Пациент-производные Ксенотрансплантат Модель для венозной мальформации

Резюме

Мы представляем подробный протокол для создания murine xenograft модель венозной мальформации. Эта модель основана на подкожной инъекции эндотелиальных клеток, полученных пациентом, содержащих гиперактивные мутации генов TIE2 и/или PIK3CA. Поражения ксенотрансплантата тесно резюмируют гистопатологические особенности ткани пациента VM.

Аннотация

Венозная мальформация (ВМ) является сосудистой аномалией, которая возникает в результате нарушения развития венозной сети, что приводит к расширенным и часто дисфункциональным венам. Цель этой статьи состоит в том, чтобы тщательно описать создание модели ксенотрансплантата murine, которая имитирует человеческий VM и способна отражать неоднородность пациента. Гиперактивные ненаследуемые (соматические) мутации ТЭК (TIE2) и ПИК3КА в эндотелиальных клетках (ЭК) определены в качестве основных факторов расширения патологических сосудов в ВМ. В следующем протоколе описывается изоляция, очистка и расширение ЕК, полученной пациентом, выражают мутант TIE2 и/или PIK3CA. Эти EC вводятся подкожно в спину иммунодефицитных атимических мышей для генерации эктатических сосудистых каналов. Поражения, генерируемые TIE2 или PIK3CA-мутантом EC, заметно сосудизируются в течение 7-20129 дней после инъекции и подытося гистопатологические особенности ткани пациента VM. Эта модель Ксенотрансплантата VM обеспечивает надежную платформу для исследования клеточных и молекулярных механизмов, движущих образованием и расширением VM. Кроме того, эта модель будет иметь важное значение для трансляционных исследований тестирования эффективности новых кандидатов наркотиков в предотвращении аномального расширения сосудов видели в человеке VM.

Введение

Дефекты в развитии сосудов являются основной причиной многих заболеваний, включая венозную мальформацию (ВМ). ВМ является врожденным заболеванием, характеризующимся аномальным морфогенезом и расширением^{вен 1.} Важные исследования на ткани VM и эндотелиальных клеток (EC) определили усиления функции мутаций в двух генах: ТЭК, который кодирует рецептор тирозинкиназы TIE2, и PIK3CA, который кодирует p110 "(каталитический субъединица) изоформ PI3-киназы (PI3K)^2,3,4.5 Эти соматические мутации приводят к лиганд-независимой гипер-активации ключевых ангиогенных/рост сигнальных путей, включая PI3K/AKT, что приводит к расширенным эстатическим^{венам 3}. Несмотря на эти важные генетические открытия, последующие клеточные и молекулярные механизмы, запускающие аномальный ангиогенез и образование увеличенных сосудистых каналов, до сих пор не до конца изучены.

Во время нормального и патологического ангиогенеза, новые сосуды прорастают из уже существующей сосудистой сети и EC проходят последовательность важных клеточных процессов, включая пролиферацию, миграцию, внеклеточную матрицу (ECM) ремоделирование и образование^{люмена 6}. Двух- и трехмерные (2D/3D) культуры in vitro EC являются важными инструментами для исследования каждого из этих клеточных свойств в отдельности. Тем не менее, существует явный спрос на модель мыши, резюмируемую расширение патологических сосудов в рамках микроокноронности хозяина, обеспечивая при этом эффективную платформу для доклинческой оценки целевых препаратов для трансляционных исследований.

До настоящего времени не сообщалось о трансгенной модели murine VM, связанной с мутациями усиления функции TIE2. Текущие трансгенные модели мышей VM опираются на повсеместное или ограниченное в тканях выражение активизировавшейся мутации PIK3CA p.H1047R^3,5. Эти трансгенные животные дают значительное представление о воздействии этой мутации PIK3CA на все тело или ткани. Ограничением этих моделей является формирование высоко патологической сосудистой сети, приводящей к ранней летальности. Таким образом, эти мышиные модели не в полной мере отражают спорадическое возникновение мутационных явлений и локализованный характер патологии ВМ.

Напротив, модели ксенотрансплантата, полученные пациентом, основаны на трансплантации или инъекции патологических тканей или клеток, полученных от пациентов в иммунодефицитных^{мышей 7}. Ксенотрансплантат модели являются мощным инструментом для расширения знаний о развитии болезни и открытие новых терапевтических^{агентов 8}. Кроме того, использование клеток, полученных пациентами, позволяет ученым резюмировать неоднородность мутаций для изучения спектра фенотипов пациентов.

Здесь мы описываем протокол, в котором полученные пациентом VM EC, которые выражают мутант constitutively-активную форму TIE2 и/или PIK3CA вводятся подкожно в задней части атимических обнаженных мышей. Инъекционные сосудистые клетки подвешиваются в рамках ЭКМ для содействия ангиогенезу, как описано в предыдущих сосудистых моделях ксенотрансплантата^9,,10,,11. Эти ВМ EC проходят значительный морфогенез и генерируют увеличенные, проникнутые патологические сосуды при отсутствии поддерживающих клеток. Описанная ксенотрансплантатная модель ВМ обеспечивает эффективную платформу для доклинческой оценки целевых препаратов на их способность препятствовать неконтролируемому расширению люмена.

протокол

Образцы тканей пациентов были получены от участников после информированного согласия от сбора и хранения образцов тканей и данных от пациентов с опухолями и сосудистыми аномалиями в соответствии с утвержденным Институциональным советом по обзору (IRB) в рамках институциональной политики в Медицинском центре детской больницы Цинциннати (CCHMC), Институте рака и заболеваний крови и с одобрения Комитета по клиническим исследованиям. Все процедуры, описанные ниже, были рассмотрены и одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных CCHMC.

1. Подготовка материалов и фондовых решений

1. Подготовка полной эндотелиальной среды роста клеток (EGM)
   1. Дополнение эндотелиальной базальной среды (EBM) со следующими факторами роста, присутствующими в комплекте (см. Таблицу материалов ):фактор роста фибробласта человека -бета (hFGF-я), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), Long Arg3 Инсулин-как фактор роста - I (R³-IGF-I), аскорбиновая кислота, эпидермальный фактор роста (EGF), гентамицин сульфат и амфотерицин-B, и гепарин. Добавьте 1% раствор пенициллина/стрептомицина/L-глютамина (PSG) и 20% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не рекомендуем добавлять гидрокортизон.
   2. Стерильный фильтр раствор под капотом ламинарного потока через 0,2 мкм бутылки верхний фильтр в автоклав стеклянной бутылке и aliquot средств массовой информации в 50 мл конических трубок и хранить при 4 градусов по Цельсию до недели или при -20 градусов по Цельсию на срок до одного года.
2. Подготовка коллагеназы фондовый раствор
   1. Подготовка 50 мг/ мл коллагеназы фондовый раствор в 1x фосфат буфера солевого раствора (PBS).
   2. Стерильный фильтр раствор под капотом ламинарного потока с фильтром 0,2 мкм и шприцем, и хранить 100 йл aliquots при -20 градусов по Цельсию.
3. Подготовка среды сбора тканей (Buffer A)
   1. Приготовьте раствор^{бульона}Ca 2 '/Mg^2' путем добавления 0,927 г дигидрата хлорида кальция (CaCl₂.2H₂O) и 1 г г г гептагидрата сульфата магния (MgSO₄.7H₂O) до 500 мл дистиллированной воды. Стерильный фильтр решения через 0,2 мкм бутылки верхний фильтр в автоклав стеклянной бутылке и хранить при комнатной температуре (RT).
   2. Дополнение Dulbecco Модифицированный Eagle Medium (DMEM) с 10% Ca²"/Mg^2" решение и 2% FBS.
   3. Стерильный фильтр раствор под капотом ламинарного потока с фильтром 0,2 мкм и шприцем и хранить aliquots 5 мл при -20 градусов по Цельсию.
4. Фибронектиновое покрытие тканевых пластин культуры
   1. Подготовка буфера покрытия (Buffer B) путем растворения 5,3 г карбоната натрия (Na₂CO₃; 0.1 M) в 500 мл деионизированной воды. Отрегулируйте рН буфера до 9,4 с использованием 1 М соляной кислоты (HCl). Фильтр под капотом потока ламинара через фильтр верхней бутылки 0,2 мкм в автоклав стеклянную бутылку и хранить на RT.
   2. Для покрытия пипетка 2 мл/5 мл/10 мл буфера B на 60 мм/100 мм/145 мм пластины культуры ткани, соответственно. Добавьте 1 мкг/см^{2 раствора} очищенного белка плазмы человека и аккуратно распределите жидкость по пластине.
   3. Инкубационая пластина при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂ в течение 20 мин.
   4. Аспират Буфер B и мыть пластину с PBS до культивирования клеток.

2. Изоляция эндотелиальных клеток из ткани пациента VM

1. Изоляция ЕС от твердой ткани VM
   ПРИМЕЧАНИЕ: VM ткани resected путем debulking^{хирургии 12,13} в соответствии с протоколом IRB утвержденных.
   1. Вымойте VM ткани (вес образца ткани обычно колеблется от 0,5 г до 1,5 г) в 5% PSG в PBS.
   2. Передача ткани в 100 мм клеточной культуры блюдо, фарш ткани образца на мелкие кусочки с помощью стерильных хирургических инструментов вскрытия, и передать в 50 мл конической трубки.
   3. Добавьте 100 л коллагеназы стокового раствора в 5 мл буфера А для окончательной концентрации 1 мг/мл, затем добавьте это в ткань и перемешайте рубленую ткань при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, встряхивая содержимое каждые 5 минут.
   4. Тщательно измельчите переваренную ткань в RT с помощью 6 мм гладкой поверхности молоть шлифовальной машины в 50 мл конической трубки.
   5. Продолжайте тщательно молоть переваренной ткани с помощью пестика при добавлении 5 мл холодного PBS дополняется 0,5% бычьего альбумин сыворотки (BSA) и 2% PSG. Повторите этот шаг четыре раза.
   6. Фильтр раствор через 100 мкм ситечко клеток в 50 мл конической трубки для удаления фрагментов тканей.
   7. Центрифуга клеточной подвески в течение 5 мин при 400 х г на RT. Продолжить шаг 2,3.
2. Изоляция ВМ ЭК от пораженной крови, полученной в результате склеротерапии пациента
   1. Получить человека VM поражения крови от склеротерапии в соответствии с протоколом IRB утвержденных.
   2. Разбавленная пораженная кровь (объем образца обычно колеблется от 0,5 мл до 5 мл) в PBS до конечного объема 40 мл.
   3. Центрифуга клеточной подвески в течение 5 мин при 200 х г на RT.
3. Начальное покрытие ячейки
   1. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелайте одноклеточную гранулу в 1 мл EGM.
   2. Добавьте 9 мл полного EGM на фибронектин покрытием (1 мкг/см2) 100 мм пластин и семян 1 мл клеточной подвески.
   3. Инкубационные клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненной атмосфере 5% CO_2.
   4. Каждый день удалите 2 мл мультимедиа и добавьте 2 мл стерильной фильтрованной FBS.
   5. Как только клеточные культуры достигают слияния 40-u201250% изменить средний для завершения EGM. Это обычно занимает от 2'u20123 недель для клеток, чтобы достичь этого слияния.
   6. Ежедневно наблюдайте за появлением колоний ЕС. Они могут быть признаны по их типичной "булыжник-как" морфология (рисунок 1A). В каждой выборке отображаются между 3-20125 EC-колониями.
   7. Изменение среды через день в течение еще 5'u20127 дней, пока отдельные колонии ЕС начинают касаться друг друга.
4. Ручная изоляция отдельных колоний ЕС
   1. Чтобы собрать колонии ЕС, мыть пластину с 5 мл PBS и вручную аспирировать с серологическим пипеткой.
   2. Возьмите пластину к микроскопу и круг местах нескольких колоний ЕС с помощью маркировки перо как на крышке и дне, прежде чем вернуть его в ламинарный капюшон потока.
   3. Отсоедините колонии ЕС путем трубопроводного раствора 50 МКЛ из 0,05% трипсина-ЭДТА на отмеченных участках.
   4. Используя небольшой сотовый скребок или наконечник пипетки, аккуратно соскрепайте клетки с тарелки.
   5. Наклоните пластину до ближайшего края и промойте 1 мл EGM на отмеченную область и соберите ячейки.
   6. Подсчитайте количество ячеек с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
   7. Плита собранных колоний ЕС при плотности 1 х 10⁴ клеток/см^{2 на} фибронектин покрытием (1 мкг/см2) клеточной культуры блюда, содержащие свежие EGM. На следующий день измените средний для завершения EGM.
   8. Изменение среды для завершения EGM через день в течение 2'u20123 недель, пока клетки не достигнут 80% слияния.
   9. Трипсинизировать EC с 2 мл предварительно разогретого 0,05% трипсина-ЭДТА на 100 мм блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин и нейтрализовать трипсин, добавив 4 мл EGM.
   10. Соберите подвеску клетки в одну коническую трубку 15 мл и центрифугу при 400 x g в RT в течение 5 минут. Аспиратировать сверхнатантные и повторное течение клеток в 2 мл EGM.
   11. Подсчитайте количество ячеек с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Типичные числа клеток, полученных являются 1 х^{10 6 клеток} на 60 мм пластины культуры клеток или 2 х^{10 6} клеток на 100 мм пластины культуры ткани.
   12. Пеллет клеток центрифугации на 400 х г на RT в течение 5 мин и аспирировать супернатант. Приступайте к шагу 3.2.1.

3. Эндотелиальный отбор клеток и расширение

1. Подготовка противо-CD31-спряженных магнитных бусин
   1. Вихрь флакон, содержащий анти-CD31-конъюгированных магнитных бусин для 30 с. Количество необходимых бусин 8 х 10⁶ бусин/2 х 10^{6 клеток.}
   2. Вымойте нужное количество анти-CD31-конъюгированных магнитных бусин с 1 мл раствора для мытья, содержащего 0,1% BSA в PBS в 1,5 мл микроцентрифуг трубки.
   3. Поместите трубку микроцентрифуга в магнит изоляции клеток в течение 1 мин.
   4. Аспирировать супернатант и повторить шаг стирки.
2. Эндотелиальная очистка клеток и покрытие
   1. Гранулы повторного производства клеток, полученные в 2.4.12 в 500 йл раствора для мытья, содержащего 0,1% BSA в PBS.
   2. Добавьте клеточный раствор в микроцентрифугную трубку, содержащую магнитные бусы, и тщательно будем повторно использоваться.
   3. Инкубировать в течение 20 минут при 4 градусов по Цельсию с нежным наклоном.
   4. Добавьте 500 МЛ 0,1% BSA в PBS и хорошо перемешайте.
   5. Поместите трубку на магнит изоляции клеток в течение 1 мин.
   6. Аккуратно аспирировать всю жидкость, которая содержит CD31-отрицательную долю клеток, не касаясь бисера.
   7. Вымойте шарик гранулы, содержащие CD31-положительной фракции клеток с 1 мл 0,1% BSA в PBS и повторить магнитное разделение.
   8. Повторите стирку и магнитное разделение шаг как минимум в 3 раза, чтобы очистить CD31-положительной фракции клеток.
   9. Resuspend очищенные эндотелиальные клетки в 15 мл конической трубки и спина вниз в течение 5 мин при 400 х г на RT.
   10. Удалить супернатант и повторное течение ячейки гранулы в 1 мл EGM.
   11. Добавьте 9 мл полного EGM на фибронектин покрытием (1 мкг/см2) 100 мм пластин и семян 1 мл клеточной подвески. Обратите внимание, что некоторые магнитные бусины по-прежнему прикреплены к клеткам в этом первом шаге посева. Большинство бусин смываются во время расширения клеток, но небольшое количество бисера может сохраняться в ранних проходах.
   12. Инкубационные клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненной атмосфере 5% CO_2.
   13. Изменение среды через день, пока клетки не достигнут 80% слияния(рисунок 1B).
3. Расширение эндотелиальных клеток
   1. Как только клетки достигают 80% слияния, отсоедините с 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА на 100 мм блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
   2. Нейтрализуй трипсин, добавив 4 мл EGM и соберите клетки в одну коническую трубку 15 мл.
   3. Центрифуга при 400 x g в RT в течение 5 мин.
   4. Аспирировать сверхнатантные, повторное течение клеток в 2 мл EGM, и подсчитать количество клеток с гемоцитометром или автоматизированного подсчета клеток.
   5. Семенные клетки с плотностью 1 х 10⁴ клетки/см2 в 145 мм фибронектин покрытием (1 мкг/см2) пластины культуры ткани.
   6. Продолжайте прохождение ячеек до тех пор, пока не будет выполнен желаемый номер ячейки. Учти, что в культуре ткани диаметром 145 мм содержится около 8-20129 х 10^{6 клеток,} а количество необходимых клеток составляет 2,5 х 10^{6 клеток} на инъекцию. Только клетки между проходом 3 и 8 должны быть рассмотрены для ксенотрансплантата.

4. Протокол ксенотрансплантата, полученный пациентом VM

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы используем 5'u20126 неделю, мужской иммунодефицит, athymic обнаженной Foxn1^{ню мышей.}

Все процедуры для животных должны быть одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC).

1. Подготовка материалов за день до инъекции
   1. Предварительно холод шприцы, иглы, и пипетки советы в -20 градусов по Цельсию морозильник на ночь.
   2. Медленно оттаивать мембрану подвала внеклеточной матрицы (BMEM) на ночь на ведро со льдом размещены при 4 градусов по Цельсию, чтобы избежать повышенной вязкости геля.
2. Подготовка клеточной суспензии к инъекциям
   1. Трипсинизировать EC с 5 мл предварительно разогретого 0,05% трипсина-ЭДТА на 145 мм блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
   2. Нейтрализуй трипсин, добавив 5 мл EGM и соберите клетки в одну коническую трубку 15 мл.
   3. Центрифуга при 400 x g в RT в течение 5 мин.
   4. Аспирировать сверхнатантные, повторно использовать клетки в 3 мл EGM, и подсчитать количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированной счетчика клеток.
   5. Определите общее количество клеток, необходимых для всех запланированных инъекций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое количество клеток составляет 2,5 х 10^{6 клеток} на инъекцию. В общей сложности 2 инъекции, как правило, выполняются в каждой мыши для технических дубликатов. Необходимо рассчитать 10% превышение количества клеток, чтобы учесть потери при передаче в шприц.
   6. Перенесите объем, содержащий расчетный номер клетки, в новую коническую трубку 50 мл и гранулированные клетки путем центрифугации при 400 x g в RT в течение 5 минут.
   7. Аспирировать супернатант, оставляя небольшой объем (около 50'u201270 L), чтобы ослабить гранулы.
3. Подготовка шприца
   1. Рассчитайте избыточный объем в 20 йл/инъекцию с учетом потерь при переводе в шприц. Повторное использование клеточной гранулы с 220 МЛ БМЭМ на инъекцию на льду. Инъекционный объем клеточной суспензии будет 200 МКЛ за поражение.
   2. Смешайте подвеску клетки тщательно на льду, чтобы получить однородную подвеску клетки и избежать создания пузырьков.
   3. Используя 1 мл пипетки и 1 мл шприца, одновременно трубят BMEM-клеточной смеси в шприц открытия всасывающей силой, потянув поршень шприца.
   4. Luer блокировки 26G х 5/8 дюйма стерильной иглы к шприцу и держать подготовленные шприцы плашмя на льду до инъекции.
4. Подкожная инъекция в мышь
   1. Обезболить мышей с 5% изофлюран / кислородной смеси со скоростью потока 1 л / мин с помощью изофлюран испарителя. Обеспечить надлежащее сеяние животных (например, безответственность на щипать щипец). Поддерживайте анестезию через непрерывное администрирование 1,5% изофлюран/кислород, поставляемый через носовой конус.
   2. Поместите мышей на живот, подвергая задней области, где прививки будет происходить и дезинфицировать область инъекций с 70% этанола.
   3. Аккуратно свернуть подготовленный шприц, чтобы повторно использовать любые урегулированные клетки. Флик пузыри иглы конце шприца и изгнать небольшой объем клеточной подвески для обеспечения удаления всех пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Две инъекции могут быть выполнены для каждой мыши - на левой и правой стороне мыши назад.
   4. Pinch и создать "палатка-как" структура с помощью большого пальца и указательного пальца и вставить иглу подкожно прямо под кожей. Убедитесь, что игла только глубокой кожи, выпустив ущипнул кожи для предотвращения инъекций в мышечную ткань.
   5. Держа иглу под углом 45 градусов, тщательно ввишайте 200 мкл клеточной подвески, чтобы создать небольшую сферическую массу(рисунок 1С).
   6. Запись веса мыши с шкалой, ухо теги мыши, и вернуться в клетку.
   7. Мониторинг мышей после сеяния, чтобы убедиться, что они возвращаются к нормальной деятельности.
5. Мониторинг роста поражений
   1. Используя калипер, измерьте длину и ширину каждой вилки(рисунок 1D).
   2. Замеры документов через день вплоть до сбора поражений.

5. Сбор и обработка тканей

1. Euthanize мышей 9 дней после имплантации в камере CO_{2 и} проверить жизненно важные признаки, чтобы подтвердить смерть. Выполните вывих шейки матки на мышах в качестве вторичного метода усыпляния мыши.
2. Урожай ксенотрансплантата поражения / штепсельной вилки с фланга мыши путем вскрытия с помощью хирургических типсов и ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы предотвратить разрыв заполненных кровью сосудов в штепсельной вилке, важно, чтобы избежать прикосновения к вилке поражения с инструментами вскрытия и оставить чрезмерно окружающие ткани, такие как кожа прилагается к вилке.
3. Погрузите повторное поражение в PBS для мытья.
4. Настройка камеры сцены с камерой. Выравнивание штепсельной вилки на разделольную доску с линейкой. Возьмите изображение всех пробок для записи валовой васкулярности поражений (Рисунок 1E).
5. Исправить пробки, погружаясь в 10% формалин ночь на RT.
6. Вымойте пробки в PBS на следующий день и переместить их в 70% этанола.
7. Процесс поражения пробки для встраивания парафина (патологическое ядро).

6. Раздел поражения

1. Используйте микротом, чтобы вырезать 5 мкм разделов из собранных поражений мурина на положительно заряженных слайдов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующего анализа, разделы в центре штепсельной вилки (около 50'u201270 мкм в ткани) имеют важное значение.
2. Растопить парафин при 60 градусах Цельсия за 1 ч до окрашивания.
3. Де-парафинизировать и повторно гидратировать ткани последовательно под капотом потока химического дыма. Таким образом, инкубировать слайд в ксилен в течение 10 мин, 100% этанола (EtOH) в течение 5 мин, 90% EtOH в течение 3 мин, и 80% EtOH в течение 3 мин.
4. Промыть горку в дейонизированной воде в течение 5 минут.

7. Гематоксилин и эозин (Н И Е)

1. Инкубационые секции в гематоксилине в течение 2 мин.
2. Поместите слайды в окрашивание банку и промыть в раковине устойчивый поток водопроводной воды, пока вода не будет ясной.
3. Де-гидрат слайды путем инкубации тканей последовательно в 70% EtOH в течение 1 мин, 80% EtOH в течение 1 мин, 90% EtOH в течение 1 мин, 100% EtOH в течение 1 мин, и свежие 100% EtOH в течение 1 мин.
4. Пятна разделов в Eosin Y для 30 с.
5. Промыть свежим 100% EtOH, пока решение не будет ясным.
6. Инкубационный слайд в ксиленах в течение 2 мин. Пусть слайды сухие в течение 5'u201210 мин под капотом дыма.
7. Обойтись капли постоянных, не-aqueous монтажа среды над ксенотрансплантами разделов и место coverslip на вершине.
8. Разрешить слайды высохнуть на ночь перед изображением.

8. Иммуногистохимия

1. Подготовка антигена поиска буфера (Tris-EDTA) путем взвешивания 0,6 г Tris-базы и 1 мл 0,5 М EDTA до 500 мл деионизированной воды. Отрегулируйте рН до 9.0 с помощью 1 M HCl. Добавьте 250 МКЛ Tween-20.
2. Инкубировать де-парафинизированные слайды тканей (как получено в шаге 6.2'u20126.3) в стакане с буфером поиска антигена, помешивая на нагревательном блоке, в течение 20 минут при 95 градусов по Цельсию.
3. Снимите стакан с нагревательного блока, дайте раствору остыть до 35 градусов по Цельсию, затем промойте в PBS в течение 3 минут.
4. Блок тканей разделов в 5% нормальной сыворотки лошади в PBS в течение 30 минут на RT.
5. Подготовка биотинилированных Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) рабочий раствор путем разбавления 20 мкг / мл биотинилированных UEA-I в 5% нормальной сыворотки лошади в PBS.
6. Pipet 50'u2012100 ЗЛ рабочего решения UEA-I на секцию и инкубировать в течение 1 ч на RT в увлажняющей камере.
7. Вымойте слайды два раза в PBS в течение 3 минут.
8. Утолить слайд разделы в 3% перекиси водорода в течение 5 мин на RT.
9. Вымойте слайды два раза в PBS в течение 3 минут.
10. Приготовьте 5 мкг/мл стрептавидина хрена пероксидаса, конъюгированных в 5% нормальной конной сыворотки в PBS.
11. Pipet 50'u2012100 L на каждой ткани слайд и инкубировать в течение 1 ч на RT в увлажняющей камере.
12. Вымойте слайды два раза в PBS в течение 3 минут.
13. Приготовьте решение 3,3'Diaminobenzidine (DAB) в соответствии с инструкциями производителя и добавьте 50-2012100 йл на секцию.
14. Инкубационые секции в течение 10-201215 мин, проверка и мониторинг развития пятен каждые 2'u20125 мин.
15. Вымойте слайды три раза в PBS в течение 3 минут.
16. Добавить каплю гематоксилина и инкубировать в течение 3 мин.
17. Поместите слайды в окрашивание банку и промыть в раковине устойчивый поток водопроводной воды, пока вода не будет ясной.
18. Последовательно инкубировать слайд в 80% EtOH в течение 1 мин, 90% EtOH в течение 1 мин, 100% EtOH в течение 1 мин, и ксилена в течение 2 мин.
19. Пусть слайды сухие в течение 5'u201210 мин под капотом дыма.
20. Обойтись капли постоянных, не-aqueous монтажа среды над ксенотрансплантами разделов и место coverslip на вершине.
21. Разрешить слайды высохнуть на ночь перед изображением.

9. Анализ сосудистых каналов, полученных человеком

ПРИМЕЧАНИЕ: Васкулярность поражений ВМ количественно измеряется путем измерения сосудистой области и плотности сосудов. Только UEA-I положительные, полученные человеком сосудистые каналы рассматриваются для количественной оценки.

1. Сделай от четырех до пяти изображений на секцию поражения с ярким полевым микроскопом при увеличении в 20 раз (поля высокой мощности (HPF). Возьмите HPF изображения в X-самолет шаблон в разделе поражения, чтобы избежать перекрытия(рисунок 1F-H). Включите планку масштаба на сделанных снимках.
2. Откройте изображения HPF в изображении J Open(Файл Калибруйте пиксели бара масштаба следующим образом. Используйте инструмент прямой линии и перейдите планку масштаба. Чтобы преобразовать измеренные пиксели в мм, Set scaleнажмите на Analyze
3. Нажмите на анализ и установите измерения и выберите область и добавьте к наложению.
4. Измерьте общую площадь поля в HPF с помощью анализа. Сохраните это измерение для количественной оценки в шаге 9.8.
5. Используя инструмент для выбора от руки, вручную наметите UEA-I^{и сосудистые} каналы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сосудистый канал определяется как любая область,⁺ которая выровнена с UEA-I - EC, которые могут содержать клетки крови.
6. Нажмите на анализ и меру количественной оценки изложенной области UEA-I и сосудистой области^{(мм 2}/ HPF).⁺
7. Повторите это измерение для всех пяти HPF, принятых в пределах одной вилки.
8. Средняя общая площадь сосудов всех пяти HPF. Полученная сосудистая область на HPF впоследствии делится на область поля HPF^{(в мм 2}, шаг 9.5) и выражается в процентах (%).
9. Для количественной оценки плотности сосудов подсчитайте количество принятых UEA-I⁺ и сосудистых каналов каждого взятого HPF. Плотность сосудов – это среднее количество⁺ сосудистых каналов UEA-I, подсчитанных в области HPF (сосуды/мм^2).

Результаты

Этот протокол описывает процесс генерации мурин ксенотрансплантата модели VM на основе подкожной инъекции пациента полученных EC в спину иммунодефицитных обнаженных мышей. Эндотелиальные клеточные колонии могут быть собраны в течение 4 недель после первоначальной изоляции клеток от т...

Обсуждение

Здесь мы описываем метод создания ксенотрансплантатной модели VM, полученной пациентом. Эта модель murine представляет отличную систему, которая позволяет исследователям получить более глубокое понимание расширения патологического люмена и будет играть важную роль в разработке более э?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males	Envigo	069(nu)/070(nu/+)	Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)	Vector Laboratories	B-1065	Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM)	Thermo Fisher	974106	Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA)	BSA	A7906-50MG	Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O)	Sigma	C7902-500G	Cell culture
Caliper	Electron Microscopy Sciences	50996491	Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads)	Life Technologies	11155D	EC separation
Cell strainer (100 μM)	Greiner	542000	Cell culture
Collagenase A	Roche	10103578001	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL)	Greiner	07 000 241	Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL)	Greiner	07 000 239	Cell culture
Coplin staining jar	Ted Pella	21029	Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm)	Fisher Scientific	12545E	Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)	Vector Laboratories	SK-4105	Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-027-CV	Cell culture
DynaMag-2	Life Technologies	12321D	EC separation
Ear punch	VWR	10806-286	Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0)	Life Technologies	15575-020	Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements)	Lonza	CC-3162	Cell culture
Eosin Y (alcohol-based)	Thermo Scientific	71211	Histological anlaysis
Ethanol	Decon Labs	2716	Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone	GE Healthcare	SH30910.03	Cell culture
Filter tip 1,250 μL	MidSci	AV1250-H	Multiple steps
Filter tip 20 μL	VWR	10017-064	Multiple steps
Filter tip 200 μL	VWR	10017-068	Multiple steps
Formalin buffered solution (10%)	Sigma	F04586	Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable)	SKC FILMS	DHCN015	Cell culture
Hematoxylin	Vector Hematoxylin	H-3401	Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL)	Sigma	FC010-10MG	Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w)	Sigma	H1009	Histological anlaysis
ImageJ Software			Analysis
Isoflurane, USP	Akorn Animal Health	59399-106-01	Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)	Sigma	M1880-500G	Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)	Corning	356237	Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL)	VWR	87003-294	EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm)	Fisher Scientific	1255015-CS	Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles	Becton Dickinson (BD)	BD305115	Subcutaneous injection
Normal horse serum	Vector Laboratories	S-2000	Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X)	Corning	30-009-CI	Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount)	Vector Laboratories	H-5000	Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain	Thomas Scientific	3431F55	EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3994	Cell culture
Scale	VWR	65500-202	Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml)	VWR	89130-898	Cell culture
Serological pipettes (5ml)	VWR	89130-896	Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3)	Sigma	223530	Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC	Vector Laboratories	SA-5004	Cell culture
Syringe (60ml)	BD Biosciences	309653	Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM)	Corning	431219	Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock)	Becton Dickinson (BD)	BD-309628	Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm)	Greiner	664160	Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm)	Greiner	639160	Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm	Eppendorf	30701119	Cell culture
Tris-base (Trizma base)	Sigma	T6066	Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %)	Life Technologies	15250061	Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA)	Corning	25-052-Cl	Cell culture
Tween-20	Biorad	170-6531	Histological anlaysis
Wheaton bottle	VWR	16159-798	Cell culture
Xylenes	Fisher Scientific	X3P-1GAL	Histological anlaysis