網膜神経節細胞軸索を標的とする軸索再生と介入を評価するためのラットの鞘温存視神経切断

要約

このプロトコルはラットの視神経鞘を保存する視神経切断を記述します。視神経へのマイクロインジェクションによる静水圧により、完全な切断が生成され、切断された視神経端の縫合レス再選術と、切断モデルにおける軸索コンパートメントの直接ターゲティングが可能になります。

要約

網膜神経節細胞(RGC)の軸索は視神経頭に収束し、網膜から脳に視覚情報を伝達します。緑内障、外傷、虚血性視神経障害などの病状は、RGC軸索を損傷し、視覚刺激の伝達を妨害し、視力喪失を引き起こします。RGC軸索損傷をシミュレートする動物モデルには、視神経の挫傷と切断のパラダイムが含まれます。これらのモデルにはそれぞれ固有の長所と短所があります。視神経の挫傷は、一般に切断よりも重症度が低く、病変部位全体の軸索再生をアッセイするために使用できます。しかし、クラッシュフォースと持続時間の違いは組織の応答に影響を与える可能性があり、その結果、再現性と病変の完全性にばらつきが生じます。視神経離断術では、すべての軸索を完全に損傷する重度で再現可能な損傷があります。しかし、視神経を横断すると、視神経鞘が破られることで血液脳関門が劇的に変化し、視神経が末梢環境にさらされます。さらに、切断部位を超えた再生は、切断された神経端を再認識しなければ評価できません。さらに、明確な変性変化と細胞経路は、クラッシュまたは切断損傷のいずれかによって活性化されます。

ここで説明する方法は、視神経クラッシュモデルと離失モデルの両方の利点を取り入れながら、欠点を軽減します。マイクロインジェクションによって視神経に供給される静水圧は、視神経鞘の完全性を維持しながら視神経を完全に横断します。切断された視神経末端は、軸索再生アッセイを可能にするために再付与されます。この方法の潜在的な制限は、ばらつきの潜在的な原因である完全な切断を視覚化できないことです。ただし、視神経の可視部分が切断されたことを視覚的に確認することは、90〜95%の成功で完全な視神経切断を示しています。この方法は、切断モデルで軸索再生促進戦略を評価したり、軸索コンパートメントを標的とする介入を調査したりするために適用できます。

概要

軸索の損傷と変性は、外傷後の網膜神経節細胞(RGC)や緑内障などの神経変性疾患で発生します^1,2。RGCの喪失と網膜突起の混乱は、永久的な視力喪失をもたらします³。変性過程に関与する分子経路を理解し、軸索およびRGCの損失を軽減するための戦略を開発するため、またはRGC軸索を再生するための戦略を開発するために、実験動物モデルを使用して、視神経クラッシュモデルや視神経切断モデルなどの視神経損傷をシミュレートしています。実験モデルを選択する際には、各アプローチの長所と短所、および損傷によって活性化される分子経路を考慮する必要があります⁴。

ここで説明する方法を開発する理論的根拠は、視神経クラッシュ⁵ モデルと切断⁶ モデルの利点を活用しながら、欠点を軽減することです。この方法の目的は、すべての軸索が疑いなく完全に横断され、末梢免疫系への曝露が最小限に抑えられ、視神経の横断された端がRGC再生の評価を可能にするために容易に再割り当てされる再現可能な視神経損傷を生成することでした。さらに、この方法は、損傷したRGCの軸索部分への区画化されたアクセスを可能にし、軸索特異的な介入(神経栄養因子、細胞移植など)を眼窩後視神経に局所的に送達するために開発されました。

この手法には、他の方法に比べて複数の利点があります。視神経クラッシュと比較して、この方法は視神経を完全かつ確実に横断します。これにより、望ましくない軸索スペアリング⁷の潜在的な問題に対処します。さらに、記載された方法は、挫傷の場合のようにオペレータによって加えられる力の量および持続時間に依存しない重度の軸索損傷を引き起こし、それにより変動性⁸を減少させる。視神経を横断する確立された方法とは対照的に、このプロトコルで詳述されているアプローチは、視神経鞘の完全性を維持します。視神経鞘を保存する利点は、視神経が末梢免疫系にさらされるのを防ぐことです。さらに、視神経鞘が交差した視神経に加えられる機械的な力は、困難な顕微手術9,10,11を必要とせずに切断された神経端を再調整する。最後に、視神経鞘をそのままにして、この方法では、視神経断端間に物理的な空間を作り出し、幹細胞、神経栄養因子、またはポリマーを病変のあるRGC軸索に直接導入できます。

視神経クラッシュは、視神経再生戦略を評価して治療の有効性を判断するゴールドスタンダードモデルです。げっ歯類の視神経のサイズは、可能な操作、特に神経の切断と再適応を制限します。しかし、脊髄損傷と脊髄再生の分野では、完全切断が軸索再生と温存された軸索¹²を区別するための理想的なモデルであるというコンセンサスがあります。ここで説明する方法は、視神経切断モデルにおける再生戦略を評価するための技術的な障壁を軽減します。そのため、このモデルは、視神経切断を伴う視神経粉砕パラダイムで特定された有望な戦略を検証するために使用できます。さらに、このモデルは軸索コンパートメントを直接標的としているため、損傷した成人のRGC軸索に対する介入と、軸索の変性および再生プロセスに関与するメカニズムの研究が可能になります。

この研究で説明した視神経切断のモデルは、視神経鞘を維持しながら視神経を完全に横断します。この新しいアプローチは、視神経終末を再認識するという技術的に困難なプロセスを必要とせずに、切断モデルで軸索再生を評価することを目的とした実験に適しています。この技術の側面は、視神経クラッシュを実行するのと似ています。したがって、このアプローチは、視神経クラッシュの経験を持つオペレーターが行うことができます。外科的アプローチは、特別に設計された器具を必要とせず、すぐに入手できる手術器具とマイクロインジェクションシステムを使用して完了できるため、アクセスしやすく経済的です。

プロトコル

動物を含む手順は、退役軍人省サンディエゴヘルスケアシステムの施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。手術器具と溶液は、術後の感染や合併症を制限するために、手術前に滅菌されました。

1.外科技術

1. 無菌技術を使用し、施設固有の動物使用プロトコルに従って実験を実施します。
2. 生体組織に接触する器具や材料を滅菌して、感染を防ぎ、動物福祉への悪影響を避け、研究への潜在的な悪影響を最小限に抑えます。手術器具を水と洗剤または酵素製品で完全に洗浄して異物を取り除き、蒸気滅菌またはフラッシュ滅菌で滅菌します。
3. 液体を組織培養フード内の滅菌容器に分注します。マイクロリットルシリンジを70%エタノールで洗い流し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすいで滅菌します。

2.麻酔

1. イソフルラン気化器システムを使用してラットに麻酔をかけます。医療グレードの酸素を使用して、1 L / minの速度で4.5%の濃度でイソフルランを気化させ、付属の麻酔ボックスに入れます。呼吸が遅くなり、動物が鎮静されるまで、動物を麻酔ボックスに入れます。
   注:オペレーターが鎮静剤を投与していない動物に注射可能な麻酔薬を投与することに快適で精通している場合、ガス麻酔薬による麻酔を使用するこの最初のステップは必要ありません。
2. ケタミン(50 mg / kg)、キシラジン(2.6 mg / kg)、アセプロマジン(0.5 mg / kg)で構成される十分な量の麻酔カクテルを30 Gのツベルクリン注射器に引き出します。.鎮静剤を投与した動物を麻酔ボックスから取り出します。麻酔の注射を腹腔内に投与して、手順全体で一貫した鎮静深度を達成し、動物をケージに戻します。
3. つま先をつまんでも反応を呼び起こせない場合は、手順を開始します。動物の呼吸の深さと速度を評価し、処置中は5分ごとにつま先をつまんで、痛みがないことを確認します。
4. 手術が完了したら、動物を脳定位固定装置フレームから取り外します。生理食塩水(3 mL)、アンピシリン(0.15〜0.2 mg / kg)、およびバナミン(2.5〜5 mg / kg)の皮下注射を投与して、鎮痛と水分のサポートを提供します。.体温を維持するために、動物を加熱されたインキュベーターに移します。

3. 外科的アプローチ

1. ラット(7〜8週齢、Fischer 344系統)を頭部定位固定装置フレームに入れ、加熱パッドの上に置きます。.ラットの頭を外科医の左側に向けて定位固定フレームを配置し、左眼窩を手術視野の中央に配置します。
2. 左目にプロパラカインを一滴垂らし、まぶたと目に5%ポビドンヨードを塗って目をきれいにします。両眼の角膜に眼科用軟膏を塗り、角膜の水分を維持し、白内障の形成を防ぎます。
3. 4-0ポリグラクチン縫合糸を上眼瞼の表皮から眼瞼縁の中央面に通し、この縫合糸を後のステップで一時的な足根出血に使用します。縫合糸を使用してまぶたを曲げ、上円蓋を露出させます。
4. ポリグラクチン縫合糸を脳定位固定装置フレームにテープで固定し、一定の牽引と露出を加えます。過度の牽引は、眼窩後の内容物の露出を制限する可能性があるため、避けてください。
5. Colibri鉗子を使用して、上結膜を持ち上げ、Vannasハサミで輪部に沿って結膜を切開します。上リンバスに沿って4時のペリトミーを作ります。
6. 上リンバスに沿ってループ状のポリプロピレン縫合糸を配置し、自由端をグローブの下にして、グローブにわずかに劣った牽引力を加えます。腹膜切開後の上輪部に沿った残留組織は、縫合糸を強膜または輪部に通すことなく、縫合糸ループに牽引力を提供するのに十分です。
   1. ループの端をブルドッグクランプで固定し、クランプが空中で自由にぶら下がるようにします。クランプの重量は、地球に劣った牽引力を加え、後眼窩空間をより多く露出させます。
7. Vannasのはさみで、球体の後面と上直筋の下をたどる強膜に沿って鈍く解剖します。Vannasハサミで筋腱を切断して眼窩後腔にアクセスすることにより、上直筋を球体から切断します。

4.視神経へのアクセス

1. Dumont #5/45 鉗子で後球の時間的側面に沿って鈍く解剖し、上側渦脈を特定します。さらに鼻を上側渦静脈に解剖して、視神経の周りの眼窩筋円錐を露出させ、視神経を早期に損傷しないようにします。渦状静脈を傷つけると重大な出血を引き起こす可能性があるため、避けてください。出血が発生した場合は、出血が止まるまでコットンチップアプリケーターを塗布できます。
2. Dumont #5/45鉗子を使用して、先端を眼窩筋円錐の側頭面に慎重に挿入し、筋線維のコースと平行に鉗子を開いて視神経を露出させます。鉗子を使用して、視神経を覆っている筋線維を横方向に変位させ、神経を完全に露出させます。残りの筋線維が引っ張られたガラス毛細血管ピペットが視神経に簡単に突き刺さるのを防ぐため、視神経鞘のみが視神経を覆っていることを確認してください。
3. 神経の両側側面に沿って2つのDumont#5/45鉗子を配置し、鉗子を開くことにより、神経の露出を維持します。曝露量は、視神経を球の後方1.5〜2.0 mmで押しつぶし、引っ張ったガラスキャピラリーピペットを背側から視神経に挿入できるようにする必要があります。

5. 視神経を視鞘の内側に横断する

1. デュモン#5/45鉗子を使用して、先端を視神経の両側、地球から少なくとも1.5〜2.0mm後方に配置します。鉗子の先端が神経の直径にまたがっていることを確認してください。鉗子を5秒間完全に閉じて視神経を粉砕し、粉砕部位の位置をメモします。
2. マイクロリットルのシリンジで、ガラス製のプルキャピラリーピペットに1〜2μLのPBSを入れ、ピペットをピペットホルダーに取り付けます。ピペットホルダーをマイクロマニピュレーターに取り付け、マイクロマニピュレーターを定位固定装置フレームに取り付けます。
3. マイクロインジェクションシステムを調整して、ボタンを押すたびに20 psiの圧力で4 msの持続時間の単一パルスを送達します。ピペットを手術野に位置決めします。
4. 手術用スコープの下で、#55鉗子のペアを使用して、ピペットの先端を壊し、斜角を開先にします。これは、少量で提供できるサイズ(~20〜30μmの直径)ですが、視神経鞘を貫通するのに十分な剛性を提供するのに十分な大きさです。ピペットチップの開存性を確認するために、1回のパルスを与え、ピペットチップの液体を観察します。
5. ピペットの先端の位置を、視神経の中心にあり、視神経シースと接触している視神経クラッシュの部位のすぐ上に調整します。マイクロマニピュレーター上のピペットの垂直位置に注意して、後で200μmの深さを決定します。
6. ピペットが視神経に入るまで、手術用スコープの下で先端を観察しながらピペットを下げます。ピペットの先端が曲がり、視神経鞘を貫通する剛性が不足している場合は、ピペットを引っ込めて#55鉗子のペアを使用してピペットの先端の長さを短くし、直径を大きくします。ピペットの先端を調整したら、ピペットで視神経シースへの貫通を再試行してください。
7. ピペットの先端で視神経に入ったら、必要に応じてピペットを引っ込めます。定位固定装置マイクロマニピュレーターによって示されるピペットチップの位置は、ステップ5.5で示した初期位置から視神経の表面から200μm下にある必要があります。
8. 手術用スコープで視神経を観察しながら、マイクロインジェクションシステムで静水圧のパルスを印加します。パルスが印加されるとき、視神経の切断を確認するために、視神経の遠位端と近位端との間の線形分離に注意する必要があります。
   注:250〜500 nLの注入量は、一般に視神経を横断するために必要な力を提供するのに十分です。1 μL を超える注入が必要な場合は、注入部位の再配置が必要であることを示している可能性があります。無傷の実質に大量の注入をしても、この方法が視神経を完全に横断することを考えると、追加のRGC損傷を引き起こさない可能性がありますが、視神経の束に沿って追跡する可能性が高くなります。十分な量の液体を注入したにもかかわらず視神経の直線的な切断を観察できなかった場合は、圧搾部位でのピペットの位置が間違っていて、再配置が必要であることを示している可能性があります。注入圧力を50%増加させる必要もあります。

6. クロージングとリカバリー

1. ピペットを引っ込め、引っ込めるDumont#5/45鉗子を取り外します。ブルドッグclを取り外して目を中立位置に戻しますamp とループ状のポリプロピレン縫合糸をグローブから。
2. 結膜を角膜辺縁部に再配置し、組織の適切な配置と治癒を可能にするために反転した結膜を放出するようにします。眼科用局所抗生物質軟膏を目に塗ります。.
3. まぶたの4-0ポリグラクチン縫合糸からテープをはがし、縫合糸を所定の位置に保持して一時的な足根出血に使用します。縫合糸を下眼瞼のまぶた縁に通し、下皮下領域を通って、表皮から出ます。目を閉じるのに十分な圧力で縫合糸を結びます。
4. 術後鎮痛薬は、施設のプロトコルと動物管理局のガイドラインに従って投与します。手術後に回復するために、動物を加熱されたケージに独立して収容します。偶発的な誤嚥を防ぐために、リカバリーケージに寝具を置かないでください。

結果

視神経の切断は、通常、損傷後14日以内に損傷したRGCの80〜90%のアポトーシス損失をもたらします。記載されている技術は、視神経鞘の完全性を維持しながら視神経を横断します(図1)。RGC損失の程度は、従来の視神経離断モデルや視神経クラッシュモデルに匹敵し、ここで説明する方法では切断後に切断された神経端が楽に適用できるという利点があります(図2)。この方法で切断された視神経端を再接続すると、軸索が成長する可能性のある基質を提供し、切断された神経端を再接続するための顕微手術操作を必要とせずに、切断モデルでのRGC軸索再生の評価が可能になります(図3)。コレラ毒素Bサブユニット(CTB)を含むRGC軸索の順行性トレースは、CTB陽性軸索が視神経切断をシース温存した後に完全に切断されることを示しています(図4)。視神経を横断しながら視神経鞘を保存すると、神経栄養因子や細胞などの調査材料を損傷したRGC軸索に送達し、所定の位置に維持できる密閉空間も作成されます(図5)。トレーニングの初期段階では、全離骨の成功率は 60 〜 70% と予想されています。経験を積むと、全切断の成功率は約90〜95%です。

図1:視神経鞘を温存しながら視神経を横断する。 (A)切断前に無傷の視神経が露出したことを示す手術野の写真。(B)離反後の視神経の写真。細かいガラスピペットで視神経鞘を切断部位に突き刺し、視神経末端の間の空間に細胞懸濁液(濁液)を送達しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:視神経鞘温存視神経離断術後の網膜神経節細胞の喪失。 (A)無傷の視神経、(B)視神経離断を保持する視神経鞘、(C)従来の視神経離断、または(D)14日前に視神経挫傷を有する眼から、代表的な全網膜フラットマウントをγシヌクレイン(SNCG)の免疫標識しました。画像は、10倍対物レンズを使用して蛍光顕微鏡から取得し、シェーディングを補正し、ステッチして単一の画像を生成しました。網膜全体の網膜神経節細胞(RGC)体の喪失は、病変のある眼で明らかでした。挿入図は、網膜の高倍率画像を示し、視神経損傷後のRGCの有意な喪失を示しています。(E)RGC生存率の定量化は、対照の無傷の視神経と比較して、視神経損傷後の有意なRGC損失を示しています。*p< 0.05 無傷と比較。事後テューキー検定による一元配置ANOVA。n = グループごとに3匹の動物。エラーバーは、SD.SP-ONT、シース保存視神経切断を表します。ONT、視神経切断;ONC、視神経クラッシュ。スケールバー=1,000μm。インセットのスケールバー= 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:視神経損傷後の視神経の切片。 (A-C)視神経鞘温存切断、(D-F)従来の視神経切断、または(G-I)視神経粉砕の14日後の視神経を通る縦断面の代表的な画像。(A、D、G)グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の免疫標識は病変の範囲を描写し、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)による(B,E,H)DNA標識は、視神経の長さに沿って病変部位内で連続した細胞性を示します。(C,F,I)GFAP陽性神経組織と病変部位の細胞性の局在を示す結合画像。スケールバー = 200 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:視神経鞘に続く視神経の切片で、視神経離断を保存。視神経鞘温存断絶の 14 日後に視神経を通る縦切片の代表的な画像で、硝子体内コレラ毒素 B サブユニット (CTB) 注射による前向性軸索追跡による切断。(A)球体(左)から脳(右)に向かって伸びるCTB標識RGC軸索の完全な病変が観察できる。(B)グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の免疫標識は、視神経の全直径が関与する広範な病変を描写します。(C)4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)によるDNA標識は、病変部位内の細胞性を示しています。(D)CTB標識軸索、GFAP陽性神経組織、および病変部位の細胞性の局在を示す結合画像。スケールバー = 200 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:細胞移植を受けた交差した視神経の縦断面。 視神経鞘の14日後に視神経を通した縦切片の代表的な画像で、蛍光タンパク質tdTomatoを発現する神経幹細胞(NSC)の切断と移植を保存しています。(A)グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の免疫標識は、横断された視神経末端の完全な分離を示しました。(B)tdTomatoを発現する神経幹細胞は、記載の技術によって形成された空間内に封じ込められ、移植後も生存し続けた。(C)移植されたNSCは、切断された視神経の両側の切断端に直接適用されました。スケールバー、200 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

視神経切断モデルを説明する外科的処置は、以前に発表されています⁶。ただし、これらのプロトコルで詳述されている技術には、視神経を横断するために髄膜鞘を切開することが含まれます。さらに、以前の切断モデルでRGC軸索再生を評価するためには、切断された視神経端または末梢神経移植片を近位視神経断端^10,13に留置するための挑戦的な顕微手術操作が必要でした。ここで説明するプロトコルは、視神経を横断しながら視神経鞘の破壊を最小限に抑え、技術的に困難な顕微鏡手術を必要とせずに、切断モデルでのRGC軸索再生の評価を可能にします。

このプロトコルでは、いくつかの手順が重要です。眼動脈と視神経乳頭に供給する血管系を損傷しないように注意する必要があります。.したがって、ステップ5.1は、地球の少なくとも1.5〜2.0mm後方で完了する必要があります。眼動脈の損傷が発生し、網膜血液供給を混乱させる場合、眼はさらなる実験から除外されるべきです。ステップ5.4-5.6では、視神経鞘の完全性を維持し、ガラスピペットが視神経に入る開口部のサイズを最小限に抑えることが重要です。これにより、ピペットの先端の周りに密閉性が形成され、体液の逆流が減少し、視神経を横断するのに十分な静水圧を発生させることができます。ガラスピペットの先端を面取りすると、巻き添え被害を引き起こすことなく、ピペットが視神経に入りやすくなります。

このメソッドのアクセシビリティを向上させるために、オペレーターが変更できる可能性があります。記載されている手順には、顔面神経と三叉神経の保存を伴う眼窩組織の最小限の解剖と除去が含まれます。これにより、罹患率と出血のリスクが軽減されますが、眼窩脂肪や涙腺などの組織は、重要な構造の視覚化を制限する可能性があります。特に高齢の動物では、手術野を塞いでいる組織を慎重に除去することが、視覚化を強化するために必要になる場合があります。視神経へのアクセスを改善するために、横方向のアプローチも使用できます。ただし、側方解剖は、三叉神経を含む追加の構造に損傷を与えるリスクがあり、より関与しており、注射用の器具を指示するための独自の課題を提示する可能性があります。

この方法の考えられる制限は、視神経を直接操作し、離反全体を完全に視覚化できないことです。そのため、不完全な切断が発生する可能性があります。しかし、ステップ5.8で神経末端が分離していることを視覚的に確認することは、切断が成功し、完全に切断されたことの信頼できる指標であることが観察されました。神経端が分離しない場合は、注射ピペットの位置を変えるか、注射の圧力を50%上げると、神経を完全に横断するのに十分な力が得られるはずです。.

既存の方法に関して、このアプローチは視神経鞘の完全性を維持します。視神経鞘の完全性を維持するために、切断された視神経の末端は眼窩環境や末梢免疫系にさらされないため、RGC応答に影響を与える可能性のある免疫因子への曝露が制限されます。さらに、視神経を横断しながら視神経鞘の完全性を維持することにより、視神経末端と視神経鞘に囲まれた密閉された物理的空間が作られます。神経栄養因子、細胞、またはポリマーの損傷したRGCの軸索コンパートメントへの局所的な送達は、新たに形成された空間に注入することによって達成できます。¹⁴ あるいは、RGC 軸索再生は、切断された視神経末端を吻合できるようにすることで、切断モデルで評価できます 挑戦的なマイクロサージェクリー技術を必要とせずに。

この方法の応用には、軸索変性の原因となる経路を特定し、切断損傷後の軸索損失を防ぐための軸索特異的介入による損傷したRGC軸索コンパートメントの評価が含まれます。さらに、この方法により、技術的に困難な視神経吻合手順の必要性を排除することにより、切断モデルでのRGC軸索再生の研究がより広範な研究コミュニティにアクセスできるようになります。RGC 軸索再生の促進を目的とした介入は、この重傷モデルで評価でき、温存された軸索を心配することなく、一貫性のある再現性のある結果を提供できます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Polyglactin suture	Ethicon	J315H
9-0 Polypropylene suture	Ethicon	1754G
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/kg Stock Concentration: 10 mg/mL Final Concentration: 0.25 mg/mL
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/mL
Anesthesia System	VetEquip	901806
Animal incubator	Precision Incubators	Chick Chalet II
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/mL Final Concentration: 0.5 mg/mL
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150F-4
Colibri forceps	Katena	K5-1500
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35
Heat therapy pump	Kent Scientific	HTP-1500
Isoflurane	Covetrus	29404
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz	RS-7440
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 25 mg/mL
Microinjection system (Picospritzer II)	General Valve, Inc
Microliter syringe 5 µL	Hamilton	88000
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-77 Brown-Flaming
Neomycin/Polymyxin B sulfates/Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	Bausch + Lomb
PBS	Millipore	BSS-1005-B
Povidone-iodine	Healthpets	BET16OZ
Proparacaine hydrochloride 0.5%	Bausch + Lomb
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 mL/injection
Stereotaxic Frame	Kopf
Surgical Microscope	Zeiss
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09
Xylazine	Lloyd	0410	2.5-8 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 5.8 mg/mL