Transecção do nervo óptico com preservação da bainha em ratos para avaliar a regeneração do axônio e intervenções direcionadas ao axônio das células ganglionares da retina

Resumo

Este protocolo descreve uma transecção do nervo óptico que preserva a bainha do nervo óptico em ratos. A pressão hidrostática das microinjeções no nervo óptico gera uma transecção completa, permitindo a reaposição sem sutura das extremidades do nervo óptico seccionadas e o direcionamento direto do compartimento axonal em um modelo de transecção.

Resumo

Os axônios das células ganglionares da retina (RGC) convergem na cabeça do nervo óptico para transmitir informações visuais da retina para o cérebro. Patologias como glaucoma, trauma e neuropatias ópticas isquêmicas lesam os axônios RGC, interrompem a transmissão de estímulos visuais e causam perda de visão. Modelos animais que simulam lesão do axônio RGC incluem paradigmas de esmagamento e transecção do nervo óptico. Cada um desses modelos tem vantagens e desvantagens inerentes. Um esmagamento do nervo óptico é geralmente menos grave que uma transecção e pode ser usado para testar a regeneração do axônio no local da lesão. No entanto, diferenças na força de esmagamento e na duração podem afetar as respostas teciduais, resultando em reprodutibilidade variável e completude da lesão. Com a transecção do nervo óptico, há uma lesão grave e reprodutível que lesiona completamente todos os axônios. No entanto, a transsecção do nervo óptico altera drasticamente a barreira hematoencefálica, violando a bainha do nervo óptico, expondo o nervo óptico ao ambiente periférico. Além disso, a regeneração além de um local de transecção não pode ser avaliada sem reapagar as extremidades nervosas cortadas. Além disso, alterações degenerativas distintas e vias celulares são ativadas por uma lesão por esmagamento ou transecção.

O método descrito aqui incorpora as vantagens dos modelos de esmagamento e transecção do nervo óptico, ao mesmo tempo em que mitiga as desvantagens. A pressão hidrostática fornecida ao nervo óptico por microinjeção atravessa completamente o nervo óptico, mantendo a integridade da bainha do nervo óptico. As extremidades do nervo óptico seccionadas são reposicionadas para permitir ensaios de regeneração do axônio. Uma limitação potencial deste método é a incapacidade de visualizar a transecção completa, uma fonte potencial de variabilidade. No entanto, a confirmação visual de que a porção visível do nervo óptico foi seccionada é indicativa de uma transecção completa do nervo óptico com 90-95% de sucesso. Este método pode ser aplicado para avaliar estratégias de promoção da regeneração axonal em um modelo de transecção ou investigar intervenções que visam os compartimentos axonais.

Introdução

A lesão axonal e a degeneração ocorrem nas células ganglionares da retina (RGCs) após trauma ou em doenças neurodegenerativas, como o glaucoma ^1,2. A perda de RGCs e a interrupção das projeções retinofugais resultam em perda permanente da visão³. Para entender as vias moleculares responsáveis pelos processos degenerativos e desenvolver estratégias para mitigar a perda axonal e RGC ou para regenerar axônios RGC, modelos animais experimentais têm sido usados para simular lesão do nervo óptico, incluindo modelos de esmagamento do nervo óptico e transecção do nervo óptico. Ao selecionar um modelo experimental, deve-se levar em conta as vantagens e desvantagens de cada abordagem, bem como as vias moleculares ativadas pela lesão⁴.

A justificativa para o desenvolvimento do método descrito aqui é aproveitar as vantagens dos modelos de esmagamento do nervo óptico⁵ e transecção⁶ , mitigando as desvantagens. Os objetivos deste método eram gerar uma lesão reprodutível do nervo óptico na qual todos os axônios são seccionados de forma inquestionável e completa, a exposição ao sistema imunológico periférico é minimizada e as extremidades seccionadas do nervo óptico são facilmente reajustadas para permitir a avaliação da regeneração do RGC. Além disso, o método foi desenvolvido para permitir o acesso compartimentado à porção axonal dos RGCs lesionados e para fornecer intervenções específicas do axônio (por exemplo, fatores neurotróficos, transplantes celulares) localmente ao nervo óptico retroorbital.

Existem várias vantagens dessa técnica em relação aos métodos alternativos. Comparado a um esmagamento do nervo óptico, este método atravessa o nervo óptico de forma completa e confiável; Isso aborda um problema potencial de preservação indesejável do axônio⁷. Além disso, o método descrito causa uma lesão axonal grave que não depende da quantidade e duração da força aplicada pelo operador como em uma lesão por esmagamento, reduzindo assim a variabilidade⁸. Em contraste com os métodos estabelecidos de transecção do nervo óptico, a abordagem detalhada neste protocolo mantém a integridade da bainha do nervo óptico. Uma vantagem de preservar a bainha do nervo óptico é que ela evita que o nervo óptico seja exposto ao sistema imunológico periférico. Além disso, as forças mecânicas exercidas pela bainha do nervo óptico no nervo óptico seccionado reafixam as terminações nervosas cortadas sem a necessidade de manipulações microcirúrgicas desafiadoras ^9,10,11. Finalmente, com a bainha do nervo óptico intacta, o método produz um espaço físico entre os cotos do nervo óptico no qual células-tronco, fatores neurotróficos ou polímeros podem ser introduzidos diretamente nos axônios RGC lesionados.

O esmagamento do nervo óptico é o modelo padrão-ouro no qual as estratégias de regeneração do nervo óptico são avaliadas para determinar a eficácia dos tratamentos. O tamanho do nervo óptico do roedor limita as possíveis manipulações, especialmente a transecção e readaptação do nervo. No entanto, no campo da lesão e regeneração da medula espinhal, há consenso de que uma transecção completa é o modelo ideal para distinguir a regeneração axonal do axônio¹² poupado. O método aqui descrito reduz as barreiras técnicas para avaliar estratégias regenerativas em um modelo de transecção do nervo óptico. Como tal, este modelo pode ser usado para validar estratégias promissoras identificadas em paradigmas de esmagamento do nervo óptico com uma transecção do nervo óptico. Além disso, como esse modelo visa diretamente o compartimento axonal, ele permite estudos de intervenções em axônios RGC adultos lesionados e os mecanismos responsáveis pelos processos degenerativos e regenerativos axonais.

O modelo de transecção do nervo óptico descrito neste estudo atravessa completamente o nervo óptico, preservando a bainha do nervo óptico. Essa nova abordagem é apropriada para experimentos que visam avaliar a regeneração do axônio em um modelo de transecção sem a necessidade do processo tecnicamente desafiador de reaposição das extremidades do nervo óptico. Os aspectos da técnica são semelhantes à realização de um esmagamento do nervo óptico; portanto, a abordagem pode ser realizada por operadores experientes com esmagamento do nervo óptico. A abordagem cirúrgica não requer instrumentos especialmente projetados e pode ser completada com instrumentos cirúrgicos prontamente disponíveis e um sistema de microinjeção, tornando-a acessível e econômica.

Protocolo

Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Sistema de Saúde de San Diego. Os instrumentos e soluções cirúrgicas foram esterilizados antes da cirurgia para limitar infecções e complicações pós-operatórias.

1. Técnica cirúrgica

1. Realizar experimentos usando técnicas assépticas e de acordo com protocolos de uso de animais específicos da instituição.
2. Esterilize instrumentos e materiais que entrem em contato com tecidos vivos para prevenir infecções, evitar impactar negativamente o bem-estar animal e minimizar possíveis influências negativas no estudo. Limpe bem os instrumentos cirúrgicos com água e detergente ou produtos enzimáticos para remover materiais estranhos e esterilizar por esterilização a vapor ou flash.
3. Alíquotas de líquidos em recipientes estéreis em uma capa de cultura de tecidos. Esterilize a seringa de microlitro lavando-a com etanol a 70% e enxaguando-a com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).

2. Anestesia

1. Anestesie ratos usando um sistema vaporizador de isoflurano. Vaporize o isoflurano a uma concentração de 4,5% usando oxigênio de grau médico a uma taxa de 1 L/min em uma caixa de anestesia anexada. Coloque o animal na caixa de anestesia até que a respiração diminua e o animal esteja sedado.
   NOTA: Esta etapa inicial usando anestesia com anestésico gasoso não é necessária se o operador estiver confortável e familiarizado com a administração de anestésicos injetáveis a animais não sedados.
2. Retire um volume suficiente de um coquetel anestésico composto de cetamina (50 mg / kg), xilazina (2,6 mg / kg) e acepromazina (0,5 mg / kg) para uma seringa de tuberculina de 30 G. Remova o animal sedado da caixa de anestesia. Administre a injeção de anestesia por via intraperitoneal para atingir uma profundidade consistente de sedação durante todo o procedimento e retorne o animal à sua gaiola.
3. Inicie o procedimento quando um beliscão do dedo do pé não evocar uma resposta. Avalie o animal quanto à profundidade e frequência respiratória e com um beliscão do dedo do pé a cada 5 minutos durante todo o procedimento para garantir a ausência de dor.
4. Após a conclusão da cirurgia, remova o animal da estrutura estereotáxica. Administre uma injeção subcutânea de solução salina (3 mL), ampicilina (0,15-0,2 mg/kg) e banamina (2,5-5 mg/kg) para fornecer analgesia e suporte hídrico. Transfira o animal para uma incubadora aquecida para manter a temperatura corporal.

3. Abordagem cirúrgica

1. Coloque o rato (7 a 8 semanas de idade, cepa Fischer 344) em uma estrutura estereotáxica de cabeça e em cima de uma almofada aquecida. Posicione a estrutura estereotáxica com a cabeça do rato voltada para a esquerda do cirurgião e centralize a órbita esquerda no campo cirúrgico view.
2. No olho esquerdo, aplique uma gota de proparacaína e limpe o olho aplicando iodopovidona a 5% na pálpebra e no olho. Espalhe pomada oftálmica na córnea de ambos os olhos para manter a umidade da córnea e prevenir a formação de catarata.
3. Passe uma sutura de poliglactina 4–0 através da epiderme da pálpebra superior até o aspecto central da margem palpebral, usando esta sutura para uma tarsorrafia temporária em etapas posteriores. Use a sutura para everter a pálpebra e expor o fórnice superior.
4. Prenda a sutura de poliglactina na estrutura estereotáxica para aplicar tração e exposição constantes. Evite tração excessiva, pois isso pode limitar a exposição do conteúdo retroorbital.
5. Usando uma pinça Colibri, eleve a conjuntiva superior e faça uma incisão na conjuntiva ao longo do limbo com uma tesoura Vannas. Faça uma peritomia às 4 horas ao longo do limbo superior.
6. Aplique uma leve tração inferior ao globo colocando uma sutura de polipropileno em laço ao longo do limbo superior com as extremidades livres abaixo do globo. O tecido residual ao longo do limbo superior após a peritomia é suficiente para fornecer tração na alça de sutura sem a necessidade de passar a sutura pela esclera ou limbo.
   1. Prenda as extremidades do laço com um grampo de buldogue e deixe o grampo balançar livremente no ar. O peso da braçadeira aplicará tração inferior no globo e exporá mais o espaço retroorbital.
7. Dissecar sem corte com tesoura de Vannas ao longo da esclera seguindo a face posterior do globo e sob o reto superior. Desinsira os músculos retos superiores do globo cortando o tendão muscular com uma tesoura Vannas para acessar o espaço retroorbital.

4. Acessando o nervo óptico

1. Dissecção romba com pinça Dumont #5/45 ao longo da face temporal do globo posterior e identificação da veia vórtice lateral superior. Dissecar ainda mais a veia do vórtice lateral superior para expor o cone do músculo orbital ao redor do nervo óptico e evitar danos prematuros ao nervo óptico. Evite ferir a veia do vórtice, pois isso pode causar sangramento significativo. Se ocorrer sangramento, um aplicador de ponta de algodão pode ser aplicado até que o sangramento pare.
2. Usando a pinça Dumont #5/45, insira cuidadosamente a ponta no aspecto temporal do cone do músculo orbital e abra a pinça paralelamente ao curso das fibras musculares para revelar o nervo óptico. Use a pinça para deslocar lateralmente as fibras musculares que recobrem o nervo óptico e expor totalmente o nervo. Certifique-se de que apenas a bainha do nervo óptico esteja cobrindo o nervo óptico, pois as fibras musculares residuais impedirão que a pipeta capilar de vidro puxada perfure facilmente o nervo óptico.
3. Mantenha a exposição do nervo colocando duas pinças Dumont # 5/45 ao longo de ambos os aspectos laterais do nervo e abrindo a pinça. A quantidade de exposição deve permitir que o nervo óptico seja esmagado 1,5–2,0 mm posterior ao globo e que uma pipeta capilar de vidro puxada seja inserida no nervo óptico a partir do aspecto dorsal.

5. Travecção do nervo óptico dentro da bainha óptica

1. Usando a pinça Dumont # 5/45, coloque as pontas em ambos os lados do nervo óptico pelo menos 1,5 a 2,0 mm posterior ao globo. Certifique-se de que as pontas da pinça abranjam o diâmetro do nervo. Feche completamente a pinça por 5 s para esmagar o nervo óptico e anote a posição do local do esmagamento.
2. Com uma seringa de microlitro, encha uma pipeta capilar puxada por vidro com 1–2 μL de PBS e conecte a pipeta a um porta-pipeta. Monte o porta-pipetas em um micromanipulador e conecte o micromanipulador na estrutura estereotáxica.
3. Ajuste o sistema de microinjeção para fornecer um único pulso de 4 ms de duração a uma pressão de 20 psi a cada toque no botão. Posicione a pipeta no campo cirúrgico.
4. Sob o escopo cirúrgico, use uma pinça # 55 para quebrar e chanfrar a ponta da pipeta em um tamanho (~ 20–30 μm de diâmetro) capaz de fornecer um volume pequeno, mas grande o suficiente para fornecer rigidez suficiente para penetrar na bainha do nervo óptico. Confirme a permeabilidade da ponta da pipeta dando um único pulso e observando o fluido na ponta da pipeta.
5. Refine a posição da ponta da pipeta logo acima do local do esmagamento do nervo óptico no centro do nervo óptico e em contato com a bainha do nervo óptico. Observe a posição vertical da pipeta no micromanipulador para determinar posteriormente uma profundidade de 200 μm.
6. Abaixe a pipeta enquanto observa a ponta sob o escopo cirúrgico até que a pipeta entre no nervo óptico. Se a ponta da pipeta dobrar e não tiver rigidez para penetrar na bainha do nervo óptico, retraia a pipeta e use uma pinça #55 para diminuir o comprimento e aumentar o diâmetro da ponta da pipeta. Uma vez feitos os ajustes na ponta da pipeta, tente penetrar novamente na bainha do nervo óptico com a pipeta.
7. Ao entrar no nervo óptico com a ponta da pipeta, retraia a pipeta, se necessário. A posição da ponta da pipeta, conforme indicado pelo micromanipulador estereotáxico, deve estar 200 μm abaixo da superfície do nervo óptico a partir da posição inicial indicada na etapa 5.5.
8. Enquanto observa o nervo óptico sob o escopo cirúrgico, aplique pulsos de pressão hidrostática com o sistema de microinjeção. À medida que os pulsos são aplicados, uma separação linear entre as extremidades distal e proximal do nervo óptico deve ser observada para verificar a transecção do nervo óptico.
   NOTA: O volume de injeção de 250–500 nL é geralmente suficiente para fornecer a força necessária para atravessar o nervo óptico. Injeções que requerem mais de 1 μL podem indicar a necessidade de reposicionar o local da injeção. Volumes maiores injetados no parênquima intacto podem não causar danos adicionais ao RGC, uma vez que o método atravessa completamente o nervo óptico, mas é mais provável que rastreie ao longo dos fascículos do nervo óptico. A não observação de uma transecção linear do nervo óptico, apesar da injeção de um volume de fluido suficiente, provavelmente indica posicionamento incorreto da pipeta no local do esmagamento e necessidade de reposicionamento. Um aumento de 50% na pressão de injeção também pode ser necessário.

6. Fechamento e recuperação

1. Retraia a pipeta e remova a pinça Dumont #5/45 retrátil. Retorne o olho para uma posição neutra removendo a braçadeira bulldog e a sutura de polipropileno em loop do globo.
2. Reposicione a conjuntiva no limbo da córnea, garantindo a liberação de qualquer conjuntiva que tenha se invertido para permitir a aposição adequada do tecido e a cicatrização. Aplique pomada antibiótica tópica oftálmica no olho.
3. Remova a fita da sutura de poliglactina 4–0 da pálpebra e mantenha a sutura no lugar para uso em uma tarsorrafia temporária. Passe a sutura pela margem palpebral da pálpebra inferior, pela área subcuticular inferiormente e saindo pela epiderme. Amarre a sutura com pressão suficiente para fechar o olho.
4. Administrar analgésicos pós-cirúrgicos de acordo com os protocolos institucionais e as diretrizes da autoridade de cuidados com os animais. Alojar o animal de forma independente em uma gaiola aquecida para se recuperar após a cirurgia. Não coloque a cama na gaiola de recuperação para evitar aspiração acidental.

Resultados

A transecção do nervo óptico geralmente resulta na perda apoptótica de 80 a 90% dos RGCs lesionados dentro de 14 dias após a lesão. A técnica descrita atravessa o nervo óptico enquanto mantém a integridade da bainha do nervo óptico (Figura 1). O grau de perda de RGC é comparável aos modelos tradicionais de transecção do nervo óptico e esmagamento do nervo óptico, com a vantagem de que as extremidades nervosas cortadas são facilmente opostas após a transecção com o método descrito aqui (Figura 2). A reconexão das extremidades do nervo óptico cortadas dessa maneira permite a avaliação da regeneração axonal do RGC em um modelo de transecção, fornecendo um substrato no qual os axônios podem crescer e sem a necessidade de manipulação microcirúrgica para reconectar as extremidades nervosas cortadas (Figura 3). O traçado anterógrado dos axônios RGC com a subunidade B da toxina da cólera (CTB) demonstra que os axônios positivos para CTB são completamente seccionados após uma bainha preservando a transecção do nervo óptico (Figura 4). Preservar a bainha do nervo óptico durante a travsecção do nervo óptico também cria um espaço fechado no qual materiais investigativos, como fatores neurotróficos ou células, podem ser entregues aos axônios RGC lesionados e mantidos na posição (Figura 5). Durante as fases iniciais do treinamento, há uma taxa de sucesso esperada de 60-70% da transecção total. Com a experiência, a taxa de sucesso da transecção total é de aproximadamente 90-95%.

Figura 1: Seccionando o nervo óptico preservando a bainha do nervo óptico. (A) Imagem do campo cirúrgico demonstrando a exposição do nervo óptico intacto antes da transecção. (B) Imagem do nervo óptico após a transecção. Uma pipeta de vidro fino perfurou a bainha do nervo óptico no local da transecção e aplicou uma suspensão celular (solução turva) no espaço entre as extremidades do nervo óptico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Perda de células ganglionares da retina após uma bainha do nervo óptico preservando a transecção do nervo óptico. Montagens planas representativas de toda a retina de olhos com (A) um nervo óptico intacto, (B) uma bainha do nervo óptico preservando a transecção do nervo óptico, (C) uma transecção tradicional do nervo óptico ou (D) esmagamento do nervo óptico 14 dias antes foram imunomarcadas para gama-sinucleína (SNCG). As imagens foram obtidas de um microscópio de fluorescência usando uma objetiva de 10x, corrigidas para sombreamento e costuradas para gerar uma única imagem. A perda de corpos de células ganglionares da retina (RGC) em toda a retina foi aparente nos olhos lesionados. As inserções mostram imagens de maior ampliação da retina e demonstram perda significativa de RGCs após lesões do nervo óptico. (E) A quantificação da sobrevida do RGC demonstra perda significativa do RGC após lesões do nervo óptico em comparação com os nervos ópticos intactos de controle. *p< 0,05 em comparação com intacto; ANOVA de uma via com teste post-hoc de Tukey. n = 3 animais por grupo; barras de erro representam SD. SP-ONT, transecção do nervo óptico com preservação da bainha; ONT, transecção do nervo óptico; ONC, esmagamento do nervo óptico. Barras de escala = 1.000 μm. Barras de escala em inserções = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Seções de nervos ópticos após lesões do nervo óptico. Imagens representativas de secção longitudinal através dos nervos ópticos 14 dias após (A-C) uma bainha do nervo óptico preservando a transecção, (D-F) transecção tradicional do nervo óptico ou (G-I) esmagamento do nervo óptico. (A, D, G) A imunomarcação para proteína ácida fibrilar glial (GFAP) delineia a extensão da lesão, enquanto a marcação de DNA (B, E, H) com 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) demonstra celularidade contígua ao longo do comprimento do nervo óptico e dentro do local da lesão. (C, F, I) Imagens mescladas demonstrando localização de tecido neural positivo para GFAP e celularidade no local da lesão. Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Secção de um nervo óptico após uma bainha do nervo óptico preservando a transecção do nervo óptico. Imagens representativas de um corte longitudinal através de um nervo óptico 14 dias após uma bainha do nervo óptico preservando a transecção com traçado anterógrado do axônio com uma injeção intravítrea da subunidade B da toxina da cólera (CTB). (A) Pode ser observada lesão completa dos axônios RGC marcados com CTB que se estendem do globo (esquerda) em direção ao cérebro (direita). (B) A imunomarcação para proteína glial fibrilar ácida (GFAP) delineia uma lesão extensa que envolve todo o diâmetro do nervo óptico. (C) A marcação de DNA com 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) demonstra celularidade dentro do local da lesão. (D) Uma imagem mesclada demonstrando a localização de axônios marcados com CTB, tecido neural positivo para GFAP e celularidade no local da lesão. Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Corte longitudinal de um nervo óptico seccionado que recebeu um enxerto de células. Imagens representativas de um corte longitudinal através de um nervo óptico 14 dias após uma bainha do nervo óptico preservando a transecção e o transplante de células-tronco neurais (NSCs) expressando a proteína fluorescente tdTomato. (A) A imunomarcação para proteína glial fibrilar ácida (GFAP) demonstrou separação completa das extremidades do nervo óptico seccionadas. (B) NSCs expressando tdTomato estavam contidos no espaço criado pela técnica descrita e continuaram a sobreviver após o transplante. (C) As NSCs enxertadas foram diretamente colocadas em ambas as extremidades cortadas do nervo óptico seccionado. Barras de escala, 200 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Procedimentos cirúrgicos que descrevem o modelo de transecção do nervo óptico foram publicados anteriormente⁶. No entanto, as técnicas detalhadas nesses protocolos envolvem a incisão da bainha meníngea para transeccionar o nervo óptico. Além disso, para avaliar a regeneração do axônio RGC em modelos de transecção anteriores, manipulações microcirúrgicas desafiadoras foram necessárias para apor as extremidades do nervo óptico cortadas ou um enxerto de nervo periférico ao coto do nervo óptico proximal^10,13. O protocolo descrito aqui interrompe minimamente a bainha do nervo óptico durante a transsecção do nervo óptico e permite avaliações da regeneração do axônio RGC em um modelo de transecção sem a necessidade de manipulações microcirúrgicas tecnicamente desafiadoras.

Várias etapas são críticas neste protocolo. Deve-se tomar cuidado para evitar danos à artéria oftálmica e à vasculatura que irriga a cabeça do nervo óptico. Portanto, a etapa 5.1 deve ser concluída pelo menos 1,5-2,0 mm posterior ao globo. Se ocorrer dano à artéria oftálmica e interromper o suprimento sanguíneo da retina, o olho deve ser excluído de outros experimentos, pois é provável que a tísica ocorra. Durante as etapas 5.4-5.6, é importante manter a integridade da bainha do nervo óptico e minimizar o tamanho da abertura através da qual a pipeta de vidro entra no nervo óptico. Isso forma uma vedação hermética ao redor da ponta da pipeta para reduzir o refluxo de fluido e permite a geração de pressão hidrostática suficiente para atravessar o nervo óptico. Chanfrar a ponta das pipetas de vidro melhorará a facilidade com que a pipeta entra no nervo óptico sem causar danos colaterais.

Existem modificações potenciais que os operadores podem fazer para melhorar a acessibilidade desse método. Os procedimentos descritos envolvem dissecção e remoção mínimas de tecido orbitário com preservação do nervo facial e trigêmeo. Embora isso reduza a morbidade e os riscos de sangramento, tecidos como a gordura orbital e a glândula lacrimal podem limitar a visualização de estruturas cruciais. A remoção cuidadosa do tecido que obstrui o campo cirúrgico pode ser necessária para melhorar a visualização, especialmente em animais mais velhos. Uma abordagem lateral também pode ser usada para melhorar o acesso ao nervo óptico. No entanto, uma dissecção lateral corre o risco de danificar estruturas adicionais, incluindo o nervo trigêmeo, é mais envolvida e pode apresentar seus próprios desafios para direcionar a instrumentação para injeções.

Uma possível limitação desse método é a incapacidade de manipular diretamente o nervo óptico e visualizar completamente toda a transecção. Portanto, existe a possibilidade de uma transecção incompleta. No entanto, observamos que a confirmação visual da separação das terminações nervosas durante a etapa 5.8 é um indicador confiável de uma transecção completa e bem-sucedida. Se as terminações nervosas não se separarem, o reposicionamento da pipeta de injeção ou o aumento da pressão da injeção em 50% devem fornecer força suficiente para atravessar completamente o nervo.

Com relação aos métodos existentes, essa abordagem preserva a integridade da bainha do nervo óptico. Ao manter a integridade da bainha do nervo óptico, as extremidades do nervo óptico seccionado não são expostas ao ambiente orbital e ao sistema imunológico periférico, limitando assim a exposição a fatores imunológicos que poderiam influenciar as respostas do RGC. Além disso, preservar a integridade da bainha do nervo óptico durante a travsecção do nervo óptico cria um espaço físico fechado delimitado pelas extremidades do nervo óptico e pela bainha do nervo óptico. A entrega localizada de fatores neurotróficos, células ou polímeros ao compartimento axonal dos RGCs lesionados pode ser alcançada injetando-se no espaço recém-formado. ¹⁴ Alternativamente, a regeneração do axônio RGC pode ser avaliada em um modelo de transecção, permitindo que as terminações do nervo óptico seccionadas se anastomosem sem a necessidade de técnicas microcirúrgicas desafiadoras.

As aplicações deste método incluem a avaliação do compartimento axonal RGC lesado com intervenções específicas do axônio para identificar as vias responsáveis pela degeneração axonal e prevenir a perda axonal após uma lesão de transecção. Além disso, este método torna os estudos de regeneração axonal RGC em um modelo de transecção acessíveis à comunidade de pesquisa mais ampla, eliminando a necessidade de procedimentos de anastomoses do nervo óptico tecnicamente difíceis. Intervenções com o objetivo de promover a regeneração do axônio RGC podem ser avaliadas com este modelo de lesão grave e fornecer resultados consistentes e reprodutíveis sem a preocupação com axônios poupados.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Polyglactin suture	Ethicon	J315H
9-0 Polypropylene suture	Ethicon	1754G
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/kg Stock Concentration: 10 mg/mL Final Concentration: 0.25 mg/mL
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/mL
Anesthesia System	VetEquip	901806
Animal incubator	Precision Incubators	Chick Chalet II
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/mL Final Concentration: 0.5 mg/mL
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150F-4
Colibri forceps	Katena	K5-1500
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35
Heat therapy pump	Kent Scientific	HTP-1500
Isoflurane	Covetrus	29404
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz	RS-7440
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 25 mg/mL
Microinjection system (Picospritzer II)	General Valve, Inc
Microliter syringe 5 µL	Hamilton	88000
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-77 Brown-Flaming
Neomycin/Polymyxin B sulfates/Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	Bausch + Lomb
PBS	Millipore	BSS-1005-B
Povidone-iodine	Healthpets	BET16OZ
Proparacaine hydrochloride 0.5%	Bausch + Lomb
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 mL/injection
Stereotaxic Frame	Kopf
Surgical Microscope	Zeiss
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09
Xylazine	Lloyd	0410	2.5-8 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 5.8 mg/mL