ラットにおける脛表筋前筋の最大等角体テタニック力測定

要約

運動回復の評価は、実験的末梢神経研究におけるベンチマーク結果測定のままである。ラットの脛骨前筋の等角体テタニック力測定は、坐骨神経欠損の再建後の機能的転帰を評価するための非常に貴重なツールである。方法とニュアンスについては、この記事で詳しく説明します。

要約

外傷性神経損傷は実質的な機能的損失をもたらし、分節神経欠損はしばしば自家介在神経移植片の使用を必要とする。その限られた可用性と関連するドナー側の罹患率のために、神経再生の分野での多くの研究は、セグメント神経ギャップを埋めるために代替技術に焦点を当てています。外科的または薬理学的な治療選択肢の結果を調べるため、ラット坐骨神経モデルは、しばしばバイオアッセイとして使用される。ラットモデルでは、神経再生の程度を決定するために使用されるさまざまな結果測定があります。標的筋肉の最大出力力は、実験療法の臨床翻訳に最も関連する結果のままである。テタニック筋収縮の等角力測定は、以前ラットおよびウサギモデルの神経損傷または修復後の運動回復を評価するための再現性と有効な技術として説明されている。本ビデオでは、最適化されたパラメータを用いたラット坐骨神経欠損モデルにおける脛骨筋前筋の機能的回復の評価に関するこの貴重な手順のステップバイステップの指示を提供する。我々は、一般的な腹膜神経および脛骨前筋腱の外科的アプローチおよび解剖に加えて、必要な手術前の準備について説明する。アイソメトリックテタニック力測定技術について詳しく説明します。最適な筋肉長および刺激パルス周波数を決定することが説明され、最大のテタニック筋収縮を測定することが実証される。

概要

外傷性末梢神経損傷後の運動機能の喪失は、患者^1、2、3の生活の質と社会経済的地位に大きな影響を与^える。この患者集団の予後は、年間⁴年間の外科的技術の最小限の改善のために貧弱なままである。直接エンドツーエンドの緊張のない上音の修復は、ゴールドスタンダードの外科的再建を形成する。しかし、神経のギャップが延長された場合には、自家神経移植片の間付き合いが優れている^5,6.関連するドナー部位の罹患率および自家神経移植片の限られた利用可能性は、代替技術^7、8の必要性を課している。

実験動物モデルは末梢神経再生のメカニズムを解明し、様々な再建および薬理学的治療の選択肢^8,9の結果を評価するために用いられてきた。ラット坐骨神経モデルは、最も頻繁に使用される動物モデル¹⁰である。彼らの小さなサイズは、彼らが扱いやすく、家に簡単になります。その最上級の神経再生の可能性のために、介入と結果の評価の間の時間の減少は、比較的低いコスト^11、12をもたらすことができます。その使用の他の利点は、人間の神経線維との形態学的類似性と比較/歴史的研究の数が多い¹³.後者は慎重にアプローチする必要がありますが、研究間のさまざまな結果対策が異なっているため、結果14、15、16、17、18を比較することが困難になります。

神経再生を評価する結果対策は、電気生理学から所因性学までさまざまであるが、これらの方法は相関を意味するが、必ずしも運動機能^14,15の戻り値を直接測定するわけではない。神経線維を再生すると、機能接続^数を過大評価する可能性のある適切な接続が行われなくなる可能性があります^14,15,19,20.末端器官の正しい再インナーブを実証するための最良かつ臨床的に最も関連性の高い測定は、筋肉機能^21、22、23の評価のままである。しかし、動物モデルのための運動機能評価ツールの作成は困難です。Medinaceliら.は、最初に歩行トラック解析について説明し、それ以来、実験的末梢神経研究21、24、25、26、27、28において機能的回復を評価するために最も頻繁に使用されてきた方法である。歩行軌跡解析では、歩行ラット^21,29からのポープリントの測定値に基づいて坐骨機能指数(SFI)を定量化する。歩行軌跡解析の大きな制限事項は、例えばつま先拘縮、自動切断、印刷物の塗り付け、および他の再収縮の尺度との不十分な相関、機能回復^30、31の定量化のための他のパラメータの使用を必要としている。

ルイスラット³²およびニュージーランドウサギ³³の以前の研究では、脛骨前(TA)筋の等角体テタニック力(ITF)測定を検証し、異なるタイプの神経修復34、35、36、37、38、39後の筋肉回復の評価においてその有効性を実証した。TA筋肉は、その比較的大きなサイズ、坐骨神経の腹膜枝によるインナーブ及び十分に解明された生化学的特性^{40、41、42、43}のために適^している。筋肉長(プリロード力)および電気的パラメータが最適化されると、ITFはラット³²およびウサギ³³においてそれぞれ4.4%および7.5%の左右変動を提供する。

本稿では、必要な手術前計画、外科的アプローチ、共通の骨膜神経および遠位TA筋腱の解剖の詳細な説明を含む、ラット坐骨神経モデルにおけるITF測定の詳細なプロトコルを提供する。刺激強度と持続時間に対して所定の値を用い、最適な筋肉長と刺激脈拍周波数が定義される。これら4つのパラメータを使用すると、ITFは一貫して正確に測定できます。

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プロトコル

すべての動物の処置は、制度的動物の世話と使用委員会(IACUC A334818)の承認を得て行われた。

1. 力変換器の校正

1. コンピュータがUSB-6009多機能I/Oデータ収集(DAQ)デバイスに正しく接続されていることを確認します。
   注:他のラット株や種は、より高い力が ⁴⁴を期待されるように、異なるロードセル力トランスデューサを必要とするかもしれません。
2. 変更された外科用止めから作られたカスタムクランプを真空ベース調節可能なレバーアームに取り付けられた力のトランスデューサーに取付ける。
   注:カスタムメイドのクランプは、テンションの調整を可能にする締め付けネジで変更された外科用止めで構成されています(図1)。
3. テーブルの上に、ラットの後肢の固定のための2つの木製のブロックを含むカスタムメイドのアクリルガラス試験プラットフォームを、配置します。
   注:ウレタンなどの他の材料は、K線が浸透し、固定することができる限り、木材の代わりに使用することができます。
4. 真空ベースを使用して、クランプ、力トランスデューサ、調節可能なレバーアームの組み合わせをテストプラットフォームに垂直に取り付けます。
5. キャリブレーションウェイトのクランプにフックまたはループを固定します。
6. コンピュータの電源を入れ、ソフトウェアを開きます(LabVIEWなど)。
7. ソフトウェアが開いたら、ITF測定用のカスタムメイドの仮想計測器(VI)を起動します(図2)。
   注: 図 2 には、VI スニペット内の LabVIEW コードが含まれています。このVIスニペットはLabVIEWのブロックダイアグラムにドラッグできます。自動的にグラフィカルコードに変換されます。この実験では、サンプリングレートは2000 Hzに設定され、各反復で読み取るサンプルは25個でした。
8. 左上の白い矢印を押してVIを実行し、[ 新しいキャリブレーション]を選択します。新しいウィンドウが開きます。
9. キャリブレーションプロセスをゼロウェイト(フックまたはループが付いているクランプのみ)で開始し 、OKを押します。
10. 連続して、10、20、30、50グラムの体重を加え、各重量測定の間に OKを 押します。
11. 5 つの測定値がすべて収集されたら、[ プロセス] をクリックします。
12. VIのグラフに正の直線曲線が表示されている場合にのみ値を受け入れます(図3)。
13. テストプラットフォーム上でクランプ、力トランスデューサ、調節可能なレバーアームの組み合わせを水平に再配置します。これはITFの測定に使用される位置になります。
14. ゼロをクリックすると、ウィンドウが自動的に閉じます。

2. 動物の対象

1. 300-500 gの間の重量を量る雄のルイスラットを使用してください。
   注:神経再生の比較のために、オートトミーの重量と発生率は緊張に依存し、ITF^{10、32、45、46、47}の結果に大きな影響を与えることができるので、対照群と実験群の両方で同じラット株を使用することが不可欠です。

3. 手術準備

1. 手術前に必要なすべての手術器具を準備する (材料表).
2. 動物の体重を量って麻酔の必要量を決定する。
3. ラットを酸素中の3%イソフルランでガスを入れたチャンバーに入れることで麻酔を誘発する。
4. 腹腔内注射による1mL/kg体重の投薬量で10部ケタミン(100mg/mL)と1部のキシラジン(100mg/mL)のカクテルを使用してラットを深く麻酔します。つま先ピンチへの応答に基づいて、呼吸速度を観察することによって麻酔の深さを監視します。
5. ケタミン/キシラジンカクテルの最初の投与から約30分後に、ケタミン(100mg/mL)のみの体重を腹腔内に0.3-0.6 mL/kgの補助用量で投与し、全手順を通じて十分な麻酔を維持する。
   注意:過剰摂取は打ち消すことができないので、必要な麻酔を細心の注意を払って投与することが重要です。
6. 慎重に電気バリカンを使用してラットの後ろ足を剃ります。
7. 37°Cで体温を維持するために、加熱パッド上のラットを起こしやすい位置に置きます。 任意に、体温は直腸温度計を使用して監視することができる。
8. ラットの首の上の緩い皮膚に皮下0.9%の塩化ナトリウム(NaCl)の5 mLを注入し、手順全体を通して十分な水分補給状態を維持します。
9. この処置の非生存の性質のために、外科分野および器械は無菌である必要はない。外科医は、個人保護具(PPE)を使用する必要があり、外科ルーペは、解剖学的構造の適切な可視化のために助言される。

4. 共通の腹膜神経への外科的アプローチ

1. どちら側を最初に測定するかに応じて、ラットを右または左側のリカンベント位置に置きます。
2. 手術用15本刃を用いて大腿骨から大腿部に平行な後側面大腿部の皮膚に2〜3cmの切開を作成する。
3. 上腕二頭筋と大腿骨筋と大殿筋と広大な外側筋の間の平面を特定し、これらの筋肉を分離し、下層の坐骨神経を露出させるために、耳切りハサミを使用して鈍い解剖を行う。
4. 坐骨神経の三切れを見つけ、より良いアクセスを得るためにレトラクターを配置します。坐骨神経の3つの枝には、共通の腹膜神経、脛骨神経および腹膜神経が含まれる。
5. 湾曲した微小手術鉗子を用いて坐骨神経の共通の腹腔神経枝(通常最も腹側枝)を単離する。
   注意:不確実性の場合は、外科的神経刺激器で孤立した神経を優しく刺激し、運動応答を観察します。共通の腹膜神経の刺激は、足の回反射をもたらす。

5. 遠位脛筋前筋腱の解剖

1. TA筋肉とその挿入を露出させるために、下肢の前部側の側面で皮膚を切開し、膝関節から始まり、後足の細色面に下降する。
2. 外科用刃no.15のメスを用いて周囲の組織から遠位TA筋腱を解剖する。
3. 蚊の鉗子を使用して、挿入に向かってTA筋肉腱をぶっきらぼうに解剖し、腱を可能な限り遠位に切る。近位TA筋肉を邪魔しないで、神経血管ペディクルを維持する。
   注:定期的に(約5分ごと)、加熱された0.9%NaCl(37°C)でTA筋肉を湿らせ、冷却と乾燥を防ぎます。

6. アイソメトリックテタニック力測定

1. バイポーラ電極ケーブルとグランドケーブルを色に応じてバイポーラ刺激装置に接続します。
2. 双極電極ケーブルのもう一方の端をサブミニチュア電極に取り付けます。
   注:参照電極(赤、陽極)は遠位と活性電極(黒、陰極)近位に配置する必要があります。
3. 動物を加熱パッドと一緒にテストプラットフォームに移します。
4. 足首を通して2本の1mmキルシュナーワイヤーと膝の後部側面を避ける遠位大腿骨の側面顆を使用して、ラットの後肢を木製のブロックに固定します。
   注意:大腿骨顆にドーサリーに位置する大窩動脈および静脈への血管損傷を避けてください。
5. 真空ベースを使用して、カスタムクランプ付きホルダーをテストプラットフォームに取り付けます。
6. 遠位TA筋腱を力トランスデューサに取り付けられたクランプに固定します。
   注:クランプと力のトランスデューサは、TA筋肉の経過に平行に配置する必要があります。
7. 共通の腹膜神経にアクセスするために、ラットの後方腿にレトラクターを置きます。
   注意:坐骨神経とその枝は、冷却および乾燥を防ぐために、加熱された0.9%NaCl(37°C)で湿った状態に保つ必要があります。
8. 周囲の筋肉(例えば、広大な外側筋)にグランドケーブルを挿入します。
   注:Grass SD9刺激装置は電気的なアーチファクトを減らすためにアースケーブルを必要とします。新しい刺激装置は余分な接地ケーブルを必要としないかもしれない。
9. 共通の骨膜神経をサブミニチュア電極にフックし、プラットフォーム上のホルダーを使用して位置を固定します(図4)。
   メモ:共通の腹膜神経だけがサブミニチュア電極に引っ掛かっていることを確認してください。
10. 筋肉の長さの最適化
    1. バイポーラ刺激装置をオンにして設定を調整する:正方形の単橋パルス、遅延2 ms、刺激パルス持続時間0.4ms、刺激強度2V。
       注: 遅延は、同期アウトパルスとパルスのリーディングエッジの配信との間の時間を決定します。
    2. [パラメータテスト]を選択し、VIで[トリガーコレクション]をオンにします。
    3. 力トランスデューサに取り付けられたレバーアームを調整して、筋肉の長さ(プリロード)を長くします。
    4. プリロードの10gから始め、最大の活性筋力が決定されるまで10gの増分を使用する。
    5. プリロードごとに、バイポーラ刺激装置のボタンを使用して、2つの単一のツイッチを直接次々に適用します。出力は画面上に表示され、ラットは足の反射を示す必要があります。
       注:神経を刺激する前に、常に綿の先端アプリケーターを使用して神経を取り囲む余分な0.9%NaClを取り除き、周囲の組織に信号が伝導しないようにしてください。
    6. 測定を停止するには、VIで トリガコレクション を再度押します。
    7. プログラムが 2 つのピーク出力力を自動的に検出した場合は 、[Accept ]をクリックします。プログラムがこれらの出力力を自動的に選択しない場合は、[ 拒否] を押して、手動でピークを選択します。2つのピーク出力力は平均ピーク出力力(図5)に平均化されます。
    8. 平均ピーク出力力からプリロードを差し引いて、アクティブな筋肉力を計算します。
    9. 各プリロードのアクティブフォースを書き留めてトレンドを可視化し、最大アクティブフォースを認識します(図6)。スプレッドシートも使用できます。
11. 等角体のテタニック力の測定
    1. 理想的な筋肉の長さを決定した後, テタニック筋収縮を開始する前に5分間、ゼロプリロードで筋肉を休ませます.
    2. 一方 、VIのパラメータテスト から 周波数テスト に切り替え、バイポーラ刺激装置で刺激強度を10Vに調整します。
    3. 遅延と刺激パルスの持続時間をそれぞれ 2 ms と 0.4 ミリ秒に保ちます。
    4. 最大力高原が観察されるまで30Hzの増分で30Hzから始まる刺激周波数を増加させることによって、等角体のテタニック筋力を測定する。
    5. トリガーコレクションをクリックし、所定の最適な筋肉の長さに設定します。
    6. バイポーラ刺激装置の 「繰り返し 」ボタンを押して、最大5秒間、または力のピークが明確に観察されるまで、テタニック刺激を誘導します。
       注:神経を刺激する前に、常に綿の先端アプリケーターを使用して神経を取り囲む余分な0.9%NaClを取り除き、周囲の組織に信号が伝導しないようにしてください。
    7. データを収集するには、 トリガコレクション をもう一度押して、最大出力力を記録します。プログラムが自動的に最大出力の最大出力力を検出しない場合は、 拒否 を押して、手動でピークを選択します。
    8. 次のテタニック筋収縮を開始する前に、5分間ゼロプリロードで筋肉を再び休ませます。
       注:定期的に(約5分ごとに)、加熱された0.9%NaCl(37°C)でTA筋肉を湿らせ、冷却と乾燥を防ぎます。
    9. 最大力の高原に達するまで刺激周波数を増加させ続けます。力の台は最大等角体の鉄板力として定義されます。
       注:このステップの後、K線を取り外し、皮膚をステープルまたは縫合し、手順4から、反対側の後肢に手順全体を繰り返します。

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結果

ITF測定には5つのパラメータが使用されます。これらには、筋肉の緊張(プリロード力)、刺激強度(電圧)、刺激パルス周波数、0.4 msの刺激持続時間および2msの遅延が含まれる。ITFを測定する前に、最適な筋肉の緊張は、パラメータテスト中に2Vの強度で2つの単一のけいれん筋収縮を使用して決定する必要があります。これらの刺激は足の屈折を引き起こし、VI(図5)のグラフ...

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ディスカッション

このプロトコルは、ラットモデル³²におけるTA筋肉の正確な最大ITF測定を取得するための、事前に検証された方法を記述する。実験的な神経再建治療後の最大強度の回復は、神経が再生するだけでなく、目標筋肉との作業関係を作ったことも証明するので、臨床現場の第一の関心事です。ITFは、ラット坐骨神経モデル³²のような小さな神経ギャップモデルで?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA	G130203
1 mm Kirshner wires	Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ	N/A
Adson Tissue Forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	MTK-6801226
Bipolar electrode cables	Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Bipolar stimulator device	Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Cotton-tip Applicators	Cardinal Health, Waukegan, IL, USA	C15055-006
Curved Mosquito forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	MTK-1201112
Force Transducer MDB-2.5	Transducer Techniques, Temecula, CA	N/A
Gauze Sponges 4x4	Covidien, Mansfield, MA, USA	2733
Ground cable	Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Isoflurane chamber	N/A	N/A	Custom-made
Ketamine	Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ	42023-115-10
LabView Software	National Instruments, Austin, TX
Loop	N/A	N/A	Custom-made
Microsurgical curved forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	JFA-5B
Microsurgical scissors	ASSI, Westbury, NY, USA	SAS-15R-8-18
Microsurgical straight forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	JF-3
Retractor	ASSI, Westbury, NY, USA	AG-124426
Scalpel Blade No. 15	Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA	371115
Slim Body Skin Stapler	Covidien, Mansfield, MA, USA	8886803512
Subminiature electrode	Harvard Apparatus, Holliston, MA	N/A
Surgical Nerve Stimulator	Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA	9094
Terrell Isoflurane	Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA	H961J19A
Testing platform	N/A	N/A	Custom-made
Tetontomy Scissors	ASSI, Westbury, NY, USA	ASIM-187
Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S407992
USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device	National Instruments, Austin, TX	779026-01
Vacuum Base Holder	Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal	N/A	Attached clamp is custom-made
Weight (10 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820010.4
Weight (20 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820020.4
Weight (50 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820050.4
Xylazine	Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada	1XYL002