Venöz Malformasyon için Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modeli

Özet

Venöz malformasyonun murine ksenogreft modelini oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sayılmiyoruz. Bu model, hiper aktive edici TIE2 ve/veya PIK3CA gen mutasyonları içeren hasta kaynaklı endotel hücrelerinin deri altı enjeksiyonuna dayanmaktadır. Ksenogreft lezyonları VM hasta dokusunun histopatolojik özelliklerini yakından özetler.

Özet

Venöz malformasyon (VM), venöz ağın bozulmuş gelişiminden kaynaklanan ve sıklıkla işlevsiz venlerle sonuçlanan vasküler bir anomalidir. Bu makalenin amacı, insan VM'sini taklit eden ve hasta heterojenliğini yansıtabilen bir murine ksenogreft modelinin kurulmasını dikkatle tanımlamaktır. VM'de patolojik damar genişlemesinin başlıca itici etkenleri olarak endotel hücrelerinde (EC) hiper-aktive edici olmayan (somatik) TEK (TIE2) ve PIK3CA mutasyonları tespit edilmiştir. Aşağıdaki protokol, mutant TIE2 ve/veya PIK3CA'yı ifade eden hasta kaynaklı EC'nin izolasyonu, saflaştırılması ve genişlemesini açıklamaktadır. Bu EC ektatik vasküler kanallar oluşturmak için immünoeksik atimik farelerin arkasına subkutan enjekte edilir. TIE2 veya PIK3CA-mutant EC ile oluşturulan lezyonlar enjeksiyondan sonraki 7\u20129 gün içinde gözle görülür şekilde vaskülarize edilir ve VM hasta dokusunun histopatolojik özelliklerini yeniden özetler. Bu VM ksenogreft modeli VM oluşumu ve genişlemesi sürüş hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için güvenilir bir platform sağlar. Buna ek olarak, bu model insan VM görülen anormal damar genişlemesini önlemede yeni ilaç adaylarının etkinliğini test çeviri çalışmaları için etkili olacaktır.

Giriş

Vaskülatür gelişimindeki bozukluklar venöz malformasyon (VM) gibi birçok hastalığın altında yatan nedenlerdir. VM anormal morfogenez ve damar genişlemesi ile karakterize konjenital bir hastalıktır¹. VM doku ve endotel hücreleri (EC) üzerinde yapılan önemli çalışmalar iki gende fonksiyon kazanım mutasyonları tespit etti: TEK, tirozin kinaz reseptörü TIE2 kodlayan, ve PIK3CA, p110α kodlayan (katalitik alt birim) PI3-kinaz (PI3K)^2,,3,4,5. Bu somatik mutasyonlar, PI3K/AKT dahil olmak üzere anahtar anjiyojenik/büyüme sinyal yollarının ligand-bağımsız hiper aktivasyonuile sonuçlanır ve böylece dilate ektatik venler³ile sonuçlanır. Bu önemli genetik keşiflere rağmen, anormal anjiyogenezi tetikleyen sonraki hücresel ve moleküler mekanizmalar ve genişlemiş vasküler kanalların oluşumu hala tam olarak anlaşılamamıştır.

Normal ve patolojik anjiyogenez sırasında, yeni damarlar önceden varolan vasküler ağdan filizlenir ve EC proliferasyon, göç, hücre dışı matriks (ECM) remodeling ve lümen oluşumu 6 dahil olmak üzere önemli hücresel süreçlerin bir dizi geçmesi⁶. EC'nin iki ve üç boyutlu (2D/3D) in vitro kültürleri bu hücresel özelliklerin her birini ayrı ayrı araştırmak için önemli araçlardır. Bununla birlikte, bir fare modeli ev sahibi mikro ortamda patolojik damar genişlemere açık bir talep ve çeviri araştırma için hedefli ilaçların preklinik değerlendirme için etkili bir platform sağlarken.

Bugüne kadar TIE2 fonksiyon artışı mutasyonları ile ilişkili vm transgenik bir murine modeli bildirilmemiştir. Mevcut transgenik VM fare modelleri, aktive mutasyonpik3CA p.H1047R^3,5'inher yerde veya doku kısıtlamalı ekspresyonuna dayanır. Bu transgenik hayvanlar, bu sıcak nokta PIK3CA mutasyonunun tüm vücut veya dokuya özgü etkileri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu modellerin sınırlandırılması erken öldürücülük ile sonuçlanan yüksek patolojik vasküler ağ oluşumudur. Bu nedenle, bu fare modelleri mutasyonel olayların düzensiz oluşumunu ve VM patolojisinin lokalize doğasını tam olarak yansıtmamaktadır.

Aksine, hasta kaynaklı ksenogreft modelleri transplantasyon veya patolojik doku veya immünoeksik fareler içine hastalardan elde edilen hücrelerin enjeksiyon dayanmaktadır⁷. Ksenogreft modelleri hastalık gelişimi ve yeni terapötik ajanların keşfi hakkında bilgi genişletmek için güçlü bir araçtır⁸. Buna ek olarak, hasta kaynaklı hücreleri kullanarak bilim adamları hasta fenotipspektrum çalışması için mutasyon heterojenite recapitulate sağlar.

Burada, TIE2 ve/veya PIK3CA'nın mutant-aktif formunu ifade eden hasta kaynaklı VM EC'nin atimik çıplak farelerin arkasına deri altı enjekte edildiği bir protokolü açıklıyoruz. Enjekte edilen vasküler hücreler önceki vasküler ksenogreft modellerinde açıklandığı gibi anjiyogenezi teşvik etmek amacıyla Bir ECM çerçevesinde askıya alınır^9,10,11. Bu VM EC önemli morfogenez geçmesi ve destekleyici hücrelerin yokluğunda genişlemiş, perfüzyon patolojik damarlar oluşturmak. VM'nin açıklanan ksenogreft modeli, kontrolsüz lümen genişlemesini inhibe edebilmeleri için hedeflenen ilaçların klinik öncesi değerlendirilmesi için etkili bir platform sağlar.

Protokol

Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi (CCHMC), Kanser ve Kan Hastalıkları Enstitüsü'nde kurumsal politikalara göre onaylı kurumsal inceleme kurulu (IRB) uyarınca Tümörlü ve Vasküler Anomalili Hastalardan Doku Örnekleri ve Verilerinin Toplanması ve Depolanmasının ve Klinik Araştırma Komitesi'nin onayı ile katılımcılardan hasta doku örnekleri alındı. Aşağıda açıklanan tüm hayvan prosedürleri CCHMC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Malzeme ve stok çözümlerinin hazırlanması

1. Komple endotel hücre büyüme ortamının hazırlanması (EGM)
   1. Ek endotel bazal orta (EBM) kiti mevcut aşağıdaki büyüme faktörleri ile (Malzemeler Tablosubakınız): insan Fibroblast Büyüme Faktörü-Beta (hFGF-β), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), Long Arg3 İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü- I (R³-IGF-I), askorbik asit, epidermal büyüme faktörü (EGF), gentamisin sülfat ve amphotericin-B, ve heparin. %1 Penisilin/Streptomisin/L-Glutamin (PSG) çözeltisi ve %20 fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
      NOT: Hidrokortizon eklemenizi önermiyoruz.
   2. Steril filtre bir laminar akış kaputu altında bir otoklav cam şişe içine 0,2 μm şişe üst filtre ve 50 mL konik tüpler içine aliquot medya ve 4 °C bir hafta ya da bir yıla kadar -20 °C'de saklayın.
2. Kollajenaz bir stok çözeltisi hazırlayın
   1. Hazırlamak 50 mg /mL kollajenaz 1x fosfat tampon salin (PBS) bir stok çözeltisi.
   2. Steril filtre 0.2 μm filtre ve şırınga ile bir laminar akış kaputu altında çözüm filtre ve -20 °C'de 100 μL aliquots saklayın.
3. Doku toplama ortamı (Tampon A) hazırlama
   1. 0,927 g kalsiyum klorür dihidrat (CaCl₂.2H₂O) ve 1 g magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO₄.7H₂O) ila 500 mL distile su ekleyerek ca²⁺/Mg²⁺ stok çözeltisi hazırlayın. Steril filtre çözeltisi 0,2 μm şişe üst filtre den otoklavlı cam şişe içine ve oda sıcaklığında saklamak (RT).
   2. Ek Dulbecco's Modifiye Kartal Orta (DMEM) ile 10% Ca²⁺/ Mg^{2 +} solüsyon ve 2% FBS.
   3. Steril filtre 0.2 μm filtre ve şırınga ile bir laminar akış kaputu altında çözüm ve depolamak 5 mL -20 °C.
4. Doku kültür plakalarının fibronektin kaplaması
   1. 500 mL deiyonize suda 5,3 g sodyum karbonatı (Na₂CO₃; 0,1 M) eriterek kaplama tamponu (Tampon B) hazırlayın. Tamponun pH'ını 1 M hidroklorik asit (HCl) kullanarak 9,4'e ayarlayın. 0,2 μm'lik bir şişe üst filtreden otoklavlı cam şişeye laminar akış kaputunun altında filtre uygulayın ve RT'de saklayın.
   2. Kaplama için, pipet 2 mL/5 mL/10 mL Tampon B başına 60 mm/100 mm/145 mm doku kültür plakası. İnsan plazması fibronectin saflaştırılmış protein çözeltisi 1 μg/cm² ekleyin ve yavaşça plaka üzerine sıvı dağıtmak.
   3. 37 °C'de kuluçka plakası, 20 dk için %5 CO_2.
   4. Tampon B'yi aspire edin ve hücreleri ayıklamadan önce plakayı PBS ile yıkayın.

2. VM hasta dokusundan endotel hücrelerinin izolasyonu

1. Katı VM dokusundan EC izolasyonu
   NOT: VM dokusu, IRB onaylı protokol altında^12,13 nolu debulking ameliyatı ile rezeke edilir.
   1. PBS'de %5'te VM dokusunu yıkayın (doku örnek ağırlığı genellikle 0,5 g ile 1,5 g arasında değişir).
   2. Dokuları 100 mm'lik hücre kültür kabına, kıyma dokusu örneğini steril cerrahi diseksiyon araçlarını kullanarak küçük parçalara aktarın ve 50 mL konik tüpe aktarın.
   3. 1mg kollajenaz 100 μL ekleyin 1 mg/mL'lik son konsantrasyon için 5 mL Tampon A'ya bir stok çözeltisi ekleyin, sonra bunu dokuya ekleyin ve kıyma dokusunu 37 °C'de 30 dakika boyunca sindirin ve her 5 dakikada bir içeriğini sallayın.
   4. 50 mL konik tüp içinde 6 mm, pürüzsüz yüzeyli zararlı öğütücü kullanarak RT'de sindirilmiş dokuyu dikkatlice öğütün.
   5. %0,5 büyükbaş hayvan serum albumini (BSA) ve %2 PSG ile birlikte 5 mL soğuk PBS eklerken bir havaneli kullanarak sindirilmiş dokuyu dikkatlice öğütmeye devam edin. Bu adımı dört kez tekrarlayın.
   6. Doku parçalarını çıkarmak için çözeltiyi 100 m hücreli süzgeçten 50 mL konik bir tüpe filtreleyin.
   7. RT 400 x g 5 dakika için santrifüj hücre süspansiyon. Adım 2.3 devam edin.
2. VM EC'nin hasta skleroterapisinden elde edilen lezyonal kandan izolasyonu
   1. IRB onaylı bir protokol altında skleroterapiden insan VM lezyonal kan elde edin.
   2. PBS'de seyreltik lezyonal kan (numune hacmi genellikle 0.5 mL ile 5 mL arasında değişmektedir) son hacmi 40 mL'dir.
   3. RT'de 200 x g'da 5 dk santrifüj hücre süspansiyonu.
3. İlk hücre kaplaması
   1. Supernatant atın ve EGM 1 mL tek hücreli pelet resuspend.
   2. Fibronektin kaplı (1 μg/cm²) 100 mm plakaya 9 mL tam EGM ve 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
   3. 37 °C'de, nemlendirilmiş %5 CO₂ atmosferinde kuluçkaya yatırın.
   4. Her gün 2 mL ortam çıkarın ve 2 mL steril filtreli FBS ekleyin.
   5. Hücre kültürleri 40\u201250% bir araya ulaştığında EGM tamamlamak için orta değiştirin. Hücrelerin bu biraraya gelmesi genellikle 2\u20123 hafta ları sürer.
   6. AK kolonilerinin görünümü için günlük gözlemleyin. Tipik "parke taşı benzeri" morfolojisi ile tanınırlar (Şekil 1A). Her örnekte 3\u20125 EC kolonileri görünür.
   7. Tek tek EC kolonileri birbirine dokunmaya başlayana kadar her gün 5\u20127 gün orta değiştirin.
4. Tek tek AT kolonilerinin manuel izolasyonu
   1. EC kolonilerini hasat etmek için plakayı 5 mL PBS ile yıkayın ve serolojik pipetle elle aspire edin.
   2. Plakayı bir mikroskopa götürün ve laminar akış başlığına geri vermeden önce hem kapakta hem de altta işaretleme kalemi kullanarak birden fazla EC kolonisinin konumlarını daire içine alın.
   3. Ec kolonilerini işaretli alanlara %0,05 tripsin-EDTA çözeltisi 50 μL boru ile ayırın.
   4. Küçük bir hücre kazıyıcı veya pipet ucu kullanarak, hücreleri yavaşça plakadan kazıyın.
   5. Plakayı en yakın kenara yatırın ve işaretli alan başına 1 mL EGM ile durulayın ve hücreleri toplayın.
   6. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanan hücre sayısını sayın.
   7. Toplanan EC kolonilerini 1 x 10⁴ hücre/cm² yoğunlukta, taze EGM içeren fibronektin kaplamalı (1 μg/cm²) hücre kültürü tabaklarına koyun. Ertesi gün, EGM tamamlamak için orta değiştirin.
   8. Hücreler %80 biraraya gelene kadar 2\u20123 haftası boyunca her gün EGM'yi tamamlamak için ortamı değiştirin.
   9. 2 mL önceden ısıtılmış 2 mL önceden ısıtılmış 0.05% trypsin-EDTA ile 37 °C'de 2 dk ve 4 mL EGM ekleyerek tripsin nötralize.
   10. Hücre süspansiyonundan 15 mL konik bir tüp ve 400 x g'de RT'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. EGM'nin 2 mL'sinde süpernatant ve resuspend hücreleri aspire edin.
   11. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanan hücre sayısını sayın. Elde edilen tipik hücre sayıları 60 mm hücre kültür plakası başına 1 x 10⁶ hücre veya 100 mm doku kültür plakası başına 2 x 10⁶ hücredir.
   12. 5 dk için RT 400 x g santrifüj ile hücreleri pelet ve supernatant aspire. Adım 3.2.1'e geçin.

3. Endotel hücre seçimi ve genişlemesi

1. Anti-CD31 konjuge manyetik boncukhazırlanması
   1. 30 s için anti-CD31 konjuge manyetik boncuk içeren şişe girdap. Gerekli boncuk sayısı 8 x 10⁶ boncuk/2 x 10⁶ hücredir.
   2. PBS'de %0,1 BSA içeren 1 mL yıkama çözeltisi ile istenilen miktarda anti-CD31 konjuge manyetik boncukları 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte yıkayın.
   3. Mikrosantrifüj tüpünü 1 dakika boyunca bir hücre izolasyon mıknatısına yerleştirin.
   4. Supernatant aspire ve yıkama adımı tekrarlayın.
2. Endotel hücre saflaştırma ve kaplama
   1. PBS'de %0.1 BSA içeren yıkama çözeltisinin 500 μL'sinde 2.4.12'de elde edilen hücre peleti.
   2. Manyetik boncuk içeren mikrosantrifüj tüp hücre çözeltisi ekleyin ve iyice resuspend.
   3. 4 °C'de 20 dk boyunca hafif eğimli kuluçka.
   4. PBS'e %0,1 BSA 500 μL ekleyin ve iyice karıştırın.
   5. Tüpü 1 dakika boyunca bir hücre izolasyon mıknatısına yerleştirin.
   6. Boncuklara dokunmadan hücrelerin CD31-negatif fraksiyonu içeren sıvının tamamını nazikçe aspire edin.
   7. CD31-pozitif hücre fraksiyonu içeren boncuk peletini PBS'de %0,1 BSA 1 mL ile yıkayın ve manyetik ayırmayı tekrarlayın.
   8. CD31-pozitif hücre fraksiyonu arındırmak için en az 3 kez yıkama ve manyetik ayırma adımı tekrarlayın.
   9. Saflaştırılmış endotel hücrelerini 15 mL konik bir tüpe yeniden askıya alın ve RT'de 400 x g'da 5 dakika aşağı doğru döndürün.
   10. EGM'nin 1 mL'sinde süpernatant ve resuspend hücre peletini çıkarın.
   11. Fibronektin kaplı (1 μg/cm²) 100 mm plakaya 9 mL tam EGM ve 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Bazı manyetik boncuklar hala bu ilk tohumlama adımında hücrelere bağlı olduğunu unutmayın. Çoğu boncuk hücre genişlemesi sırasında uzak yıkamak, ancak boncuk az sayıda erken geçitlerde devam edebilir.
   12. 37 °C'de, nemlendirilmiş %5 CO₂ atmosferinde kuluçkaya yatırın.
   13. Hücreler %80 biraraya gelene kadar ortamı her gün değiştirin(Şekil 1B).
3. Endotel hücre genişlemesi
   1. Hücreler %80 birleştiğinde, 100 mm çanak başına %0,05 tripsin-EDTA başına 2 mL ile 37 °C'de 2 dk.
   2. 4 mL EGM ekleyerek tripsini nötralize edin ve hücreleri 15 mL konik tüpe toplayın.
   3. 5 dk için RT 400 x g santrifüj.
   4. Süpernatant aspire, EGM 2 mL hücreleri resuspend, ve bir hemositometre veya otomatik hücre sayımı ile hücre sayısını saymak.
   5. 1 x 10⁴ hücre/cm² yoğunluktaki tohum hücreleri 145 mm fibronektin kaplı (1 μg/cm²) doku kültür plakalarına dönüşür.
   6. İstenilen hücre numarası karşılanana kadar hücreleri geçişe devam edin. 145 mm doku kültürü plakasının yaklaşık 8\u20129 x 10⁶ hücre içerdiğini ve gerekli hücre sayısının enjeksiyon başına 2,5 x 10⁶ hücre olduğunu göz önünde bulundurun. Ksenogreft için sadece 3 ve 8 arasındaki hücreler düşünülmelidir.

4. VM hasta kaynaklı ksenogreft protokolü

NOT: Bu protokolde biz 5 \u20126 haftalık, erkek immünyon, atimik çıplak Foxn1^nu fareler kullanın.

Tüm hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmalıdır.

1. Enjeksiyondan bir gün önce malzemelerin hazırlanması
   1. -20 °C dondurucuda bir gecede önceden soğutulan şırıngalar, iğneler ve pipet uçları.
   2. Jelin viskozitesinin artmasını önlemek için 4 °C'ye yerleştirilen buz kovası üzerindeki bazal membran hücre dışı matriksini (BMEM) bir gecede yavaşça eritin.
2. Enjeksiyon için hücre süspansiyonunun hazırlanması
   1. 37 °C'de 145 mm çanak başına 5 mL önceden ısıtılmış %0,05 tripsin-EDTA ile trypsinize EC 2 dk.
   2. 5 mL EGM ekleyerek tripsini nötralize edin ve hücreleri 15 mL konik tüpe toplayın.
   3. 5 dk için RT 400 x g santrifüj.
   4. Süpernatant aspire, EGM 3 mL hücreleri resuspend, ve bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayısını saymak.
   5. Planlanan tüm enjeksiyonlar için gereken toplam hücre sayısını belirleyin.
      NOT: Önerilen hücre sayısı enjeksiyon başına 2,5 x 10⁶ hücredir. Teknik yinelemeler için her farede genellikle toplam 2 enjeksiyon yapılır. Şırıngaya transfer sırasında ki kaybı hesaba katmak için hücre sayısının %10 fazlasını hesaplamak gerekir.
   6. Hesaplanan hücre numarasını içeren hacmi 5 dakika boyunca RT'de 400 x g'da santrifüj ile yeni bir 50 mL konik tüp ve pelet hücrelerine aktarın.
   7. Peloyu gevşetmek için küçük bir hacim (yaklaşık 50\u201270 μL) bırakarak supernatant aspire.
3. Şırınga hazırlama
   1. Şırınga transferi sırasında ki kaybı hesaba katmak için 20 μL/enjeksiyon hacmini hesaplayın. Hücre peletini 220 μL BMEM ile yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun enjekte edilen hacmi lezyon başına 200 μL olacaktır.
   2. Homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek ve kabarcıklar oluşturmaktan kaçınmak için hücre süspansiyonuna iyice buz üzerinde karıştırın.
   3. 1 mL pipet ve 1 mL şırınga kullanarak, aynı anda bmem hücre karışımını şırınganın pistonlarını çekerken emme kuvveti ile şırınga nın açılmasına pipet.
   4. Luer 26G x 5/8 inç steril iğneyi şırıngaya kilitleyin ve hazır şırıngaları enjeksiyondan önce buz üzerinde düz tutun.
4. Fareiçine deri altı enjeksiyonu
   1. Bir izofluran buharlaştırıcı kullanarak 1 L/dk akış hızında %5 izofluran/oksijen karışımı ile fareleri anestezi edin. Hayvanların doğru şekilde sedasyonunu (örneğin, toe çimdiklerine tepki vermeme) sağlayın. Burun konisi ile verilen %1,5 isofluran/oksijenin sürekli uygulanması ile anesteziyi koruyun.
   2. Fareleri midelerine yerleştirin, aşılamanın yapılacağı arka bölgeyi teşhir edin ve enjeksiyon bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin.
   3. Yavaşça herhangi bir yerleşmiş hücreleri askıya almak için hazırlanan şırınga rulo. Şırınganın iğne ucuna doğru kabarcıklar hareket ettirin ve tüm kabarcıkların kaldırılmasını sağlamak için hücre süspansiyonunun küçük bir hacmini dışarı at.
      NOT: Her fare için iki enjeksiyon yapılabilir – farenin sol ve sağ tarafında.
   4. Başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak 'çadır benzeri' bir yapı oluşturun ve iğneyi deri altına deri altına yerleştirin. İğne kas dokusuiçine enjeksiyonu önlemek için sıkıştırılmış deri serbest bırakarak sadece derin olduğundan emin olun.
   5. İğneyi 45° açıda tutmak, küçük bir küresel kütle oluşturmak için hücre süspansiyonunun 200 μL'sini dikkatlice enjekte edin(Şekil 1C).
   6. Fare ağırlığını bir ölçekle kaydedin, fareyi etiketedin ve kafese geri dönün.
   7. Normal aktiviteye geri döndüklerinden emin olmak için sedasyon dan sonra fareleri izleyin.
5. Lezyon büyüme izleme
   1. Kaliper kullanarak, her fişin uzunluğunu ve genişliğini ölçün(Şekil 1D).
   2. Lezyon koleksiyonuna kadar her gün ölçümleri belgeleme.

5. Doku toplama ve işleme

1. Ötanazi fareler 9 gün sonra bir CO₂ odasında implantasyon ve ölüm onaylamak için hayati belirtileri kontrol edin. Fare ötanazi için ikincil bir yöntem olarak fareler üzerinde servikal dislokasyon gerçekleştirin.
2. Cerrahi forceps ve makas kullanarak diseksiyonu ile fare nin kanadından ksenogreft lezyonu/fişini hasat edin.
   NOT: Fiş içindeki kan dolu damarların yırtılmasını önlemek için, lezyon fişe diseksiyon araçlarıyla dokunmamak ve fişe bağlı deri gibi aşırı çevre dokusu bırakmak önemlidir.
3. Rezeke lezyonu yıkamak için PBS'ye batırın.
4. Bir kamera ile bir kamera sahne ayarlayın. Fişleri cetvelli kesme tahtasına hizala. Lezyonların brüt vaskülaritesini kaydetmek için tüm fişlerin görüntüsünü alın(Şekil 1E).
5. RT'de bir gecede %10 formalin daldırarak fişleri düzeltin.
6. Ertesi gün Fişleri PBS'de yıkayın ve %70 etanole taşıyın.
7. Parafin katıştırma (patoloji çekirdeği) için proses lezyon fişleri.

6. Lezyon kesiti

1. Toplanan mürin lezyonlarından 5 μm'lik kesitleri pozitif yüklü slaytlara kesmek için bir mikrotom kullanın.
   NOT: Sonraki analizler için fişin merkezindeki bölümler (dokuiçine yaklaşık 50\u201270 μm) önem taşımaktadır.
2. Parafini 60 °C'de 1 saat boyamadan önce eritin.
3. Kimyasal bir duman akış başlığı altında sırayla de-parafinize ve yeniden nemlendirmek doku. Bu nedenle, ksilene 10 dakika, 5 dk için %100 etanol (EtOH), 3 dk için %90 EtOH ve 3 dk için %80 EtOH için inkübasyon kaydırık.
4. 5 dakika deiyonize suda durulayın.

7. Hematoksilin ve Eozin (H&E)

1. Hematoksilin inkübasyon bölümleri 2 dakika.
2. Bir boyama kavanozuna slaytlar yerleştirin ve su temizlenir kadar musluk suyu sabit bir akışı ile bir lavaboda durulayın.
3. 1 dk için %70 EtOH, 1 dk için %80 EtOH, 1 dk için %90 EtOH, 1 dk için %100 EtOH ve 1 dk için taze %100 EtOH ile dokuyu ayrıştırın.
4. Eosin Y'de 30 s.'lik leke bölümleri.
5. Çözelti temizolana kadar taze %100 EtOH'u durulayın.
6. Ksilenes inkübat slayt 2 dk. Duman kaputunun altında 5\u201210 dk için slaytlar kuruedelim.
7. Ksenogreft kesitleri üzerinde kalıcı, sulu olmayan montaj ortamı bir damla dağıtın ve üstüne coverslip yerleştirin.
8. Görüntülemeden önce slaytların bir gecede kurumasını bekleyin.

8. İmmünohistokimya

1. Tris-baz 0,6 g ve 0,5 M EDTA ile 500 mL deiyonize su arasında 1 mL tartarak antijen alma tamponu (Tris-EDTA) hazırlayın. 1 M HCl kullanarak pH'ı 9,0'a ayarlayın.
2. Incubate de-parafinize doku slaytlar (adım 6.2 elde edilen gibi\u20126.3) antijen alma tamponu ile bir beher, bir ısıtma bloğu üzerinde karıştırma, 95 °C 20 dakika.
3. Isı tonundan kabı çıkarın, çözeltinin 35 °C'ye soğumasını bekleyin ve PBS'de 3 dk yıkayın.
4. RT'de 30 dk için PBS%5 normal at serumunda blok doku bölümleri.
5. PBS'de %5 normal at serumunda 20 μg/mL biyotinylated UEA-I seyrelterek biyotinylated Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) çalışma çözeltisi hazırlayın.
6. Pipet 50\u2012100 μL UEA-I çalışma çözeltisi bölüm başına ve bir nemlendirici odasında RT 1 saat için kuluçka.
7. Slaytları PBS'de iki kez 3 dakika yıkayın.
8. RT'de 5 dk için %3 hidrojen peroksit tespin slayt bölümleri.
9. Slaytları PBS'de iki kez 3 dakika yıkayın.
10. PBS'de %5 normal at serumunda 5 μg/mL Streptavidin horseradish peroksidaz-konjuge hazırlayın.
11. Pipet 50\u2012100 μL her doku slayt ve bir nemlendirici odasında RT 1 saat kuluçka.
12. Slaytları PBS'de iki kez 3 dakika yıkayın.
13. Üreticinin talimatlarına göre 3,3'Diaminobenzidin (DAB) çözeltisi hazırlayın ve bölüm başına 50\u2012100 μL ekleyin.
14. 10\u201215 dk için kuluçka bölümleri, her 2\u20125 dk leke gelişimi için kontrol ve izleme.
15. Slaytları PBS'de 3 dakika boyunca üç kez yıkayın.
16. Hematoksilin bir damla ekleyin ve 3 dakika kuluçka.
17. Bir boyama kavanozuna slaytlar yerleştirin ve su temizlenir kadar musluk suyu sabit bir akışı ile bir lavaboda durulayın.
18. 1 dk için %80 EtOH, 1 dk için %90 EtOH, 1 dk için %100 EtOH ve 2 dk ksilen şeklinde sırayla inkübasyon kaydırı.
19. Duman kaputunun altında 5\u201210 dk için slaytlar kuruedelim.
20. Ksenogreft kesitleri üzerinde kalıcı, sulu olmayan montaj ortamı bir damla dağıtın ve üstüne coverslip yerleştirin.
21. Görüntülemeden önce slaytların bir gecede kurumasını bekleyin.

9. İnsan kaynaklı Vasküler Kanalların analizi

NOT: VM lezyonlarının vaskülaritesi vasküler alan ve vasküler yoğunluk ölçülerek ölçülür. Sadece UEA-I pozitif, insan kaynaklı vasküler kanallar sayısallaştırma için kabul edilir.

1. 20x büyütmede (yüksek güç alanları [HPF]) parlak alan mikroskobu yla lezyon kesiti başına dört ila beş görüntü alın. HpF görüntülerini lezyon kesitinde x düzlemi desenli olarak üst üste binmemek için alın (Şekil 1F-H). Çekilen resimlere bir ölçek çubuğu ekleyin.
2. HPF görüntülerini Resim J'de açın (Dosya > Aç). Ölçek çubuğunun piksellerini aşağıdaki gibi kalibre edin. Düz çizgi aracını kullanın ve ölçek çubuğunun üzerinden gidin. Ölçülen pikselleri mm'ye dönüştürmek için Analyze > Set ölçeğinetıklayın.
3. Analiz et > Ölçümleri Ayarla'ya tıklayın ve Yerkaplamaya Alan ve Ekle'yi seçin.
4. Analyze > Measure kullanarak HPF'deki toplam alan alanını ölçün. Bu ölçümü 9.8 adımda nicelleştirme için kaydedin.
5. Freehand seçim aracını kullanarak, UEA-I⁺ vasküler kanalları el ile anahat.
   NOT: Vasküler kanal, kan hücreleri içerebilen UEA-I⁺ - EC ile kaplı herhangi bir alan olarak tanımlanır.
6. Ana hatlarıyla özetlenen UEA-I⁺ vasküler alanı (mm²/HPF) ölçmek için Analiz > Ölçü'ye tıklayın.
7. Bu ölçümü tek bir fiş içinde alınan beş HPF için tekrarlayın.
8. Beş HPF'nin toplam vasküler alanının ortalamasını yapın. HPF başına elde edilen vasküler alan daha sonra HPF alan alanına bölünür (mm², adım 9.5) ve yüzde (%) olarak ifade edilir.
9. Vasküler yoğunluğun ölçülmesi için alınan her HPF'nin UEA-I⁺ vasküler kanallarının sayısını sayın. Vasküler yoğunluk, HPF bölgesine göre sayılan uea-I⁺ vasküler kanalların ortalama sayısıdır (damarlar/mm^2).

Sonuçlar

Bu protokol, immünofif uyruvarlı çıplak farelerin arkasına hasta kaynaklı EC'nin deri altı enjeksiyonuna dayalı vm'nin bir murine ksenogreft modeli oluşturma sürecini açıklar. Endotel hücre kolonileri VM dokusundan veya lezyonal kandan ilk hücre izolasyonundan sonra 4 hafta içinde hasat edilebilir(Şekil 1A,B). Enjeksiyondan bir gün sonra, ksenogreft lezyon fişi yaklaşık 80\u2012100 mm^2'likbir yüzey alanını kaplar. Elimizde TIE2/PIK3CA-mutant EC'li lezyon fişleri gözle ...

Tartışmalar

Burada, VM'nin hasta kaynaklı ksenogreft modelini oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu rüre modeli araştırmacılar patolojik lümen genişleme daha derin bir anlayış kazanmak için izin veren mükemmel bir sistem sunuyor ve VM tedavisi için daha etkili ve hedefli tedaviler geliştirilmesinde etkili olacaktır. Bu kolayca kapiller lenfatik venöz malformasyon¹⁶gibi vasküler anomalilerin diğer türleri araştırmak için adapte edilebilir. Tekrarlanabilir vasküler lezyonların ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males	Envigo	069(nu)/070(nu/+)	Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)	Vector Laboratories	B-1065	Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM)	Thermo Fisher	974106	Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA)	BSA	A7906-50MG	Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)	Sigma	C7902-500G	Cell culture
Caliper	Electron Microscopy Sciences	50996491	Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)	Life Technologies	11155D	EC separation
Cell strainer (100 μM)	Greiner	542000	Cell culture
Collagenase A	Roche	10103578001	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL)	Greiner	07 000 241	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL)	Greiner	07 000 239	Cell culture
Coplin staining jar	Ted Pella	21029	Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm)	Fisher Scientific	12545E	Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)	Vector Laboratories	SK-4105	Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-027-CV	Cell culture
DynaMag-2	Life Technologies	12321D	EC separation
Ear punch	VWR	10806-286	Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0)	Life Technologies	15575-020	Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)	Lonza	CC-3162	Cell culture
Eosin Y (alcohol-based)	Thermo Scientific	71211	Histological anlaysis
Ethanol	Decon Labs	2716	Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone	GE Healthcare	SH30910.03	Cell culture
Filter tip 1,250 μL	MidSci	AV1250-H	Multiple steps
Filter tip 20 μL	VWR	10017-064	Multiple steps
Filter tip 200 μL	VWR	10017-068	Multiple steps
Formalin buffered solution (10%)	Sigma	F04586	Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable)	SKC FILMS	DHCN015	Cell culture
Hematoxylin	Vector Hematoxylin	H-3401	Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)	Sigma	FC010-10MG	Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)	Sigma	H1009	Histological anlaysis
ImageJ Software			Analysis
Isoflurane, USP	Akorn Animal Health	59399-106-01	Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Sigma	M1880-500G	Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)	Corning	356237	Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	VWR	87003-294	EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)	Fisher Scientific	1255015-CS	Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles	Becton Dickinson (BD)	BD305115	Subcutaneous injection
Normal horse serum	Vector Laboratories	S-2000	Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)	Corning	30-009-CI	Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount)	Vector Laboratories	H-5000	Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain	Thomas Scientific	3431F55	EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994	Cell culture
Scale	VWR	65500-202	Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml)	VWR	89130-898	Cell culture
Serological pipettes (5ml)	VWR	89130-896	Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3)	Sigma	223530	Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC	Vector Laboratories	SA-5004	Cell culture
Syringe (60ml)	BD Biosciences	309653	Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM)	Corning	431219	Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock)	Becton Dickinson (BD)	BD-309628	Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)	Greiner	664160	Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm)	Greiner	639160	Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm	Eppendorf	30701119	Cell culture
Tris-base (Trizma base)	Sigma	T6066	Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %)	Life Technologies	15250061	Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)	Corning	25-052-Cl	Cell culture
Tween-20	Biorad	170-6531	Histological anlaysis
Wheaton bottle	VWR	16159-798	Cell culture
Xylenes	Fisher Scientific	X3P-1GAL	Histological anlaysis