CA. Questi CE vengono iniettati sottocutaneamente nella parte posteriore dei topi atimici immunodeficienti per generare canali vascolari ectatici. Le lesioni generate con LA CE mutante TIE2 o PIK3CA sono visibilmente vascolarizzate entro 7-u20129 giorni dall'iniezione e ricapitolano le caratteristiche istopatologiche del tessuto del paziente vm. Questo modello di xenotrapianto VM fornisce una piattaforma affidabile per studiare i meccanismi cellulari e molecolari che guidano la formazione e l'espansione delle macchine virtuali. Inoltre, questo modello sarà strumentale per gli studi traslazionali che testano l'efficacia dei nuovi candidati ai farmaci per prevenire l'allargamento anormale delle navi visto nella VM umana.

Introduzione

I difetti nello sviluppo della vascolatura sono la causa alla base di molte malattie, tra cui la malformazione venosa (VM). Vm è una malattia congenita caratterizzata da morfogenesi anormale ed espansione delle vene¹. Importanti studi sul tessuto della macchina virtuale e sulle cellule endoteliali (EC) hanno identificato mutazioni di guadagno di funzione in due geni: TEK, che codifica il recettore della chinasi della tirosina TIE2, e PIK3CA, che codifica l'isoforma di p110 (sottounità catalitica) di PI3-chinasi (PI3K)^2,3,4,5. Queste mutazioni somatiche si trasgrede in un'iperattivazione indipendente dal ligando delle vie di segnalazione chiave angiogenica/crescita, compreso il PI3K/AKT, con conseguente vene ectatiche dilatate³. Nonostante queste importanti scoperte genetiche, i successivi meccanismi cellulari e molecolari che innescano l'angiogenesi anormale e la formazione di canali vascolari allargati non sono ancora pienamente compresi.

Durante l'angiogenesi normale e patologica, i nuovi vasi provengono da una rete vascolare preesistente e la CE subisce una sequenza di importanti processi cellulari tra cui la proliferazione, la migrazione, il rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) e la formazione del lume⁶. Le colture in vitro bidimensionali (2D/3D) della CE sono strumenti importanti per studiare ciascuna di queste proprietà cellulari singolarmente. Tuttavia, vi è una chiara richiesta di un modello murino che ricapitoli l'allargamento patologico delle navi all'interno del microambiente dell'ospite, fornendo al contempo una piattaforma efficiente per la valutazione preclinica di farmaci mirati per la ricerca traslazionale.

Fino ad oggi, non è stato segnalato un modello murino transgenico di VM associato a mutazioni di guadagno di funzione TIE2. Gli attuali modelli di topo VM transgenici si basano sull'espressione onnipresente o limitata ai tessuti della mutazione attiva PIK3CA p.H1047R^3,5. Questi animali transgenici forniscono informazioni significative sugli effetti specifici di tutto il corpo o dei tessuti di questa mutazione hotspot PIK3CA. La limitazione di questi modelli è la formazione di una rete vascolare altamente patologica con conseguente precoce letalità. Pertanto, questi modelli murini non riflettono pienamente l'occorrenza sporadica di eventi mutazionali e la natura localizzata della patologia della macchina virtuale.

Al contrario, i modelli di xenotrapianto derivati dal paziente si basano sul trapianto o sull'iniezione di tessuto patologico o cellule derivate dai pazienti in topi immunodeficienti⁷. I modelli Xenotrapianto sono un potente strumento per ampliare le conoscenze sullo sviluppo della malattia e la scoperta di nuovi agenti^{terapeutici 8}. Inoltre, l'utilizzo di cellule derivate dal paziente consente agli scienziati di ricapitolare l'eterogeneità della mutazione per studiare lo spettro dei fenotipi dei pazienti.

Qui, descriviamo un protocollo in cui la VM EC derivata dal paziente che esprime una forma mutante costitutivamente attiva di TIE2 e/o PIK3CA viene iniettata sottocutaneamente nella parte posteriore di topi nudi atimici. Le cellule vascolari iniettate sono sospese in un quadro ECM al fine di promuovere l'angiogenesi come descritto nei precedenti modelli di xenotrapianto vascolare^9,10,11. Queste VM EC sono sottoposte a una significativa morfogenesi e generano vasi patologici allargati e perfuso in assenza di cellule di supporto. Il modello di xenotrapianto descritto di VM fornisce una piattaforma efficiente per la valutazione preclinica dei farmaci mirati per la loro capacità di inibire l'espansione incontrollato del lume.

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Protocollo

I campioni di tessuto del paziente sono stati ottenuti dai partecipanti dopo il consenso informato dalla raccolta e dal deposito di campioni di tessuti e dati da pazienti con tumori e anomalie vascolari nell'ambito di un Comitato di revisione istituzionale (IRB) approvato per le politiche istituzionali presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute e con l'approvazione del Comitato per l'indagine clinica. Tutte le procedure relative agli animali descritte di seguito sono state esaminate e approvate dal CCHMC Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Preparazione dei materiali e delle soluzioni di stock

1. Preparazione del mezzo completo di crescita cellulare endoteliale (EGM)
   1. Integrare il mezzo basale endoteliale (EBM) con i seguenti fattori di crescita presenti nel kit (vedi Tabella dei materiali): Fattore di crescita fibroblasta umano-Beta (hFGF-β), fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), Fattore di crescita a base di insulina lunga3- I (R³-IGF-I), acido ascorbico, fattore di crescita epidermico (EGF), solfato di gentamicina e amphotericin-B, ed epaina. Aggiungere la soluzione 1% Penicillina/Streptomicina/L-Glutamina (PSG) e il 20% di siero bovino fetale (FBS).
      NOTA: Non è consigliabile aggiungere idrocortisone.
   2. Filtrare sterilemente la soluzione sotto un cofano a flusso laminare attraverso un filtro superiore a bottiglia da 0,2 m in una bottiglia di vetro autoclaved e un supporto aliquot in tubi conici da 50 mL e conservare a 4 gradi centigradi fino a una settimana o a -20 gradi centigradi per un massimo di un anno.
2. Preparare collagenase Una soluzione stock
   1. Preparare 50 mg/mL collagenasi Una soluzione di stock in 1x salina tampone di fosfato (PBS).
   2. Filtrare sterilemente la soluzione sotto un cappuccio a flusso laminare con filtro e siringa da 0,2 m e conservare 100 aliquots di lL a -20 gradi centigradi.
3. Preparare il supporto di raccolta dei tessuti (Buffer A)
   1. Preparare una soluzione di stoccaggio Ca²/Mg^2, aggiungendo 0,927 g di dihydrato di cloruro di calcio (CaCl₂.2H₂O) e 1 g di ettoidrato di solfato di magnesio (MgSO₄.7H₂O) a 500 mL di acqua distillata. Filtrare sterilemente la soluzione attraverso un filtro superiore a bottiglia da 0,2 m in una bottiglia di vetro autoclaved e conservare a temperatura ambiente (RT).
   2. Integrare il Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con la soluzione 10% Ca²/Mg² e il 2% di FBS.
   3. Filtrare sterilemente la soluzione sotto un cappuccio a flusso laminare con filtro e siringa da 0,2 m e conservare aliquots di 5 mL a -20 gradi centigradi.
4. Rivestimento fibronectina di piastre di coltura dei tessuti
   1. Preparare il tampone di rivestimento (Buffer B) sciogliendo 5,3 g di carbonato di sodio (Na₂CO₃; 0,1 M) in 500 mL di acqua deionizzata. Regolare il pH del buffer a 9,4 utilizzando 1 M di acido cloridrico (HCl). Filtrare sotto un cappuccio a flusso laminare attraverso un filtro top bottiglia da 0,2 m in una bottiglia di vetro autoclaved e conservare a RT.
   2. Per il rivestimento, pipetta 2 mL/5 mL/10 mL di buffer B per 60 mm/100 mm/145 mm piastra di coltura del tessuto, rispettivamente. Aggiungete 1 g/cm^{2 della} soluzione di proteina purificata al plasma umano e distribuire delicatamente il liquido sulla piastra.
   3. Piastra incubata a 37 gradi centigradi, 5% CO₂ per 20 min.
   4. Aspirare Buffer B e lavare la piastra con PBS prima di cultre le cellule.

2. Isolamento delle cellule endoteliali dal tessuto del paziente VM

1. Isolamento della CE dal tessuto solido della macchina virtuale
   NOTA: il tessuto della macchina virtuale è risentito dalla chirurgia di debulking^12,13 nell'ambito di un protocollo approvato dall'IRB.
   1. Il tessuto VM di lavaggio (peso del campione di tessuto varia in genere tra 0,5 g e 1,5 g) nel 5% di PSG in PBS.
   2. Trasferire il tessuto in un piatto di coltura cellulare da 100 mm, tritare il campione di tessuto in piccoli pezzi utilizzando strumenti di dissezione chirurgica sterili e trasferirlo in un tubo conico da 50 mL.
   3. Aggiungere 100 L di collagenase Una soluzione di stock a 5 mL di Buffer A per una concentrazione finale di 1 mg/mL, quindi aggiungere questo al tessuto e digerire il tessuto macinato a 37 gradi centigradi per 30 min agitando il contenuto ogni 5 minuti.
   4. Macinare con cura il tessuto digerito a RT utilizzando una smerigliatrice di pestello di superficie liscia di 6 mm all'interno del tubo conico da 50 mL.
   5. Continuare a macinare con cura il tessuto digerito utilizzando un pestello aggiungendo 5 mL di PBS freddo integrato con 0.5% albumina di siero bovino (BSA) e 2% PSG. Ripetere questo passaggio quattro volte.
   6. Filtrare la soluzione attraverso un colino a cellule da 100 m in un tubo conico da 50 mL per rimuovere i frammenti di tessuto.
   7. Sospensione delle celle centrifughe per 5 min a 400 x g a RT. Procedere al punto 2.3.
2. Isolamento della VM EC dal sangue lesionale ottenuto dalla scleroterapia del paziente
   1. Ottenere il sangue lesional VM umano dalla scleroterapia in base a un protocollo approvato IRB.
   2. Diluire il sangue lesionale (il volume del campione varia in genere tra 0,5 mL e 5 mL) in PBS ad un volume finale di 40 mL.
   3. Sospensione delle cellule Centrifuga per 5 min a 200 x g a RT.
3. Placcatura iniziale delle cellule
   1. Scartare il supernatant e risundere il pellet a cella singola in 1 mL di EGM.
   2. Aggiungere 9 mL di EGM completo su piastre rivestite di fibronectina (1 g/cm2) e semi da 1 mL di sospensione cellulare.
   3. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umidificata del 5% di CO_2.
   4. Ogni altro giorno rimuovere 2 mL di supporti e aggiungere 2 mL di STERILE filtrato FBS.
   5. Una volta che le colture cellulari raggiungono una confluenza di 40 u201250% cambiare il mezzo per completare EGM. In genere ci vogliono tra 2-u20123 settimane per le cellule per raggiungere questa confluenza.
   6. Osservare ogni giorno per la comparsa di colonie CE. Possono essere riconosciuti dalla loro tipica morfologia "ciottone" (Figura 1A). In ogni campione appaiono tra le colonie EC di 3-u20125.
   7. Cambiare il mezzo ogni due giorni per altri 5-u20127 giorni fino a quando le singole colonie EC iniziano a toccarsi l'un l'altro.
4. Isolamento manuale delle singole colonie CE
   1. Per raccogliere le colonie EC, lavare la piastra con 5 mL di PBS e aspirare manualmente con una pipetta sierologica.
   2. Portare la piastra al microscopio e circondare le posizioni di più colonie EC utilizzando una penna di marcatura sia sul coperchio che sul fondo prima di restituirla al cofano di flusso laminare.
   3. Scollegare le colonie CE mediante pipettamento 50 L della soluzione prova-EDTA dello 0,05% sulle aree contrassegnate.
   4. Utilizzando un piccolo raschietto a cellule o una punta di pipetta, raschiare delicatamente le cellule dalla piastra.
   5. Inclinare la piastra al bordo più vicino e risciacquare con 1 mL di EGM per area contrassegnata e raccogliere le cellule.
   6. Contare il numero di celle utilizzando un emocitometro o un contatore di celle automatizzato.
   7. Placcare le colonie CE raccolte ad una densità di 1 x^{10 4} cellule/cm² su piatti di coltura cellulare rivestiti di fibronectina (1 g/cm2) contenenti EGM fresco. Il giorno successivo, cambiare mezzo per completare EGM.
   8. Cambiare il mezzo per completare EGM ogni due giorni per 2-u20123 settimane fino a quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza.
   9. Provare EC con 2 mL di metapsina-EDTA prerimosa per 100 mm a 37 gradi centigradi per 2 min e neutralizzare la metapsina aggiungendo 4 mL di EGM.
   10. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 400 x g a RT per 5 min. Aspirare le cellule supernante e rispendere in 2 mL di EGM.
   11. Contare il numero di celle utilizzando un emocitometro o un contatore di celle automatizzato. I numeri di cellulare tipici ottenuti sono 1 x 10⁶ celle per piastra di coltura cellulare 60 mm o 2 x 10^{6 cellule} per piastra di coltura del tessuto 100 mm.
   12. Pellet le cellule per centrifugazione a 400 x g a RT per 5 min e aspirare il supernante. Procedere al punto 3.2.1.

3. Selezione ed espansione delle cellule endoteliali

1. Preparazione di perline magnetiche anti-CD31-coniugate
   1. Vortex la fiala contenente le perline magnetiche anti-CD31-coniugate per 30 s. Il numero di perline richieste è 8 x 10⁶ perline / 2 x 10⁶ celle.
   2. Lavare la quantità desiderata di perline magnetiche anti-CD31 coniugate con 1 mL di soluzione di lavaggio contenente 0,1% BSA in PBS in un tubo microcentrifuge da 1,5 mL.
   3. Posizionare il tubo microcentrifuge in un magnete di isolamento cellulare per 1 min.
   4. Aspirare il supernatant e ripetere il passaggio di lavaggio.
2. Purificazione e placcatura delle cellule endoteliali
   1. Pellet cellulare di riespettazione ottenuto in 2.4.12 in 500 L di soluzione di lavaggio contenente 0.1% BSA in PBS.
   2. Aggiungere la soluzione cellulare al tubo microcentrifuge contenente perline magnetiche e riesposo accuratamente.
   3. Incubare per 20 minuti a 4 gradi centigradi con leggera inclinazione.
   4. Aggiungere 500 L dello 0,1% BSA in PBS e mescolare bene.
   5. Posizionare il tubo su un magnete di isolamento cellulare per 1 min.
   6. Aspirare delicatamente tutto il liquido, che contiene la frazione di cellule CD31-negativa senza toccare le perline.
   7. Lavare il pellet di perline contenente la frazione di cella POSITIVA CD31 con 1 mL dello 0,1% BSA in PBS e ripetere la separazione magnetica.
   8. Ripetere il lavaggio e la separazione magnetica per un minimo di 3 volte per purificare la frazione di cellule CD31-positive.
   9. Rispendere le cellule endoteliali purificate in un tubo conico da 15 mL e girare verso il basso per 5 min a 400 x g a RT.
   10. Rimuovere il pellet cellulare supernatant e resuspend in 1 mL di EGM.
   11. Aggiungere 9 mL di EGM completo su piastre rivestite di fibronectina (1 g/cm2) e semi da 1 mL di sospensione cellulare. Si noti che alcune perline magnetiche sono ancora attaccate alle cellule in questa fase iniziale di semina. La maggior parte delle perline si lavano via durante l'espansione cellulare, ma un piccolo numero di perline può persistere nei primi passaggi.
   12. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umidificata del 5% di CO_2.
   13. Modificare il supporto a giorni in su fino a raggiungere l'80 % di confluenza (Figura 1B).
3. Espansione delle cellule endoteliali
   1. Una volta che le cellule raggiungono l'80 % di confluenza, staccare con 2 mL di 0,05% trypsin-EDTA per 100 mm piatto a 37 gradi centigradi per 2 min.
   2. Neutralizzare la trypsina aggiungendo 4 mL di EGM e raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 mL.
   3. Centrifuga a 400 x g a RT per 5 min.
   4. Aspirare il supernatante, rispendere le cellule in 2 mL di EGM, e contare il numero di cellule con un emocitometro o con il conteggio automatico delle cellule.
   5. Cellule di semi ad una densità di 1 x 10⁴ cellule/cm2 in piastre di coltura dei tessuti rivestite di fibronectina da 145 mm (1 g/cm2).
   6. Continuare a passare le celle fino a quando non è stato soddisfatto il numero di cella desiderato. Si consideri che una piastra di coltura del tessuto confluente 145 mm contiene circa 8 u20129 x^{10 6} cellule e il numero di cellule necessarie è 2,5 x 10⁶ cellule per iniezione. Solo le cellule tra il passaggio 3 e 8 devono essere considerate per lo xenotrapianto.

4. Protocollo xenotrapianto derivato dal paziente VM

NOTA: In questo protocollo usiamo topi^{nu nu athymic} nude Foxn1 nu di 5-u20126.

Tutte le procedure relative agli animali devono essere approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Preparazione dei materiali il giorno prima dell'iniezione
   1. Siringhe, aghi e punte di pipetta pre-freddo in freezer a -20 gradi centigradi durante la notte.
   2. Scongelare lentamente la membrana intercastrata a matrice extracellulare (BMEM) durante la notte sul secchio di ghiaccio posto a 4 gradi centigradi per evitare una maggiore viscosità del gel.
2. Preparazione della sospensione cellulare per l'iniezione
   1. Trypsinize EC con 5 mL di pre-riscaldato 0.05% trypsin-EDTA per 145 mm piatto a 37 s per 2 min.
   2. Neutralizzare la trypsina aggiungendo 5 mL di EGM e raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 mL.
   3. Centrifuga a 400 x g a RT per 5 min.
   4. Aspirare il supernante, rispendere le cellule in 3 mL di EGM, e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o contatore cellulare automatizzato.
   5. Determinare il numero totale di celle necessarie per tutte le iniezioni pianificate.
      NOTA: Il numero consigliato di cellule è 2,5 x 10⁶ celle per iniezione. Un totale di 2 iniezioni sono in genere eseguite in ogni mouse per i duplicati tecnici. È necessario calcolare un 10% in eccesso di numero di cellulare per tenere conto della perdita durante il trasferimento nella siringa.
   6. Trasferire il volume contenente il numero di cella calcolato in un nuovo tubo conico da 50 mL e cellule di pellet per centrifugazione a 400 x g a RT per 5 min.
   7. Aspirare il supernante, lasciando un piccolo volume (circa 50-u201270 L) per allentare il pellet.
3. Preparazione delle siringhe
   1. Calcolare un volume in eccesso di 20 L/iniezione per tenere conto della perdita durante il trasferimento alla siringa. Rispendere il pellet cellulare con 220 L di BMEM per iniezione sul ghiaccio. Il volume iniettato delle sospensioni cellulari sarà di 200 L per lesione.
   2. Mescolare accuratamente la sospensione delle cellule sul ghiaccio per ottenere una sospensione omogenea delle cellule ed evitare di creare bolle.
   3. Utilizzando una pipetta da 1 mL e una siringa da 1 mL, contemporaneamente pipetta la miscela di cellule BMEM nell'apertura della siringa mediante forza di aspirazione mentre si tira lo stantuffo di siringa.
   4. Luer bloccare un ago sterile 26G x 5/8 pollici alla siringa e mantenere le siringhe preparate piatto sul ghiaccio prima dell'iniezione.
4. Iniezione sottocutanea nel topo
   1. Anestesizzare i topi con una miscela di isoflurane/ossigeno del 5% ad una velocità di flusso di 1 L/min utilizzando un vaporizzatore isoflurane. Garantire la sedazione corretta degli animali (ad esempio, la mancata risposta ai pizzichi delle dita dei piedi). Mantenere l'anestesia tramite somministrazione continua dell'1,5% di isoflurane/ossigeno erogato tramite cono naso.
   2. Posizionare i topi sullo stomaco, esponendo la regione posteriore dove si verificherà l'innesto e disinfettare la regione di iniezione con il 70% di etanolo.
   3. Arrotolare delicatamente la siringa preparata per risospendere eventuali cellule stabilite. Flick bolle all'estremità dell'ago della siringa ed espellere un piccolo volume della sospensione cellulare per garantire la rimozione di tutte le bolle.
      NOTA: È possibile eseguire due iniezioni per ogni mouse, sul lato sinistro e destro del mouse indietro.
   4. Pizzica e crea una struttura simile a una tenda usando il pollice e l'indice e inserisci l'ago sottocutaneamente sotto la pelle. Assicurarsi che l'ago sia solo profondo della pelle rilasciando la pelle pizzicata per prevenire l'iniezione nel tessuto muscolare.
   5. Tenendo l'ago ad angolo di 45 gradi iniettare con cura 200 L della sospensione cellulare per creare una piccola massa sferica (Figura 1C).
   6. Registrare il peso del mouse con una scala, etichettare l'orecchio il mouse e tornare in gabbia.
   7. Monitorare i topi dopo la sedazione per assicurarsi che tornino alla normale attività.
5. Monitoraggio della crescita delle lesioni
   1. Utilizzando una pinna, misurare la lunghezza e la larghezza di ciascuna spina (Figura 1D).
   2. Documentare le misurazioni a giorni in su fino alla raccolta delle lesioni.

5. Raccolta e lavorazione dei tessuti

1. Eutanasia i topi 9 giorni dopo l'impianto in una camera di CO₂ e controllare i segni vitali per confermare la morte. Eseguire la lussazione cervicale sui topi come metodo secondario per eutanasia del mouse.
2. Raccogliere la lesione/spina dello xenotrapianto dal fianco del topo con la dissezione utilizzando forbici e forbici chirurgiche.
   NOTA: Al fine di evitare la rottura dei vasi riempiti di sangue all'interno della spina, è importante evitare di toccare il plug della lesione con strumenti di dissezione e lasciare un tessuto circostante eccessivo come la pelle attaccata alla spina.
3. Immergere la lesione resected in PBS per lavare.
4. Impostare un palco della fotocamera con una fotocamera. Allineare le spine su un tagliere con un righello. Scattare un'immagine di tutte le spine per registrare la vascolarizzazione lorda delle lesioni (Figura 1E).
5. Fissare le spine immergendosi in formalina 10% durante la notte a RT.
6. Lavare le spine in PBS il giorno seguente e spostarle nel 70% di etanolo.
7. Tappi di lesione di processo per l'incorporamento di paraffina (nucleo di patologia).

6. Sezione di lesione

1. Utilizzare un microtomo per tagliare le sezioni di 5 m dalle lesioni murine raccolte su diapositive caricate positivamente.
   NOTA: Per l'analisi successiva, le sezioni al centro della spina (circa 50-u201270 m nel tessuto) sono importanti.
2. Sciogliere la paraffina a 60 gradi centigradi per 1 h prima della colorazione.
3. De-paraffinare e ri-idratare il tessuto in sequenza sotto un cappuccio di flusso di fumi chimici. Pertanto, incubare diapositiva in xylene per 10 min, 100% etanolo (EtOH) per 5 min, 90% EtOH per 3 min, e 80% EtOH per 3 min.
4. Sciacquare lo scivolo in acqua deionizzata per 5 minuti.

7. Ematossilina ed Eosin (H&E)

1. Incubare sezioni in Hematoxylin per 2 min.
2. Mettere gli scivoli in un barattolo di colorazione e risciacquare in un lavandino da un flusso costante di acqua del rubinetto fino a quando l'acqua è limpida.
3. De-idratare scivola incubando il tessuto in sequenza nel 70% EtOH per 1 min, 80% EtOH per 1 min, 90% EtOH per 1 min, 100% EtOH per 1 min e fresco 100% EtOH per 1 min.
4. Sezioni di macchie in Eosin Y per 30 s.
5. Risciacquare in EtOH fresco al 100% fino a quando la soluzione non è chiara.
6. Incubare scivolo in xylenes per 2 min. Lasciare asciugare le vetrini per 5-u201210 min sotto il cofano dei fumi.
7. Eroga una goccia di mezzo di montaggio permanente e non aqueo su sezioni di xenotrapianti e posiziona il coperture sulla parte superiore.
8. Lasciare asciugare i vetrini durante la notte prima dell'imaging.

8. Immunohistochimica

1. Preparare il buffer di recupero dell'antigene (Tris-EDTA) pesando 0,6 g di Tris-base e 1 mL da 0,5 M EDTA a 500 mL di acqua deionizzata. Regolare il pH a 9,0 utilizzando 1 M HCl. Aggiungere 250 L di Tween-20.
2. Incubare vetrini di tessuto de-paraffinato (come ottenuto al punto 6.2-u20126.3) in un becher con buffer di recupero dell'antigene, mescolando su un blocco di riscaldamento, per 20 min a 95 gradi centigradi.
3. Togliere il becher dal blocco di riscaldamento, lasciare raffreddare la soluzione a 35 gradi centigradi e poi lavare in PBS per 3 minuti.
4. Bloccare le sezioni di tessuto nel 5% di siero di cavallo normale in PBS per 30 min a RT.
5. Preparare una soluzione di lavoro ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) biotinicolante diluizione di 20 g/mL di UEA-I biotinilato nel 5% di siero di cavallo normale in PBS.
6. Pipetto 50-u2012100 di soluzione di lavoro UEA-I per sezione e incubare per 1 h a RT in una camera umidificante.
7. Lavare le diapositive due volte in PBS per 3 min.
8. Sezioni di scorrimento del 3% di perossido di idrogeno per 5 min a RT.
9. Lavare le diapositive due volte in PBS per 3 min.
10. Preparare 5 g/mL di Streptavidin rafano perossiidsi-coniugato nel 5% di siero di cavallo normale in PBS.
11. Pipetto 50-u2012100 L su ogni scivolo di tessuto e incubare per 1 h a RT in una camera umidificante.
12. Lavare le diapositive due volte in PBS per 3 min.
13. Preparare la soluzione 3,3'Diaminobenzidine (DAB) secondo le istruzioni del produttore e aggiungere 50,u2012100 per sezione.
14. Incubare sezioni per 10-u201215 min, il controllo e il monitoraggio per lo sviluppo di macchia ogni 2 u20125 min.
15. Lavare le diapositive tre volte in PBS per 3 min.
16. Aggiungere una goccia di ematossilina e incubare per 3 minuti.
17. Mettere gli scivoli in un barattolo di colorazione e risciacquare in un lavandino da un flusso costante di acqua del rubinetto fino a quando l'acqua è limpida.
18. Scivolare in sequenza nell'80% etOH per 1 min, 90% EtOH per 1 min, 100% EtOH per 1 min e xylene per 2 min.
19. Lasciare asciugare le vetrini per 5-u201210 min sotto il cofano dei fumi.
20. Eroga una goccia di mezzo di montaggio permanente e non aqueo su sezioni di xenotrapianti e posiziona il coperture sulla parte superiore.
21. Lasciare asciugare i vetrini durante la notte prima dell'imaging.

9. Analisi dei canali vascolari derivati dall'uomo

NOTA: La vascolarizzazione delle lesioni VM è quantificata misurando l'area vascolare e la densità vascolare. Solo i canali vascolari positivi UEA-I derivati dall'uomo sono considerati per la quantificazione.

1. Prendere da quattro a cinque immagini per sezione di lesione con un microscopio a campo luminoso ad un ingrandimento 20x (campi ad alta potenza [HPF]). Prendere immagini HPF in un modello di piano x all'interno della sezione di lesione per evitare sovrapposizioni (Figura 1F-H). Includere una barra della scala nelle immagini scattate.
2. Aprire le immagini HPF in Immagine J (File > Apri). Calibrare i pixel della barra della scala come segue. Utilizzare lo strumento linea retta e passare sopra la barra della scala. Per convertire i pixel misurati in mm, fare clic su Analizza > Imposta scala.
3. Fare clic su Analizza > Imposta misure e selezionare Area e Aggiungi alla sovrapposizione.
4. Misurare l'area totale del campo in un HPF utilizzando Analizza > Misura. Salvare questa misura per la quantificazione al punto 9.8.
5. Utilizzando lo strumento selezioni a mano libera,⁺ delineare manualmente i canali vascolari UEA-I.
   NOTA: Un canale vascolare è definito come qualsiasi area⁺ che è fiancheggiata da UEA-I - EC che può contenere cellule del sangue.
6. Fare clic su Analizza > Misura per quantificare l'area vascolare UEA-I⁺ delineata (mm²/HPF).
7. Ripetere questa misura per tutti e cinque gli HPF presi all'interno di una spina.
8. Media dell'area vascolare totale di tutti e cinque gli HPF. L'area vascolare ottenuta per HPF viene successivamente divisa per l'area di campo HPF (in mm², passo 9.5) ed espressa in percentuale (%).
9. Per la quantificazione della densità vascolare, contare⁺ il numero di canali vascolari UEA-I di ogni HPF preso. La densità vascolare è il numero⁺ medio di canali vascolari UEA-I conteggiati per area HPF (navi/mm²).

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Risultati

Questo protocollo descrive il processo di generazione di un modello murine xenotrapianto di VM basato sull'iniezione sottocutanea della EC derivata dal paziente nella parte posteriore di topi nudi immunodeficienti. Le colonie di cellule endoteliali possono essere raccolte entro 4 settimane dall'isolamento iniziale delle cellule dal tessuto VM o dal sangue lesionale(Figura 1A,B). Il giorno dopo l'iniezione, la spina di lesione xenotrapianto copre una superficie di circa 80 u2012100 mm². Nelle n...

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Discussione

Qui viene descritto un metodo per generare un modello xenotrapianto derivato dal paziente della macchina virtuale. Questo modello murino presenta un eccellente sistema che consente ai ricercatori di ottenere una comprensione più profonda dell'allargamento del lume patologico e sarà determinante nello sviluppo di terapie più efficaci e mirate per il trattamento della VM. Questo può essere facilmente adattato per studiare altri tipi di anomalie vascolari come la malformazione venosa linfatica capillare

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males	Envigo	069(nu)/070(nu/+)	Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)	Vector Laboratories	B-1065	Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM)	Thermo Fisher	974106	Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA)	BSA	A7906-50MG	Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)	Sigma	C7902-500G	Cell culture
Caliper	Electron Microscopy Sciences	50996491	Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)	Life Technologies	11155D	EC separation
Cell strainer (100 μM)	Greiner	542000	Cell culture
Collagenase A	Roche	10103578001	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL)	Greiner	07 000 241	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL)	Greiner	07 000 239	Cell culture
Coplin staining jar	Ted Pella	21029	Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm)	Fisher Scientific	12545E	Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)	Vector Laboratories	SK-4105	Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-027-CV	Cell culture
DynaMag-2	Life Technologies	12321D	EC separation
Ear punch	VWR	10806-286	Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0)	Life Technologies	15575-020	Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)	Lonza	CC-3162	Cell culture
Eosin Y (alcohol-based)	Thermo Scientific	71211	Histological anlaysis
Ethanol	Decon Labs	2716	Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone	GE Healthcare	SH30910.03	Cell culture
Filter tip 1,250 μL	MidSci	AV1250-H	Multiple steps
Filter tip 20 μL	VWR	10017-064	Multiple steps
Filter tip 200 μL	VWR	10017-068	Multiple steps
Formalin buffered solution (10%)	Sigma	F04586	Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable)	SKC FILMS	DHCN015	Cell culture
Hematoxylin	Vector Hematoxylin	H-3401	Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)	Sigma	FC010-10MG	Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)	Sigma	H1009	Histological anlaysis
ImageJ Software			Analysis
Isoflurane, USP	Akorn Animal Health	59399-106-01	Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Sigma	M1880-500G	Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)	Corning	356237	Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	VWR	87003-294	EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)	Fisher Scientific	1255015-CS	Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles	Becton Dickinson (BD)	BD305115	Subcutaneous injection
Normal horse serum	Vector Laboratories	S-2000	Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)	Corning	30-009-CI	Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount)	Vector Laboratories	H-5000	Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain	Thomas Scientific	3431F55	EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994	Cell culture
Scale	VWR	65500-202	Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml)	VWR	89130-898	Cell culture
Serological pipettes (5ml)	VWR	89130-896	Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3)	Sigma	223530	Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC	Vector Laboratories	SA-5004	Cell culture
Syringe (60ml)	BD Biosciences	309653	Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM)	Corning	431219	Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock)	Becton Dickinson (BD)	BD-309628	Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)	Greiner	664160	Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm)	Greiner	639160	Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm	Eppendorf	30701119	Cell culture
Tris-base (Trizma base)	Sigma	T6066	Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %)	Life Technologies	15250061	Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)	Corning	25-052-Cl	Cell culture
Tween-20	Biorad	170-6531	Histological anlaysis
Wheaton bottle	VWR	16159-798	Cell culture
Xylenes	Fisher Scientific	X3P-1GAL	Histological anlaysis