Schleusenerhaltende Durchtrennung des Sehnervs bei Ratten zur Beurteilung der Axonregeneration und Interventionen, die auf das Axon der retinalen Ganglienzellen abzielen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Durchtrennung des Sehnervs, bei der die Sehnervenscheide bei Ratten erhalten bleibt. Hydrostatischer Druck durch Mikroinjektionen in den Sehnerv erzeugt eine vollständige Durchtrennung, die eine nahtlose Reapposition der durchtrennten Sehnervenenden und eine direkte Ausrichtung des axonalen Kompartiments in einem Transsektionsmodell ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Axone der retinalen Ganglienzellen (RGC) laufen am Kopf des Sehnervs zusammen, um visuelle Informationen von der Netzhaut zum Gehirn zu übertragen. Pathologien wie Glaukom, Trauma und ischämische Optikusneuropathien verletzen RGC-Axone, stören die Übertragung visueller Reize und verursachen Sehverlust. Tiermodelle, die eine RGC-Axonverletzung simulieren, umfassen Paradigmen der Quetschung und Durchtrennung des Sehnervs. Jedes dieser Modelle hat inhärente Vor- und Nachteile. Eine Quetschung des Sehnervs ist im Allgemeinen weniger schwerwiegend als eine Durchtrennung und kann verwendet werden, um die Axonregeneration an der Läsionsstelle zu testen. Unterschiede in der Quetschkraft und -dauer können jedoch die Gewebereaktionen beeinflussen, was zu einer variablen Reproduzierbarkeit und Vollständigkeit der Läsion führt. Bei der Durchtrennung des Sehnervs kommt es zu einer schweren und reproduzierbaren Verletzung, die alle Axone vollständig läsiert. Die Durchtrennung des Sehnervs verändert jedoch die Blut-Hirn-Schranke dramatisch, indem die Sehnervenscheide verletzt wird und der Sehnerv der peripheren Umgebung ausgesetzt ist. Darüber hinaus kann die Regeneration über eine Durchtrennungsstelle hinaus nicht beurteilt werden, ohne dass die durchtrennten Nervenenden reapiert werden. Darüber hinaus werden bestimmte degenerative Veränderungen und zelluläre Signalwege entweder durch eine Quetsch- oder eine Durchtrennungsverletzung aktiviert.

Das hier beschriebene Verfahren berücksichtigt die Vorteile sowohl des Sehnervenquetschungs- als auch des Durchtrennungsmodells und mildert gleichzeitig die Nachteile. Der hydrostatische Druck, der durch Mikroinjektion in den Sehnerv abgegeben wird, durchtrennt den Sehnerv vollständig, während die Integrität der Sehnervenscheide erhalten bleibt. Die durchtrennten Enden des Sehnervs werden wieder angeordnet, um Axonregenerationsassays zu ermöglichen. Eine mögliche Einschränkung dieser Methode ist die Unfähigkeit, die vollständige Durchtrennung zu visualisieren, was eine potenzielle Quelle der Variabilität darstellt. Die visuelle Bestätigung, dass der sichtbare Teil des Sehnervs durchtrennt wurde, ist jedoch ein Hinweis auf eine vollständige Durchtrennung des Sehnervs mit einem Erfolg von 90-95%. Diese Methode könnte angewendet werden, um Strategien zur Förderung der Axonregeneration in einem Transsektionsmodell zu bewerten oder Interventionen zu untersuchen, die auf die axonalen Kompartimente abzielen.

Einleitung

Axonale Schädigung und Degeneration treten in retinalen Ganglienzellen (RGCs) nach einem Trauma oder bei neurodegenerativen Erkrankungen wie dem Glaukom^{auf 1,2}. Der Verlust von RGCs und die Störung der retinofugalen Projektionen führen zu einem dauerhaften Verlust des Sehvermögens³. Um die molekularen Signalwege zu verstehen, die für die degenerativen Prozesse verantwortlich sind, und um Strategien zur Milderung des Axon- und RGC-Verlusts oder zur Regeneration von RGC-Axonen zu entwickeln, wurden experimentelle Tiermodelle verwendet, um eine Schädigung des Sehnervs zu simulieren, einschließlich Modellen zur Quetschung des Sehnervs und zur Durchtrennung des Sehnervs. Bei der Auswahl eines experimentellen Modells müssen die Vor- und Nachteile jedes Ansatzes sowie die molekularen Signalwege, die durch die Verletzung aktiviert werden, berücksichtigt^{werden 4}.

Der Grundgedanke für die Entwicklung des hier beschriebenen Verfahrens besteht darin, die Vorteile der Modelle für Sehnervenquetschung⁵ und Transsektion⁶ zu nutzen und gleichzeitig die Nachteile zu mildern. Das Ziel dieser Methode war es, eine reproduzierbare Schädigung des Sehnervs zu erzeugen, bei der alle Axone fraglos und vollständig durchtrennt werden, die Exposition gegenüber dem peripheren Immunsystem minimiert wird und die durchtrennten Enden des Sehnervs leicht wieder angeordnet werden können, um die Bewertung der RGC-Regeneration zu ermöglichen. Darüber hinaus wurde die Methode entwickelt, um einen kompartimentierten Zugang zum axonalen Teil verletzter RGCs zu ermöglichen und axonspezifische Eingriffe (z.B. neurotrophe Faktoren, zelluläre Transplantate) lokal an den retroorbitalen Sehnerv zu verabreichen.

Es gibt mehrere Vorteile dieser Technik gegenüber alternativen Methoden. Im Vergleich zu einer Sehnervenquetschung wird bei dieser Methode der Sehnerv vollständig und zuverlässig durchtrennt; Dies befasst sich mit einem potenziellen Problem der unerwünschten Axonschonung⁷. Darüber hinaus verursacht das beschriebene Verfahren eine schwere axonale Verletzung, die nicht von der Menge und Dauer der vom Bediener ausgeübten Kraft abhängt, wie bei einer Quetschverletzung, wodurch die Variabilität^{reduziert wird 8}. Im Gegensatz zu etablierten Methoden zur Durchtrennung des Sehnervs erhält der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz die Integrität der Sehnervenscheide. Ein Vorteil der Erhaltung der Sehnervenscheide besteht darin, dass sie verhindert, dass der Sehnerv dem peripheren Immunsystem ausgesetzt wird. Darüber hinaus können die mechanischen Kräfte, die von der Sehnervenscheide auf den durchtrennten Sehnerv ausgeübt werden, die durchtrennten Nervenenden wieder anordnen, ohne dass schwierige mikrochirurgische Manipulationen erforderlich sind ^9,10,11. Schließlich erzeugt das Verfahren bei intakter Sehnervenscheide einen physikalischen Raum zwischen den Sehnervenstümpfen, in den Stammzellen, neurotrophe Faktoren oder Polymere direkt in läsionierte RGC-Axone eingebracht werden können.

Die Sehnervenquetschung ist das Goldstandardmodell, bei dem Regenerationsstrategien des Sehnervs bewertet werden, um die Wirksamkeit von Behandlungen zu bestimmen. Die Größe des Sehnervs des Nagetieres schränkt die möglichen Manipulationen ein, insbesondere die Durchtrennung und erneute Anpassung des Nervs. Auf dem Gebiet der Rückenmarksverletzung und -regeneration besteht jedoch Einigkeit darüber, dass eine vollständige Durchtrennung das ideale Modell ist, um die axonale Regeneration von der des verschonten Axons^{zu unterscheiden 12}. Die hier beschriebene Methode reduziert die technischen Barrieren zur Bewertung regenerativer Strategien in einem Sehnervendurchtrennungsmodell. Als solches könnte dieses Modell verwendet werden, um vielversprechende Strategien zu validieren, die in Optikus-Crush-Paradigmen mit einer Sehnervendurchtrennung identifiziert wurden. Da dieses Modell direkt auf das axonale Kompartiment abzielt, ermöglicht es außerdem die Untersuchung von Eingriffen an verletzten adulten RGC-Axonen und der Mechanismen, die für axonale degenerative und regenerative Prozesse verantwortlich sind.

Das in dieser Studie beschriebene Modell der Durchtrennung des Sehnervs durchtrennt den Sehnerv vollständig, während die Sehnervenscheide erhalten bleibt. Dieser neuartige Ansatz eignet sich für Experimente, die darauf abzielen, die Axonregeneration in einem Durchtrennungsmodell zu bewerten, ohne dass der technisch anspruchsvolle Prozess der Reapierung der Sehnervenenden erforderlich ist. Aspekte der Technik ähneln der Durchführung einer Sehnervenquetschung; Daher kann der Ansatz von Bedienern durchgeführt werden, die Erfahrung mit einer Sehnervenquetschung haben. Der chirurgische Ansatz erfordert keine speziell entwickelten Instrumente und kann mit leicht verfügbaren chirurgischen Instrumenten und einem Mikroinjektionssystem ergänzt werden, was ihn zugänglich und wirtschaftlich macht.

Protokoll

Eingriffe mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Veterans Affairs San Diego Healthcare System genehmigt. Chirurgische Instrumente und Lösungen wurden vor der Operation sterilisiert, um postoperative Infektionen und Komplikationen zu begrenzen.

1. Operationstechnik

1. Durchführung von Experimenten mit aseptischen Techniken und gemäß den institutsspezifischen Tierverwendungsprotokollen.
2. Sterilisieren Sie Instrumente und Materialien, die mit lebendem Gewebe in Kontakt kommen, um Infektionen zu verhindern, negative Auswirkungen auf den Tierschutz zu vermeiden und mögliche negative Einflüsse auf die Studie zu minimieren. Reinigen Sie chirurgische Instrumente gründlich mit Wasser und Reinigungsmitteln oder enzymatischen Produkten, um Fremdstoffe zu entfernen, und sterilisieren Sie sie durch Dampf- oder Blitzsterilisation.
3. Aliquotieren Sie Flüssigkeiten in sterilen Behältern in einer Gewebekulturhaube. Sterilisieren Sie die Mikroliterspritze, indem Sie sie mit 70% Ethanol spülen und mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) spülen.

2. Anästhesie

1. Betäuben Sie Ratten mit einem Isofluran-Verdampfersystem. Verdampfen Sie Isofluran in einer Konzentration von 4,5 % mit medizinischem Sauerstoff mit einer Geschwindigkeit von 1 l/min in eine beigefügte Anästhesiebox. Legen Sie das Tier in die Anästhesiebox, bis sich die Atmung verlangsamt und das Tier sediert ist.
   HINWEIS: Dieser erste Schritt mit Anästhesie mit einem Gasanästhetikum ist nicht erforderlich, wenn der Bediener mit der Verabreichung von injizierbaren Anästhetika an nicht sedierte Tiere vertraut und vertraut ist.
2. Entnehmen Sie eine ausreichende Menge eines Anästhesiecocktails bestehend aus Ketamin (50 mg/kg), Xylazin (2,6 mg/kg) und Acepromazin (0,5 mg/kg) in eine 30 g Tuberkulinspritze. Nehmen Sie das sedierte Tier aus der Anästhesiebox. Verabreichen Sie die intraperitoneale Injektion der Anästhesie, um während des gesamten Eingriffs eine gleichbleibende Sedierungstiefe zu erreichen und das Tier in seinen Käfig zurückzubringen.
3. Beginnen Sie den Vorgang, wenn ein Zehenkneifen keine Reaktion hervorruft. Untersuchen Sie das Tier auf Atemtiefe und -frequenz und kneifen Sie während des gesamten Eingriffs alle 5 Minuten in die Zehen, um sicherzustellen, dass keine Schmerzen auftreten.
4. Entfernen Sie das Tier nach Abschluss der Operation aus dem stereotaktischen Rahmen. Verabreichen Sie eine subkutane Injektion von Kochsalzlösung (3 ml), Ampicillin (0,15–0,2 mg/kg) und Banamin (2,5–5 mg/kg), um eine Analgesie und Flüssigkeitsunterstützung zu gewährleisten. Bringen Sie das Tier in einen beheizten Inkubator, um die Körpertemperatur zu halten.

3. Chirurgischer Ansatz

1. Legen Sie die Ratte (7–8 Wochen alt, Fischer 344 Stamm) in einen stereotaktischen Kopfrahmen und auf ein beheiztes Pad. Positionieren Sie den stereotaktischen Rahmen mit dem Rattenkopf zur Linken des Chirurgen und zentrieren Sie die linke Augenhöhle im chirurgischen Sichtfeld.
2. Tragen Sie auf das linke Auge einen Tropfen Proparacain auf und reinigen Sie das Auge, indem Sie 5% Povidon-Jod auf das Augenlid und das Auge auftragen. Verteilen Sie die Augensalbe auf die Hornhaut beider Augen, um die Feuchtigkeit der Hornhaut zu erhalten und die Bildung von Katarakten zu verhindern.
3. Führen Sie eine 4–0 Polyglactin-Naht durch die Epidermis des oberen Augenlids bis zur zentralen Seite des Augenlidrandes und verwenden Sie diese Naht in späteren Schritten für eine temporäre Tarsorrhaphie. Verwenden Sie die Naht, um das Augenlid umzukehren und den oberen Fornix freizulegen.
4. Kleben Sie die Polyglactin-Naht an den stereotaktischen Rahmen, um eine konstante Traktion und Belichtung zu gewährleisten. Vermeiden Sie übermäßige Traktion, da dies die Exposition des retroorbitalen Inhalts begrenzen kann.
5. Heben Sie mit einer Colibri-Pinzette die obere Bindehaut an und schneiden Sie die Bindehaut entlang des Limbus mit einer Vannas-Schere ein. Machen Sie eine 4-Uhr-Peritomie entlang des oberen Limbus.
6. Üben Sie eine leicht minderwertige Zugkraft auf den Globus aus, indem Sie eine Schlaufennaht aus Polypropylen entlang des oberen Limbus mit den freien Enden unterhalb des Globus platzieren. Restgewebe entlang des oberen Limbus nach der Peritomie reicht aus, um die Nahtschlaufe zu ziehen, ohne dass die Naht durch die Sklera oder den Limbus geführt werden muss.
   1. Sichern Sie die Enden der Schlaufe mit einer Bulldog-Klemme und lassen Sie die Klemme frei in der Luft baumeln. Das Gewicht der Klemme übt eine geringere Traktion auf die Kugel aus und legt einen größeren Teil des retroorbitalen Raums frei.
7. Stumpfe Präparierung mit einer Vannas-Schere entlang der Sklera entlang der hinteren Seite des Globus und unter dem Rectus superior. Lösen Sie die oberen Rektusmuskeln aus der Kugel, indem Sie die Muskelsehne mit einer Vannas-Schere durchtrennen, um Zugang zum retroorbitalen Raum zu erhalten.

4. Zugang zum Sehnerv

1. Mit einer Dumont #5/45 Pinzette entlang der Schläfenseite des hinteren Bulbus präparieren und die Vena lateralis superior identifizieren. Präparieren Sie die Nase weiter stumpf bis zur Vena lateralis superior, um den Orbitalmuskelkegel um den Sehnerv freizulegen und eine vorzeitige Schädigung des Sehnervs zu vermeiden. Vermeiden Sie es, die Wirbelvene zu verletzen, da dies zu erheblichen Blutungen führen kann. Wenn Blutungen auftreten, kann ein Wattestäbchen-Applikator aufgetragen werden, bis die Blutung aufhört.
2. Führen Sie mit der Dumont #5/45 Pinzette die Spitze vorsichtig in die Schläfenseite des Orbitamuskelkegels ein und öffnen Sie die Pinzette parallel zum Verlauf der Muskelfasern, um den Sehnerv freizulegen. Verschieben Sie mit der Pinzette die Muskelfasern, die über dem Sehnerv liegen, seitlich und legen Sie den Nerv vollständig frei. Stellen Sie sicher, dass nur die Sehnervenscheide den Sehnerv bedeckt, da verbleibende Muskelfasern verhindern, dass die gezogene Glaskapillarpipette leicht in den Sehnerv eindringt.
3. Halten Sie die Freilegung des Nervs aufrecht, indem Sie zwei Dumont #5/45 Pinzetten entlang beider lateraler Aspekte des Nervs platzieren und die Pinzette öffnen. Die Menge der Exposition sollte es ermöglichen, den Sehnerv 1,5 bis 2,0 mm hinter dem Globus zu quetschen und eine gezogene Glaskapillarpipette von dorsal in den Sehnerv einzuführen.

5. Durchtrennen des Sehnervs in der Sehscheide

1. Platzieren Sie die Spitzen mit der Dumont #5/45 Pinzette auf beiden Seiten des Sehnervs mindestens 1,5–2,0 mm hinter dem Globus. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der Pinzette den Durchmesser des Nervs überspannen. Schließen Sie die Pinzette für 5 s vollständig, um den Sehnerv zu quetschen, und notieren Sie sich die Position der Quetschstelle.
2. Füllen Sie mit einer Mikroliterspritze eine aus Glas gezogene Kapillarpipette mit 1–2 μl PBS und befestigen Sie die Pipette an einem Pipettenhalter. Montieren Sie den Pipettenhalter an einem Mikromanipulator und befestigen Sie den Mikromanipulator an dem stereotaktischen Rahmen.
3. Stellen Sie das Mikroinjektionssystem so ein, dass bei jedem Knopfdruck ein einzelner Impuls mit einer Dauer von 4 ms und einem Druck von 20 psi abgegeben wird. Positionieren Sie die Pipette im Operationsfeld.
4. Verwenden Sie unter dem chirurgischen Endoskop eine Pinzette #55, um die Pipettenspitze zu brechen und auf eine Größe (~20–30 μm Durchmesser) abzuschrägen, die in der Lage ist, ein kleines Volumen zu liefern, aber groß genug, um eine ausreichende Steifigkeit zu bieten, um die Sehnervenscheide zu durchdringen. Bestätigen Sie die Durchgängigkeit der Pipettenspitze, indem Sie einen einzigen Impuls geben und an der Pipettenspitze auf Flüssigkeit achten.
5. Verfeinern Sie die Position der Pipettenspitze bis knapp über die Stelle der Sehnervenquetschung in der Mitte des Sehnervs und in Kontakt mit der Sehnervenscheide. Notieren Sie sich die vertikale Position der Pipette auf dem Mikromanipulator, um später eine Tiefe von 200 μm zu bestimmen.
6. Senken Sie die Pipette ab, während Sie die Spitze unter dem chirurgischen Zielfernrohr beobachten, bis die Pipette in den Sehnerv eintritt. Wenn sich die Pipettenspitze verbiegt und nicht steif genug ist, um die Sehnervenscheide zu durchdringen, ziehen Sie die Pipette zurück und verwenden Sie eine Pinzette #55, um die Länge der Pipettenspitze zu verringern und den Durchmesser zu vergrößern. Nachdem Sie die Pipettenspitze eingestellt haben, versuchen Sie erneut, mit der Pipette in die Sehnervenscheide einzudringen.
7. Beim Eintritt in den Sehnerv mit der Pipettenspitze ziehen Sie die Pipette bei Bedarf zurück. Die Position der Pipettenspitze, wie sie vom stereotaktischen Mikromanipulator angezeigt wird, sollte 200 μm unter der Oberfläche des Sehnervs von der in Schritt 5.5 notierten Ausgangsposition liegen.
8. Während Sie den Sehnerv unter dem chirurgischen Endoskop beobachten, üben Sie mit dem Mikroinjektionssystem hydrostatische Druckimpulse aus. Beim Anlegen von Impulsen sollte eine lineare Trennung zwischen dem distalen und dem proximalen Ende des Sehnervs festgestellt werden, um die Durchtrennung des Sehnervs zu überprüfen.
   HINWEIS: Ein Injektionsvolumen von 250–500 nL ist im Allgemeinen ausreichend, um die für die Durchtrennung des Sehnervs erforderliche Kraft bereitzustellen. Injektionen, die mehr als 1 μl erfordern, können darauf hinweisen, dass die Injektionsstelle neu positioniert werden muss. Größere Volumina, die in das intakte Parenchym injiziert werden, verursachen möglicherweise keine zusätzlichen RGC-Schäden, da die Methode den Sehnerv vollständig durchtrennt, aber mit größerer Wahrscheinlichkeit entlang der Faszikel des Sehnervs verläuft. Das Versäumnis, eine lineare Durchtrennung des Sehnervs trotz Injektion eines ausreichenden Flüssigkeitsvolumens zu beobachten, deutet wahrscheinlich auf eine Fehlpositionierung der Pipette an der Quetschstelle und die Notwendigkeit einer Neupositionierung hin. Auch eine Erhöhung des Einspritzdrucks um 50 % kann erforderlich sein.

6. Abschluss und Rückforderung

1. Ziehen Sie die Pipette zurück und entfernen Sie die einziehbare Dumont #5/45 Pinzette. Bringen Sie das Auge wieder in eine neutrale Position, indem Sie die Bulldoggenklemme und die Schlaufennaht aus Polypropylen von der Kugel entfernen.
2. Positionieren Sie die Bindehaut wieder zum Limbus der Hornhaut und stellen Sie sicher, dass alle Bindehaut, die sich umgedreht hat, freigesetzt werden, um eine korrekte Positionierung des Gewebes und eine Heilung zu ermöglichen. Tragen Sie eine ophthalmische topische antibiotische Salbe auf das Auge auf.
3. Entfernen Sie das Klebeband von der 4–0-Polyglactin-Naht des Augenlids und halten Sie die Naht an Ort und Stelle, um sie für eine vorübergehende Tarsorrhaphie zu verwenden. Führen Sie die Naht durch den Lidrand des unteren Augenlids, durch den subkutikulären Bereich nach unten und durch die Epidermis aus. Binden Sie die Naht mit gerade genug Druck, um das Auge zu schließen.
4. Verabreichen Sie postoperative Analgetika gemäß den institutionellen Protokollen und den Richtlinien der Tierschutzbehörde. Halten Sie das Tier selbstständig in einem beheizten Käfig, damit es sich nach der Operation erholen kann. Legen Sie keine Einstreu in den Auffangkäfig, um ein versehentliches Ansaugen zu verhindern.

Ergebnisse

Die Durchtrennung des Sehnervs führt in der Regel zum apoptotischen Verlust von 80–90 % der verletzten RGCs innerhalb von 14 Tagen nach der Verletzung. Bei der beschriebenen Technik wird der Sehnerv durchtrennt, während die Integrität der Sehnervenscheide erhalten bleibt (Abbildung 1). Der Grad des RGC-Verlustes ist vergleichbar mit herkömmlichen Modellen der Durchtrennung des Sehnervs und der Sehnervenquetschung mit dem Vorteil, dass die durchtrennten Nervenenden nach der Durchtrennung mit der hier beschriebenen Methode mühelos angelegt werden (Abbildung 2). Die Wiederherstellung der durchtrennten Sehnervenenden auf diese Weise ermöglicht die Bewertung der axonalen Regeneration des RGC in einem Transsektionsmodell, indem ein Substrat bereitgestellt wird, auf dem Axone wachsen können, und ohne dass eine mikrochirurgische Manipulation erforderlich ist, um die durchtrennten Nervenenden wieder zu verbinden (Abbildung 3). Die anterograde Verfolgung von RGC-Axonen mit der Choleratoxin-B-Untereinheit (CTB) zeigt, dass CTB-positive Axone nach einer schleusenerhaltenden Durchtrennung des Sehnervs vollständig durchtrennt werden (Abbildung 4). Durch die Beibehaltung der Sehnervenscheide während der Durchtrennung des Sehnervs entsteht auch ein geschlossener Raum, in den Untersuchungsmaterialien, wie z. B. neurotrophe Faktoren oder Zellen, an die läsionierten RGC-Axone abgegeben und in Position gehalten werden können (Abbildung 5). In den Anfangsphasen der Ausbildung wird eine Erfolgsquote von 60-70 % bei der vollständigen Durchtrennung erwartet. Mit zunehmender Erfahrung liegt die Erfolgsquote der totalen Durchtrennung bei ca. 90-95%.

Abbildung 1: Durchtrennung des Sehnervs unter Erhalt der Sehnervenscheide. (A) Bild des Operationsfeldes, das die Freilegung des intakten Sehnervs vor der Durchtrennung zeigt. (B) Bild des Sehnervs nach der Durchtrennung. Eine feine Glaspipette durchbohrte die Sehnervenscheide an der Durchtrennungsstelle und führte eine Zellsuspension (trübe Lösung) in den Raum zwischen den Sehnervenenden ein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Verlust von retinalen Ganglienzellen nach einer Sehnervenscheide, die die Durchtrennung des Sehnervs erhält. Repräsentative flache Plateaus der gesamten Netzhaut von Augen mit (A) einem intakten Sehnerv, (B) einer Sehnervenscheide, die die Durchtrennung des Sehnervs erhält, (C) einer traditionellen Sehnervendurchtrennung oder (D) einer Sehnervenquetschung, die 14 Tage zuvor durchgeführt wurde, wurden immunmarkiert für Gamma-Synuclein (SNCG). Die Bilder wurden von einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 10-fach-Objektiv aufgenommen, um Schattierungen zu korrigieren und zu einem einzigen Bild zusammengefügt. Der Verlust von retinalen Ganglienzellkörpern (RGC) in der gesamten Netzhaut zeigte sich bei geschädigten Augen. Einschübe zeigen Bilder der Netzhaut mit höherer Vergrößerung und zeigen einen signifikanten Verlust von RGCs nach Verletzungen des Sehnervs. (E) Die Quantifizierung des RGC-Überlebens zeigt einen signifikanten RGC-Verlust nach Verletzungen des Sehnervs im Vergleich zu intakten Sehnerven. *p< 0,05 im Vergleich zu intakt; One-Way-ANOVA mit post-hoc-Tukey-Test. n = 3 Tiere pro Gruppe; Fehlerbalken repräsentieren SD. SP-ONT, scheidenerhaltende Durchtrennung des Sehnervs; ONT, Durchtrennung des Sehnervs; ONC, Quetschung des Sehnervs. Maßstabsleisten = 1.000 μm. Maßstabsbalken in Einschüben = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Schnitte von Sehnerven nach Verletzungen des Sehnervs. Repräsentative Bilder des Longitudinalschnitts durch den Sehnerv 14 Tage nach (A-C) einer Durchtrennung der Sehnervenscheide, (D-F) einer traditionellen Durchtrennung des Sehnervs oder (G-I) einer Quetschung des Sehnervs. (A,D,G) Die Immunmarkierung für gliales fibrilläres saures Protein (GFAP) beschreibt das Ausmaß der Läsion, während die (B,E,H)-DNA-Markierung mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) eine zusammenhängende Zellularität entlang der Länge des Sehnervs und innerhalb der Läsionsstelle zeigt. (C,F,I) Zusammengeführte Bilder, die die Lokalisation von GFAP-positivem Nervengewebe und Zellularität an der Läsionsstelle zeigen. Maßstabsstäbe = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Schnitt eines Sehnervs im Anschluss an eine Sehnervenscheide, die die Durchtrennung des Sehnervs erhält. Repräsentative Bilder eines Längsschnitts durch einen Sehnerv 14 Tage nach einer durchtrennenden Durchtrennung der Sehnervenscheide mit anterograder Axonverfolgung mit einer intravitrealen Choleratoxin-B-Untereinheit (CTB)-Injektion. (A) Es ist eine vollständige Läsionierung von CTB-markierten RGC-Axonen zu beobachten, die sich vom Globus (links) in Richtung Gehirn (rechts) erstrecken. (B) Die Immunmarkierung für das saure Protein der Gliafaser (GFAP) beschreibt eine ausgedehnte Läsion, die den gesamten Durchmesser des Sehnervs umfasst. (C) Die DNA-Markierung mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) zeigt die Zellularität innerhalb der Läsionsstelle. (D) Ein zusammengeführtes Bild, das die Lokalisation von CTB-markierten Axonen, GFAP-positivem Nervengewebe und Zellularität an der Läsionsstelle zeigt. Maßstabsstäbe = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Längsschnitt eines durchtrennten Sehnervs, der eine Zelltransplantation erhielt. Repräsentative Bilder eines Längsschnitts durch einen Sehnerv 14 Tage nach einer Sehnervenscheide, die die Durchtrennung und Transplantation von neuralen Stammzellen (NSCs) erhält, die das fluoreszierende Protein tdTomato exprimieren. (A) Die Immunmarkierung für das saure Protein der Gliafibrillen (GFAP) zeigte eine vollständige Trennung der durchtrennten Sehnervenenden. (B) NSCs, die tdTomato exprimierten, wurden in dem durch die beschriebene Technik geschaffenen Raum eingeschlossen und überlebten nach der Transplantation weiter. (C) Transplantierte NSCs wurden direkt an beiden abgeschnittenen Enden des durchtrennten Sehnervs angebracht. Maßstabsstäbe, 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Chirurgische Verfahren, die das Modell der Durchtrennung des Sehnervs beschreiben, wurden bereits veröffentlicht⁶. Die in diesen Protokollen beschriebenen Techniken beinhalten jedoch das Einschneiden der Hirnhautscheide, um den Sehnerv zu durchtrennen. Darüber hinaus waren zur Beurteilung der RGC-Axonregeneration in früheren Transsektionsmodellen anspruchsvolle mikrochirurgische Manipulationen erforderlich, um entweder die durchtrennten Sehnervenenden oder ein peripheres Nerventransplantat an den proximalen Sehnervenstumpf anzulegen^10,13. Das hier beschriebene Protokoll stört die Sehnervenscheide bei der Durchtrennung des Sehnervs minimal und ermöglicht die Auswertung der RGC-Axonregeneration in einem Durchtrennungsmodell, ohne dass technisch anspruchsvolle mikrochirurgische Manipulationen erforderlich sind.

In diesem Protokoll sind mehrere Schritte entscheidend. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Arteria ophthalmica und das Gefäßsystem, das den Sehnervenkopf versorgt, nicht beschädigt werden. Daher sollte Schritt 5.1 mindestens 1,5-2,0 mm posterior des Globus abgeschlossen werden. Kommt es zu einer Schädigung der Arteria ophthalmica, die die Blutversorgung der Netzhaut stört, sollte das Auge von weiteren Experimenten ausgeschlossen werden, da wahrscheinlich eine Phthisis folgen wird. Während der Schritte 5.4-5.6 ist es wichtig, die Integrität der Sehnervenscheide zu erhalten und die Größe der Öffnung, durch die die Glaspipette in den Sehnerv eintritt, zu minimieren. Dadurch wird eine dichte Abdichtung um die Pipettenspitze gebildet, um den Flüssigkeitsrückfluss zu reduzieren, und es kann ein ausreichender hydrostatischer Druck erzeugt werden, um den Sehnerv zu durchtrennen. Das Abschrägen der Spitze der Glaspipetten verbessert die Leichtigkeit, mit der die Pipette in den Sehnerv eindringt, ohne Kollateralschäden zu verursachen.

Es gibt mögliche Änderungen, die die Betreiber vornehmen könnten, um die Zugänglichkeit dieser Methode zu verbessern. Bei den beschriebenen Verfahren handelt es sich um eine minimale Dissektion und Entfernung von Orbitagewebe unter Erhalt des Gesichts- und Trigeminusnervs. Während dies die Morbidität und das Blutungsrisiko reduziert, können Gewebe wie das Orbitalfett und die Tränendrüse die Visualisierung wichtiger Strukturen einschränken. Eine sorgfältige Entfernung von Gewebe, das das Operationsfeld blockiert, kann erforderlich sein, um die Sichtbarkeit zu verbessern, insbesondere bei älteren Tieren. Ein lateraler Zugang könnte auch verwendet werden, um den Zugang zum Sehnerv zu verbessern. Eine laterale Dissektion birgt jedoch das Risiko, dass zusätzliche Strukturen, einschließlich des Trigeminusnervs, geschädigt werden, ist stärker betroffen und kann seine eigenen Herausforderungen für die Leitung von Instrumenten für Injektionen mit sich bringen.

Eine mögliche Einschränkung dieser Methode ist die Unfähigkeit, den Sehnerv direkt zu manipulieren und die gesamte Durchtrennung vollständig sichtbar zu machen. Daher besteht die Möglichkeit einer unvollständigen Durchtrennung. Wir haben jedoch beobachtet, dass die visuelle Bestätigung der Trennung der Nervenenden während Schritt 5.8 ein zuverlässiger Indikator für eine erfolgreiche und vollständige Durchtrennung ist. Sollten sich die Nervenenden nicht trennen lassen, sollte eine Neupositionierung der Injektionspipette oder eine Erhöhung des Injektionsdrucks um 50 % ausreichen, um den Nerv vollständig zu durchtrennen.

Im Vergleich zu bestehenden Methoden bleibt bei diesem Ansatz die Integrität der Sehnervenscheide erhalten. Bei der Aufrechterhaltung der Integrität der Sehnervenscheide sind die Enden des durchtrennten Sehnervs nicht der orbitalen Umgebung und dem peripheren Immunsystem ausgesetzt, wodurch die Exposition gegenüber Immunfaktoren begrenzt wird, die möglicherweise die RGC-Reaktionen beeinflussen könnten. Darüber hinaus entsteht durch die Beibehaltung der Integrität der Sehnervenscheide während der Durchtrennung des Sehnervs ein geschlossener physischer Raum, der von den Sehnervenenden und der Sehnervenscheide begrenzt wird. Die lokalisierte Abgabe von neurotrophen Faktoren, Zellen oder Polymeren an das axonale Kompartiment der verletzten RGCs kann durch Injektion in den neu gebildeten Raum erreicht werden. ¹⁴ Alternativ kann die RGC-Axonregeneration in einem Transsektionsmodell untersucht werden, indem die durchtrennten Sehnervenenden ohne schwierige mikrochirurgische Techniken anastomosiert werden können.

Zu den Anwendungen dieser Methode gehört die Bewertung des verletzten axonalen Kompartiments des RGC mit axonspezifischen Interventionen, um Signalwege zu identifizieren, die für die axonale Degeneration verantwortlich sind, und um einen axonalen Verlust nach einer Durchtrennungsverletzung zu verhindern. Darüber hinaus macht diese Methode Studien zur axonalen Regeneration von RGC in einem Durchtrennungsmodell für eine breitere Forschungsgemeinschaft zugänglich, da technisch schwierige Anastomosenverfahren des Sehnervs überflüssig werden. Interventionen, die auf die Förderung der RGC-Axonregeneration abzielen, könnten mit diesem Modell für schwere Verletzungen evaluiert werden und konsistente und reproduzierbare Ergebnisse liefern, ohne dass um verschonte Axone geachtet werden muss.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Polyglactin suture	Ethicon	J315H
9-0 Polypropylene suture	Ethicon	1754G
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/kg Stock Concentration: 10 mg/mL Final Concentration: 0.25 mg/mL
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/mL
Anesthesia System	VetEquip	901806
Animal incubator	Precision Incubators	Chick Chalet II
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/mL Final Concentration: 0.5 mg/mL
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150F-4
Colibri forceps	Katena	K5-1500
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35
Heat therapy pump	Kent Scientific	HTP-1500
Isoflurane	Covetrus	29404
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz	RS-7440
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 25 mg/mL
Microinjection system (Picospritzer II)	General Valve, Inc
Microliter syringe 5 µL	Hamilton	88000
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-77 Brown-Flaming
Neomycin/Polymyxin B sulfates/Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	Bausch + Lomb
PBS	Millipore	BSS-1005-B
Povidone-iodine	Healthpets	BET16OZ
Proparacaine hydrochloride 0.5%	Bausch + Lomb
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 mL/injection
Stereotaxic Frame	Kopf
Surgical Microscope	Zeiss
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09
Xylazine	Lloyd	0410	2.5-8 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 5.8 mg/mL