Transmission du nerf optique préservant la gaine chez le rat pour évaluer la régénération axonale et interventions ciblant l’axone de la cellule ganglionnaire rétinienne

Résumé

Ce protocole décrit une section du nerf optique qui préserve la gaine du nerf optique chez le rat. La pression hydrostatique des micro-injections dans le nerf optique génère une transection complète, permettant une réapposition sans suture des extrémités du nerf optique transectées et un ciblage direct du compartiment axonal dans un modèle de transsection.

Résumé

Les axones des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) convergent au niveau de la tête du nerf optique pour transmettre des informations visuelles de la rétine au cerveau. Des pathologies telles que le glaucome, les traumatismes et les neuropathies optiques ischémiques endommagent les axones RGC, perturbent la transmission des stimuli visuels et entraînent une perte de vision. Les modèles animaux simulant les lésions axonales du RGC comprennent les paradigmes d’écrasement et de section du nerf optique. Chacun de ces modèles présente des avantages et des inconvénients inhérents. Un écrasement du nerf optique est généralement moins grave qu’une section et peut être utilisé pour tester la régénération axonale sur le site de la lésion. Cependant, les différences de force d’écrasement et de durée peuvent affecter les réponses tissulaires, ce qui entraîne une reproductibilité variable et une complétude des lésions. Avec la transsection du nerf optique, il y a une lésion grave et reproductible qui lésions complètement tous les axones. Cependant, la transectation du nerf optique modifie considérablement la barrière hémato-encéphalique en violant la gaine du nerf optique, exposant le nerf optique à l’environnement périphérique. De plus, la régénération au-delà d’un site de transsection ne peut être évaluée sans réapposer les extrémités nerveuses coupées. De plus, des changements dégénératifs distincts et des voies cellulaires sont activés par une blessure par écrasement ou par une transsection.

La méthode décrite ici intègre les avantages des modèles d’écrasement et de section du nerf optique tout en atténuant les inconvénients. La pression hydrostatique délivrée dans le nerf optique par micro-injection transecte complètement le nerf optique tout en maintenant l’intégrité de la gaine du nerf optique. Les extrémités du nerf optique transectées sont réapposées pour permettre des tests de régénération axonale. Une limitation potentielle de cette méthode est l’incapacité de visualiser la transection complète, une source potentielle de variabilité. Cependant, la confirmation visuelle que la partie visible du nerf optique a été transectée est indicative d’une section complète du nerf optique avec un taux de réussite de 90 à 95 %. Cette méthode pourrait être appliquée pour évaluer les stratégies de promotion de la régénération axonale dans un modèle de transsection ou pour étudier les interventions qui ciblent les compartiments axonaux.

Introduction

Les lésions axonales et la dégénérescence se produisent dans les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) à la suite d’un traumatisme ou dans des maladies neurodégénératives telles que le glaucome ^1,2. La perte de CGR et la perturbation des projections rétinofugues entraînent une perte permanente de la vision³. Pour comprendre les voies moléculaires responsables des processus dégénératifs et pour développer des stratégies visant à atténuer la perte axonale et RGC ou à régénérer les axones RGC, des modèles animaux expérimentaux ont été utilisés pour simuler des lésions du nerf optique, y compris des modèles d’écrasement du nerf optique et de transsection du nerf optique. Lors de la sélection d’un modèle expérimental, il faut tenir compte des avantages et des inconvénients de chaque approche ainsi que des voies moléculaires activées par la lésion⁴.

La raison d’être de la mise au point de la méthode décrite ici est de tirer parti des avantages des modèles d’écrasement du nerf optique⁵ et de transection⁶ tout en atténuant les inconvénients. Les objectifs de cette méthode étaient de générer une lésion du nerf optique reproductible dans laquelle tous les axones sont incontestablement et complètement transectés, l’exposition au système immunitaire périphérique est minimisée et les extrémités transectées du nerf optique sont facilement réapposées pour permettre l’évaluation de la régénération du RGC. De plus, la méthode a été développée pour permettre un accès compartimenté à la partie axonale des CGR lésés et pour administrer des interventions spécifiques aux axones (par exemple, facteurs neurotrophiques, greffes cellulaires) localement au nerf optique rétroorbitaire.

Les avantages de cette technique sont multiples par rapport aux méthodes alternatives. Par rapport à un écrasement du nerf optique, cette méthode traverse complètement et de manière fiable le nerf optique ; Cela résout un problème potentiel d’épargne d’axones^{indésirables 7}. De plus, la méthode décrite provoque une lésion axonale grave qui ne dépend pas de la quantité et de la durée de la force appliquée par l’opérateur comme dans le cas d’une blessure par écrasement, réduisant ainsi la variabilité⁸. Contrairement aux méthodes établies de transect du nerf optique, l’approche détaillée dans ce protocole maintient l’intégrité de la gaine du nerf optique. L’un des avantages de la préservation de la gaine du nerf optique est qu’elle empêche le nerf optique d’être exposé au système immunitaire périphérique. De plus, les forces mécaniques exercées par la gaine du nerf optique sur le nerf optique transecté réapparaissent les extrémités du nerf coupé sans qu’il soit nécessaire de recourir à des manipulations microchirurgicales difficiles ^9,10,11. Enfin, avec la gaine du nerf optique intacte, la méthode produit un espace physique entre les moignons du nerf optique dans lequel les cellules souches, les facteurs neurotrophiques ou les polymères peuvent être introduits directement dans les axones RGC lésés.

L’écrasement du nerf optique est le modèle de référence dans lequel les stratégies de régénération du nerf optique sont évaluées pour déterminer l’efficacité des traitements. La taille du nerf optique du rongeur limite les manipulations possibles, notamment la section et la réadaptation du nerf. Cependant, dans le domaine des lésions de la moelle épinière et de la régénération, il existe un consensus sur le fait qu’une section complète est le modèle idéal pour distinguer la régénération axonale de l’axone¹² épargné. La méthode décrite ici réduit les obstacles techniques à l’évaluation des stratégies de régénération dans un modèle de transsection du nerf optique. En tant que tel, ce modèle pourrait être utilisé pour valider des stratégies prometteuses identifiées dans les paradigmes d’écrasement du nerf optique avec une transection du nerf optique. De plus, comme ce modèle cible directement le compartiment axonal, il permet d’étudier les interventions sur les axones RGC adultes lésés et les mécanismes responsables des processus dégénératifs et régénératifs axonaux.

Le modèle de section du nerf optique décrit dans cette étude transecte complètement le nerf optique tout en préservant la gaine du nerf optique. Cette nouvelle approche convient aux expériences qui visent à évaluer la régénération axonale dans un modèle de transsection sans avoir besoin du processus techniquement difficile de réapposition des extrémités du nerf optique. Certains aspects de la technique sont similaires à la réalisation d’un écrasement du nerf optique ; Par conséquent, l’approche peut être effectuée par des opérateurs expérimentés avec un écrasement du nerf optique. L’approche chirurgicale ne nécessite pas d’instruments spécialement conçus et peut être complétée par des instruments chirurgicaux facilement disponibles et un système de micro-injection, ce qui la rend accessible et économique.

Protocole

Les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du système de santé des anciens combattants de San Diego. Les instruments et les solutions chirurgicales ont été stérilisés avant l’intervention chirurgicale afin de limiter les infections et les complications postopératoires.

1. Technique chirurgicale

1. Mener des expériences à l’aide de techniques aseptiques et selon les protocoles d’utilisation des animaux propres à l’établissement.
2. Stérilisez les instruments et les matériaux qui entrent en contact avec les tissus vivants afin de prévenir les infections, d’éviter d’avoir un impact négatif sur le bien-être des animaux et de minimiser les influences négatives potentielles sur l’étude. Nettoyez soigneusement les instruments chirurgicaux avec de l’eau et des détergents ou des produits enzymatiques pour éliminer les corps étrangers et stérilisez-les par stérilisation à la vapeur ou par stérilisation éclair.
3. Aliquote des liquides dans des récipients stériles dans une hotte de culture tissulaire. Stérilisez la seringue d’un microlitre en la rinçant avec de l’éthanol à 70 % et en la rinçant avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS).

2. Anesthésie

1. Anesthésie les rats à l’aide d’un système de vaporisation d’isoflurane. Vaporisez de l’isoflurane à une concentration de 4,5 % en utilisant de l’oxygène de qualité médicale à un débit de 1 L/min dans une boîte d’anesthésie attachée. Placez l’animal dans la boîte d’anesthésie jusqu’à ce que la respiration ralentisse et que l’animal soit sous sédation.
   REMARQUE : Cette étape initiale utilisant une anesthésie avec un anesthésique gazeux n’est pas nécessaire si l’opérateur est à l’aise et familier avec l’administration d’anesthésiques injectables à des animaux non sous sédation.
2. Prélever un volume suffisant d’un cocktail anesthésique composé de kétamine (50 mg/kg), de xylazine (2,6 mg/kg) et d’acépromazine (0,5 mg/kg) dans une seringue à tuberculine de 30 G. Retirez l’animal sous sédatif de la boîte d’anesthésie. Administrer l’injection d’anesthésie par voie intrapéritonéale pour obtenir une profondeur de sédation constante tout au long de la procédure et ramener l’animal dans sa cage.
3. Commencez la procédure lorsqu’un pincement de l’orteil ne parvient pas à susciter une réponse. Évaluez la profondeur et le rythme respiratoire de l’animal et avec un pincement des orteils toutes les 5 minutes tout au long de la procédure pour s’assurer de l’absence de douleur.
4. Une fois la chirurgie terminée, retirez l’animal du cadre stéréotaxique. Administrer une injection sous-cutanée de solution saline (3 ml), d’ampicilline (0,15 à 0,2 mg/kg) et de banamine (2,5 à 5 mg/kg) pour fournir une analgésie et un soutien hydrique. Transférez l’animal dans un incubateur chauffé pour maintenir la température corporelle.

3. Approche chirurgicale

1. Placez le rat (âgé de 7 à 8 semaines, souche Fischer 344) dans un cadre stéréotaxique de tête et sur un coussin chauffant. Positionnez le cadre stéréotaxique avec la tête de rat tournée vers la gauche du chirurgien et centrez l’orbite gauche dans le champ de vision chirurgical.
2. Sur l’œil gauche, appliquez une goutte de proparacaïne et nettoyez l’œil en appliquant 5 % de povidone iode sur la paupière et l’œil. Étalez une pommade ophtalmique sur la cornée des deux yeux pour maintenir l’humidité de la cornée et prévenir la formation de cataracte.
3. Passez une suture polyglactine 4-0 à travers l’épiderme de la paupière supérieure jusqu’à la face centrale du bord de la paupière, en utilisant cette suture pour une tarsorraphie temporaire dans les étapes ultérieures. Utilisez la suture pour retourner la paupière et exposer le fornix supérieur.
4. Collez la suture polyglactine sur le cadre stéréotaxique pour appliquer une traction et une exposition constantes. Évitez une traction excessive car cela peut limiter l’exposition du contenu rétroorbitaire.
5. À l’aide d’une pince Colibri, élevez la conjonctive supérieure et incisez la conjonctive le long du limbe avec une paire de ciseaux Vannas. Faites une péritomie à 4 heures le long du limbe supérieur.
6. Appliquez une légère traction inférieure sur le globe en plaçant une suture en polypropylène bouclée le long du limbe supérieur avec les extrémités libres sous le globe. Le tissu résiduel le long du limbe supérieur après la péritomie est suffisant pour fournir une traction sur l’anse de suture sans avoir besoin de faire passer la suture à travers la sclérotique ou le limbe.
   1. Fixez les extrémités de la boucle avec une pince bouledogue et laissez la pince pendre librement dans les airs. Le poids de la pince appliquera une traction inférieure sur le globe et exposera une plus grande partie de l’espace rétroorbital.
7. Dissection émoussée avec des ciseaux Vannas le long de la sclérotique en suivant la face postérieure du globe et sous le droit supérieur. Désinsérez les muscles droits supérieurs du globe en coupant le tendon musculaire avec des ciseaux Vannas pour accéder à l’espace rétroorbitaire.

4. Accès au nerf optique

1. Disséquer avec la pince Dumont #5/45 le long de la face temporale du globe postérieur et identifier la veine vortex latérale supérieure. D’autres dissections contondantes dans la veine vortex latérale supérieure pour exposer le cône musculaire orbitaire autour du nerf optique et éviter d’endommager prématurément le nerf optique. Évitez de blesser la veine vortex car cela peut provoquer des saignements importants. En cas de saignement, un applicateur à embout coton peut être appliqué jusqu’à ce que le saignement cesse.
2. À l’aide de la pince Dumont #5/45, insérez soigneusement l’embout dans l’aspect temporal du cône musculaire orbitaire et ouvrez la pince parallèlement au trajet des fibres musculaires pour révéler le nerf optique. Utilisez la pince pour déplacer latéralement les fibres musculaires recouvrant le nerf optique et exposer complètement le nerf. Assurez-vous que seule la gaine du nerf optique recouvre le nerf optique, car les fibres musculaires résiduelles empêcheront la pipette capillaire en verre tirée de percer facilement le nerf optique.
3. Maintenez l’exposition du nerf en plaçant deux pinces Dumont #5/45 le long des deux côtés latéraux du nerf et en ouvrant la pince. La quantité d’exposition doit permettre d’écraser le nerf optique de 1,5 à 2,0 mm à l’arrière du globe et d’insérer une pipette capillaire en verre tiré dans le nerf optique à partir de la face dorsale.

5. Traversée du nerf optique à l’intérieur de la gaine optique

1. À l’aide de la pince Dumont #5/45, placez les pointes de chaque côté du nerf optique à au moins 1,5 à 2,0 mm en arrière du globe. Assurez-vous que les pointes de la pince couvrent le diamètre du nerf. Fermez complètement la pince pendant 5 secondes pour écraser le nerf optique et notez la position du site d’écrasement.
2. À l’aide d’une seringue d’un microlitre, remplissez une pipette capillaire en verre avec 1 à 2 μL de PBS et fixez la pipette à un porte-pipette. Montez le support de pipette sur un micromanipulateur et fixez le micromanipulateur sur le cadre stéréotaxique.
3. Ajustez le système de micro-injection pour délivrer une seule impulsion d’une durée de 4 ms à une pression de 20 psi à chaque pression sur le bouton. Positionnez la pipette dans le champ opératoire.
4. Sous l’endoscope chirurgical, utilisez une paire de pinces #55 pour casser et biseauter la pointe de la pipette à une taille (~20 à 30 μm de diamètre) capable de fournir un petit volume mais suffisamment grand pour fournir une rigidité suffisante pour pénétrer dans la gaine du nerf optique. Confirmez la perméabilité de la pointe de la pipette en donnant une seule impulsion et en observant la présence de liquide au niveau de la pointe de la pipette.
5. Affinez la position de la pointe de la pipette juste au-dessus du site de l’écrasement du nerf optique au centre du nerf optique et en contact avec la gaine du nerf optique. Notez la position verticale de la pipette sur le micromanipulateur pour déterminer ultérieurement une profondeur de 200 μm.
6. Abaissez la pipette tout en observant la pointe sous la lunette chirurgicale jusqu’à ce que la pipette pénètre dans le nerf optique. Si la pointe de la pipette se plie et n’a pas la rigidité nécessaire pour pénétrer la gaine du nerf optique, rétractez la pipette et utilisez une paire de pinces #55 pour diminuer la longueur et augmenter le diamètre de la pointe de la pipette. Une fois que les réglages de la pointe de la pipette ont été effectués, essayez à nouveau de pénétrer la gaine du nerf optique avec la pipette.
7. Lors de l’entrée dans le nerf optique avec la pointe de la pipette, rétractez la pipette si nécessaire. La position de la pointe de la pipette, telle qu’indiquée par le micromanipulateur stéréotaxique, doit être à 200 μm sous la surface du nerf optique à partir de la position initiale indiquée à l’étape 5.5.
8. Tout en observant le nerf optique sous la portée chirurgicale, appliquez des impulsions de pression hydrostatique avec le système de micro-injection. Au fur et à mesure que des impulsions sont appliquées, une séparation linéaire entre les extrémités distale et proximale du nerf optique doit être notée pour vérifier la section du nerf optique.
   REMARQUE : Un volume d’injection de 250 à 500 nL est généralement suffisant pour fournir la force nécessaire pour transecter le nerf optique. Les injections nécessitant plus de 1 μL peuvent indiquer la nécessité de repositionner le site d’injection. Des volumes plus importants injectés dans le parenchyme intact peuvent ne pas causer de dommages supplémentaires au CGR, étant donné que la méthode transecte complètement le nerf optique, mais est plus susceptible de suivre le long des faisceaux du nerf optique. Le fait de ne pas observer une section linéaire du nerf optique malgré l’injection d’un volume de liquide suffisant indique probablement un mauvais positionnement de la pipette sur le site d’écrasement et la nécessité d’un repositionnement. Une augmentation de 50 % de la pression d’injection peut également être nécessaire.

6. Clôture et récupération

1. Rétractez la pipette et retirez la pince rétractable Dumont #5/45. Remettez l’œil dans une position neutre en retirant la pince bouledogue et la suture en polypropylène bouclée du globe.
2. Repositionnez la conjonctive sur le limbe cornéen, en vous assurant de libérer toute conjonctive qui s’est inversée pour permettre une bonne apposition du tissu et la guérison. Appliquez une pommade antibiotique topique ophtalmique sur l’œil.
3. Retirez le ruban adhésif de la paupière 4-0 et maintenez la suture en place pour une tarsorrhaphie temporaire. Passez la suture à travers le bord de la paupière de la paupière inférieure, à travers la zone sous-cuticulaire vers le bas et en sortant par l’épiderme. Attachez la suture avec juste assez de pression pour fermer l’œil.
4. Administrer des analgésiques postopératoires conformément aux protocoles de l’établissement et aux directives des autorités en matière de soins aux animaux. Hébergez l’animal de manière autonome dans une cage chauffée pour qu’il se rétablisse après l’opération. Ne placez pas la litière dans la cage de récupération pour éviter une aspiration accidentelle.

Résultats

La section du nerf optique entraîne généralement la perte apoptotique de 80 à 90 % des CGR blessés dans les 14 jours suivant la blessure. La technique décrite transecte le nerf optique tout en maintenant l’intégrité de la gaine du nerf optique (Figure 1). Le degré de perte de RGC est comparable à celui des modèles traditionnels de section du nerf optique et d’écrasement du nerf optique, avec l’avantage que les extrémités nerveuses coupées sont apposées sans effort après la section avec la méthode décrite ici (Figure 2). La reconnexion des extrémités du nerf optique coupé de cette manière permet d’évaluer la régénération axonale du CGR dans un modèle de transsection en fournissant un substrat sur lequel les axones peuvent se développer et sans qu’il soit nécessaire de reconnecter les terminaisons nerveuses coupées (Figure 3). Le tracé antérograde des axones RGC avec la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB) démontre que les axones positifs CTB sont complètement tranectés à la suite d’une transsection du nerf optique préservant la gaine (Figure 4). La préservation de la gaine du nerf optique tout en transectant le nerf optique crée également un espace clos dans lequel les matériaux d’investigation, tels que les facteurs neurotrophiques ou les cellules, peuvent être délivrés aux axones RGC lésés et maintenus en position (Figure 5). Au cours des phases initiales de la formation, on s’attend à un taux de réussite de 60 à 70 % de la transition totale. Avec l’expérience, le taux de réussite de la transsection totale est d’environ 90-95 %.

Figure 1 : Traversée du nerf optique tout en préservant la gaine du nerf optique. (A) Image du champ opératoire montrant l’exposition du nerf optique intact avant la tranquillité. (B) Image du nerf optique après la transection. Une fine pipette en verre a percé la gaine du nerf optique au site de transsection et a délivré une suspension cellulaire (solution trouble) dans l’espace entre les extrémités du nerf optique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Perte de cellules ganglionnaires rétiniennes suite à une gaine de nerf optique préservant la transection du nerf optique. Des montures plates représentatives de la rétine entière des yeux avec (A) un nerf optique intact, (B) une gaine de nerf optique préservant la transection du nerf optique, (C) une transection traditionnelle du nerf optique, ou (D) un écrasement du nerf optique 14 jours auparavant ont été immunomarqués pour la gamma synucléine (SNCG). Les images ont été obtenues à partir d’un microscope à fluorescence à l’aide d’un objectif 10x, corrigées pour l’ombrage et assemblées pour générer une seule image. La perte de corps de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) dans toute la rétine était apparente dans les yeux lésés. Les inserts montrent des images de la rétine à plus fort grossissement et démontrent une perte significative de CGR à la suite de lésions du nerf optique. (E) La quantification de la survie du RGC démontre une perte significative de RGC après des lésions du nerf optique par rapport aux nerfs optiques intacts du contrôle. *p< 0,05 par rapport à intact ; ANOVA à un facteur avec test de Tukey post-hoc. n = 3 animaux par groupe ; les barres d’erreur représentent SD. SP-ONT, transsection du nerf optique préservant la gaine ; ONT, transection du nerf optique ; ONC, écrasement du nerf optique. Barres d’échelle = 1 000 μm. Barres d’échelle en encarts = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 : Sections de nerfs optiques suite à des lésions du nerf optique. Images représentatives de la coupe longitudinale à travers les nerfs optiques 14 jours après (A-C) une transsection préservant la transection du nerf optique (D-F), la transsection traditionnelle du nerf optique ou (G-I) l’écrasement du nerf optique. (A, D, G) L’immunomarquage de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) délimite l’étendue de la lésion tandis que le marquage de l’ADN (B,E,H) avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) démontre une cellularité contiguë sur toute la longueur du nerf optique et à l’intérieur du site de la lésion. (C, F, I) Images fusionnées montrant la localisation du tissu neural GFAP-positif et la cellularité au site de la lésion. Barres d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 : Coupe d’un nerf optique suivant une gaine de nerf optique préservant la transection du nerf optique. Images représentatives d’une coupe longitudinale à travers un nerf optique 14 jours après une transsection préservant la gaine du nerf optique avec traçage axonal antérograde avec une injection intravitréenne de la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB). (A) Une lésion complète des axones RGC marqués CTB s’étendant du globe (à gauche) vers le cerveau (à droite) peut être observée. (B) L’immunomarquage de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) délimite une lésion étendue qui implique tout le diamètre du nerf optique. (C) Le marquage de l’ADN avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) démontre la cellularité au sein du site de la lésion. (D) Une image fusionnée démontrant la localisation des axones marqués CTB, du tissu neural GFAP positif et de la cellularité au site de la lésion. Barres d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 : Coupe longitudinale d’un nerf optique transecté ayant reçu une greffe cellulaire. Images représentatives d’une coupe longitudinale à travers un nerf optique 14 jours après une transsection et une transplantation de cellules souches neurales neurales (NSC) exprimant la protéine fluorescente tdTomato. (A) L’immunomarquage de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) a démontré la séparation complète des extrémités du nerf optique transectées. (B) Les NSC exprimant tdTomato étaient contenues dans l’espace créé par la technique décrite et ont continué à survivre après la transplantation. (C) Les CSN greffées ont été directement apposées aux deux extrémités coupées du nerf optique transecté. Barres d’échelle, 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Des procédures chirurgicales décrivant le modèle de section du nerf optique ont été publiées précédemment⁶. Cependant, les techniques détaillées dans ces protocoles impliquent l’incision de la gaine méningée pour transecter le nerf optique. De plus, afin d’évaluer la régénération axonale du RGC dans les modèles de transsection précédents, des manipulations microchirurgicales difficiles ont été nécessaires pour apposer les extrémités du nerf optique coupées ou une greffe de nerf périphérique sur le moignon du nerf optique proximal^10,13. Le protocole décrit ici perturbe de manière minimale la gaine du nerf optique tout en transectant le nerf optique et permet d’évaluer la régénération de l’axone RGC dans un modèle de transsection sans avoir besoin de manipulations microchirurgicales techniquement difficiles.

Plusieurs étapes sont essentielles dans ce protocole. Des précautions doivent être prises pour ne pas endommager l’artère ophtalmique et le système vasculaire alimentant la tête du nerf optique. Par conséquent, l’étape 5.1 doit être effectuée au moins 1,5 à 2,0 mm en arrière du globe. Si des dommages à l’artère ophtalmique se produisent et perturbent l’approvisionnement en sang de la rétine, l’œil doit être exclu des expériences ultérieures car une phtisie est susceptible de s’ensuivre. Au cours des étapes 5.4 à 5.6, il est important de maintenir l’intégrité de la gaine du nerf optique et de minimiser la taille de l’ouverture par laquelle la pipette en verre pénètre dans le nerf optique. Ce faisant, il forme un joint étanche autour de la pointe de la pipette pour réduire le reflux de fluide et permet de générer une pression hydrostatique suffisante pour traverser le nerf optique. Le biseautage de la pointe des pipettes en verre améliorera la facilité avec laquelle la pipette pénètre dans le nerf optique sans causer de dommages collatéraux.

Il existe des modifications que les opérateurs pourraient apporter pour améliorer l’accessibilité de cette méthode. Les procédures décrites impliquent une dissection minimale et une ablation du tissu orbitaire avec préservation du nerf facial et du nerf trijumeau. Bien que cela réduise la morbidité et les risques de saignement, des tissus tels que la graisse orbitaire et la glande lacrymale peuvent limiter la visualisation des structures cruciales. L’ablation soigneuse des tissus obstruant le champ opératoire peut être nécessaire pour améliorer la visualisation, en particulier chez les animaux âgés. Une approche latérale pourrait également être utilisée pour améliorer l’accès au nerf optique. Cependant, une dissection latérale risque d’endommager d’autres structures, y compris le nerf trijumeau, est plus impliquée et peut présenter ses propres défis pour diriger l’instrumentation des injections.

Une limitation possible de cette méthode est l’incapacité de manipuler directement le nerf optique et de visualiser complètement l’ensemble de la transection. Par conséquent, il y a la possibilité d’une transition incomplète. Cependant, nous avons observé que la confirmation visuelle de la séparation des terminaisons nerveuses au cours de l’étape 5.8 est un indicateur fiable d’une transaction réussie et complète. Si les extrémités nerveuses ne se séparent pas, le repositionnement de la pipette d’injection ou l’augmentation de la pression de l’injection de 50 % devrait fournir une force suffisante pour traverser complètement le nerf.

Par rapport aux méthodes existantes, cette approche préserve l’intégrité de la gaine du nerf optique. En maintenant l’intégrité de la gaine du nerf optique, les extrémités du nerf optique transecté ne sont pas exposées à l’environnement orbitaire et au système immunitaire périphérique, limitant ainsi l’exposition aux facteurs immunitaires qui pourraient potentiellement influencer les réponses RGC. De plus, la préservation de l’intégrité de la gaine du nerf optique tout en traversant le nerf optique crée un espace physique clos délimité par les extrémités du nerf optique et la gaine du nerf optique. L’administration localisée de facteurs neurotrophiques, de cellules ou de polymères dans le compartiment axonal des CGR lésés peut être réalisée en injectant dans l’espace nouvellement formé. ¹⁴ Alternativement, la régénération axonale RGC peut être évaluée dans un modèle de transsection en permettant aux extrémités du nerf optique transecté de s’anastomose sans avoir besoin de techniques microchirurgicales difficiles.

Les applications de cette méthode comprennent l’évaluation du compartiment axonal RGC lésé avec des interventions spécifiques aux axones pour identifier les voies responsables de la dégénérescence axonale et prévenir la perte axonale à la suite d’une lésion de transsection. De plus, cette méthode rend les études de la régénération axonale RGC dans un modèle de transsection accessibles à l’ensemble de la communauté de recherche en supprimant le besoin de procédures d’anastomoses du nerf optique techniquement difficiles. Les interventions visant à promouvoir la régénération des axones RGC pourraient être évaluées avec ce modèle de lésions graves et fournir des résultats cohérents et reproductibles sans se soucier des axones épargnés.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Polyglactin suture	Ethicon	J315H
9-0 Polypropylene suture	Ethicon	1754G
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/kg Stock Concentration: 10 mg/mL Final Concentration: 0.25 mg/mL
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/mL
Anesthesia System	VetEquip	901806
Animal incubator	Precision Incubators	Chick Chalet II
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/mL Final Concentration: 0.5 mg/mL
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150F-4
Colibri forceps	Katena	K5-1500
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35
Heat therapy pump	Kent Scientific	HTP-1500
Isoflurane	Covetrus	29404
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz	RS-7440
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 25 mg/mL
Microinjection system (Picospritzer II)	General Valve, Inc
Microliter syringe 5 µL	Hamilton	88000
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-77 Brown-Flaming
Neomycin/Polymyxin B sulfates/Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	Bausch + Lomb
PBS	Millipore	BSS-1005-B
Povidone-iodine	Healthpets	BET16OZ
Proparacaine hydrochloride 0.5%	Bausch + Lomb
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 mL/injection
Stereotaxic Frame	Kopf
Surgical Microscope	Zeiss
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09
Xylazine	Lloyd	0410	2.5-8 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 5.8 mg/mL