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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La valutazione del recupero motorio rimane la misura di risultato di riferimento negli studi sperimentali sui nervi periferici. La misurazione della forza tetanica isometrica del muscolo tibiale anteriore nel ratto è uno strumento inestimabile per valutare gli esiti funzionali dopo la ricostruzione dei difetti nervosi sciatici. I metodi e le sfumature sono dettagliati in questo articolo.

Abstract

Le lesioni nervose traumatiche si traducono in una sostanziale perdita funzionale e difetti nervosi segmentali spesso richiedono l'uso di innesti nervosi di interposizione autologa. A causa della loro limitata disponibilità e della morbilità laterale associata del donatore, molti studi nel campo della rigenerazione nervosa si concentrano su tecniche alternative per colmare un gap nervoso segmentale. Al fine di indagare i risultati delle opzioni di trattamento sperimentale chirurgico o farmacologico, il modello di nervo sciatico del ratto è spesso usato come saggio biologico. Esistono una varietà di misurazioni dei risultati utilizzate nei modelli di ratto per determinare l'estensione della rigenerazione nervosa. La forza massima di uscita del muscolo bersaglio rimane il risultato più rilevante per la traduzione clinica di terapie sperimentali. La misurazione isometrica della forza della contrazione muscolare tetanica è stata precedentemente descritta come una tecnica riproducibile e valida per valutare il recupero motorio dopo la lesione nervosa o la riparazione sia nei modelli di ratto che di coniglio. In questo video, forniremo un'istruzione passo-passo di questa procedura inestimabile per la valutazione del recupero funzionale del muscolo anteriore tibiale in un modello di difetto del nervo sciatico del ratto utilizzando parametri ottimizzati. Descriveremo i necessari preparati pre-chirurgici oltre all'approccio chirurgico e alla dissezione del comune nervo peroneale e del tendine muscolare anteriore tibialis. La tecnica di misurazione della forza tetanica isometrica sarà dettagliata. Viene spiegato determinare la lunghezza muscolare ottimale e la frequenza dell'impulso di stimolo e misurare la massima contrazione muscolare tetanica.

Introduzione

La perdita della funzione motoria a seguito di lesioni traumatiche del nervo periferico ha un impatto significativo sulla qualità della vita e sullo statosocioeconomico dei pazienti 1,2,3. La prognosi di questa popolazione di pazienti rimane scarsa a causa di miglioramenti minimi nelle tecniche chirurgiche nel corso degli anni4. La riparazione epineurale diretta end-to-end senza tensione forma la ricostruzione chirurgica gold standard. Tuttavia, nei casi con intervalli nervosi estesi l'interposizione di un innesto nervoso autologo si è dimostratasuperiore a 5,6. La morbilità del sito donatore associato e la limitata disponibilità di innesti nervosi autologi hanno imposto la necessità di tecniche alternative7,8.

Modelli animali sperimentali sono stati utilizzati per chiarire il meccanismo di rigenerazione dei nervi periferici e per valutare i risultati di una varietà di opzioni di trattamento ricostruttivo efarmacologico 8,9. Il modello di nervo sciatico del ratto è il modello animale10 più frequentemente utilizzato. Le loro piccole dimensioni li rendono facili da maneggiare e ospitare. A causa del loro potenziale neuroregenerativo superlativo, il tempo ridotto tra l'intervento e la valutazione dei risultati può comportare costirelativamente inferiori 11,12. Altri vantaggi del suo uso includono somiglianze morfologiche con le fibre nervose umane e l'alto numero di studi comparativi / storici13. Sebbene questi ultimi debbano essere avvicinati con cautela, poiché un'ampia varietà di diverse misure di risultato tra gli studi rende difficile confrontarei risultati 14,15,16,17,18.

Le misure di risultato per valutare la rigenerazione nervosa vanno dall'elettrofisiologia all'istomorfometria, ma questi metodi implicano una correlazione ma non misurano necessariamente direttamente ilritorno della funzione motoria 14,15. Le fibre nervose rigeneranti potrebbero non creare connessioni appropriate che possono causare una sopravvalutazione del numero di connessioni funzionali14,15,19,20. La misurazione migliore e clinicamente più rilevante per dimostrare la corretta reinnervazione degli organi finali rimane la valutazione della funzionemuscolare 21,22,23. La creazione di strumenti di valutazione delle funzioni motorie per i modelli animali è, tuttavia, impegnativa. ha descritto per la prima volta l'analisi della pista da passeggio, che da allora è stato il metodo più frequentemente utilizzato per valutare il recupero funzionale negli studi sperimentali sui nervi periferici21,24,25, 26,27,28. L'analisi della pista da passeggio quantifica l'indice funzionale sciatico (SFI) sulla base delle misurazioni delle impronte delle zampe dei ratti checamminano 21,29. Le principali limitazioni dell'analisi dei sentieri, come le contratture, l'automutilazione, lo sbavatura della stampa e la scarsa correlazione con altre misure di reinnervazione, hanno reso necessario l'uso di altri parametri per la quantificazione delrecupero funzionale 30,31.

In precedenti studi su ratti Lewis32 e conigli neozelandesi33, abbiamo convalidato la misurazione della forza tetanica isometrica (ITF) per il muscolo tibiale anteriore (TA) e dimostrato la sua efficacia nella valutazione del recupero muscolare dopo diversi tipi diriparazione nervosa 34,35,36,37,38,39. Il muscolo TA è adatto a causa delle sue dimensioni relativamente grandi, innervazione da parte del ramo peroneale del nervo sciatico e proprietà biochimiche ben chiarite40,41,42,43. Quando la lunghezza muscolare (forza di precarico) e i parametri elettrici sono ottimizzati, l'ITF fornisce una variabilità side-to-side del 4,4% e del 7,5% rispettivamentenei ratti 32 e nei conigli 33.

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato della misurazione ITF nel modello del nervo sciatico del ratto, inclusa una descrizione approfondita della necessaria pianificazione pre-chirurgica, approccio chirurgico e dissezione del comune nervo peroneale e del tendine muscolare TA distale. Utilizzando valori predeterminati per l'intensità e la durata dello stimolo, verrà definita la lunghezza muscolare ottimale e la frequenza dell'impulso di stimolo. Con questi quattro parametri, l'ITF può essere successivamente misurato in modo coerente e accurato.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC A334818).

1. Taratura del trasduttore di forza

  1. Assicurarsi che il computer sia correttamente collegato al dispositivo daq (Multifunctional I/O Data Acquisition) USB-6009, che a sua volta deve essere collegato al trasduttore di forza.
    NOTA: Altri ceppi e specie di ratti possono richiedere un trasduttore di forza delle cellule di carico diverso, poiché si prevede un'elevata forza 44.
  2. Attaccare un morsetto personalizzato modellato da un emostato chirurgico modificato al trasduttore di forza montato su un braccio a leva regolabile in base al vuoto.
    NOTA: Il morsetto su misura è costituito da un emostato chirurgico modificato con una vite di serraggio che consente la regolazione della tensione (Figura 1).
  3. Posizionare sul tavolo la piattaforma di prova in vetro acrilico su misura, che contiene due blocchi di legno per il fissazione dell'arto posteriore del ratto.
    NOTA: Altri materiali come l'uretano possono essere utilizzati anche al posto del legno purché i fili K siano in grado di penetrare e fissarsi.
  4. Collegare verticalmente il morsetto, il trasduttore di forza e la combinazione regolabile del braccio della leva alla piattaforma di prova utilizzando la sua base sottovuoto.
  5. Fissare un gancio o un anello al morsetto per i pesi di calibrazione.
  6. Accendere il computer e aprire il software (ad esempio, LabVIEW).
  7. Una volta aperto il software, avviare lo strumento virtuale su misura (VI) per la misurazione ITF (Figura 2).
    NOTA: la figura 2 contiene il codice LabVIEW in un frammento VI. Questo frammento VI può essere trascinato nel diagramma a blocchi in LabVIEW. Verrà automaticamente trasformato in un codice grafico. Per questo esperimento la frequenza di campionamento è stata impostata a 2000 Hz con 25 campioni da leggere per ogni iterazione.
  8. Eseguire il VI premendo la freccia bianca nell'angolo superiore sinistro e selezionare Nuova calibrazione. Si aprirà una nuova finestra.
  9. Avviare il processo di calibrazione con peso zero (solo il morsetto con gancio o loop collegato) e premere OK.
  10. Consecutivamente, aggiungere 10, 20, 30 e 50 grammi di peso e premere OK tra ogni misurazione del peso.
  11. Una volta raccolte tutte e cinque le misurazioni, fare clic su Processo.
  12. Accettate i valori solo se il grafico sul VI visualizza una curva lineare positiva (Figura 3).
  13. Riposizionare il morsetto, il trasduttore di forza e la combinazione del braccio della leva regolabile orizzontalmente sulla piattaforma di prova. Questa sarà la posizione utilizzata per misurare l'ITF.
  14. Clicca su Zero e la finestra si chiuderà automaticamente.

2. Soggetti animali

  1. Utilizzare ratti Maschi Lewis del peso compreso tra 300 e 500 g.
    NOTA: Per il confronto della rigenerazione nervosa, è imperativo utilizzare lo stesso ceppo di ratto sia nei gruppi di controllo che in quello sperimentale, poiché il peso e l'incidenza dell'autotomia dipendono dallo sforzo e possono influenzare enormemente i risultati dell'ITF10,32,45,46,47.

3. Preparazione chirurgica

  1. Preparare tutti gli strumenti chirurgici necessari prima dell'intervento chirurgico(Tabella dei materiali).
  2. Pesare gli animali per determinare la quantità richiesta di anestesia.
  3. Indurre l'anestesia mettendo il ratto in una camera gassata con il 3% di isoflurane nell'ossigeno.
  4. Anestetizzare profondamente il ratto utilizzando un cocktail di chetamina in dieci parti (100 mg/mL) e xiazina monotonale (100 mg/mL) ad un dosaggio di 1 mL/kg di peso corporeo mediante iniezione intraperitoneale. Monitorare la profondità dell'anestesia in base alla risposta a un dito del piedi e osservando la frequenza respiratoria.
  5. Circa 30 minuti dopo il dosaggio iniziale del cocktail chetamina/xiazina, somministrare una dose supplementare di 0,3-0,6 mL/kg di peso corporeo solo di chetamina (100 mg/mL) intraperitoneale per mantenere un'anestesia adeguata durante l'intera procedura, definita come una bassa frequenza respiratoria e una risposta assente a un dito del piedino.
    ATTENZIONE: È importante somministrare meticolosamente l'anestesia richiesta in quanto un sovradosaggio non può essere contrastato.
  6. Radere con cura gli arti posteriori del topo usando tosaerba elettriche.
  7. Posizionare il ratto in posizione prona su un riscaldante per mantenere la temperatura corporea a 37 °C. Opzionalmente, la temperatura corporea può essere monitorata utilizzando un termometro rettale.
  8. Iniettare 5 mL di cloruro di sodio allo 0,9% (NaCl) per via sottocutanea nella pelle sciolta sul collo del ratto per preservare un adeguato stato di idratazione durante tutta la procedura.
  9. A causa della natura non di sopravvivenza di questa procedura, il campo chirurgico e gli strumenti non richiedono di essere sterili. Il chirurgo dovrebbe utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) e le loupes chirurgiche sono consigliate per una corretta visualizzazione delle strutture anatomiche.

4. Approccio chirurgico al comune nervo peroneale

  1. Posizionare il ratto nella posizione reclinata laterale destra o sinistra a seconda del lato che verrà misurato per primo.
  2. Creare un'incisione di 2-3 cm nella pelle della coscia posterolaterale parallela al femore a partire dal trochanter maggiore utilizzando una lama chirurgica n. 15.
  3. Identificare il piano tra il muscolo bicipite femoris e i muscoli gluteo massimo e vastus lateralis ed eseguire una dissezione smussata usando forbici tenotomiche per separare questi muscoli ed esporre il nervo sciatico sottostante.
  4. Individuare la triforcazione del nervo sciatico e posizionare un riavvolgitore per acquisire un migliore accesso. I tre rami del nervo sciatico includono il comune nervo peroneale, il nervo tibiale e il nervo surale.
  5. Isolare il comune ramo nervoso peroneale (di solito il ramo più ventrale) del nervo sciatico usando una forcep microchirurgica curva.
    NOTA: In caso di incertezza, stimolare delicatamente il nervo isolato con uno stimolatore nervoso chirurgico e osservare la risposta motoria. La stimolazione del comune nervo peroneale provoca la dorsiflessione della zampa.

5. Dissezione del tendine muscolare anteriore della tibiale distale

  1. Per esporre il muscolo TA e il suo inserimento, incidere la pelle all'aspetto anterolaterale della parte inferiore della gamba, iniziando dall'articolazione del ginocchio e scendendo sul lato mediodorsale della zampa posteriore.
  2. Sezionare il tendine muscolare TA distale dal tessuto circostante usando un bisturi con una lama chirurgica n. 15.
  3. Usando una forza di zanzara, sezionare senza mezzi termini il tendine muscolare TA verso l'inserimento e tagliare il tendine il più distale possibile. Lasciare indisturbato il muscolo TA prossimale, preservando il pedicolo neurovascolare.
    NOTA: Regolarmente (circa ogni 5 minuti), idratare il muscolo TA con NaCl riscaldato dello 0,9% (37 °C) per prevenire il raffreddamento e l'essiccazione.

6. Misurazione della forza tetanica isometrica

  1. Collegare i cavi dell'elettrodo bipolare e il cavo di terra in base al loro colore a un dispositivo di stimolatore bipolare.
  2. Collegare l'altra estremità dei cavi degli elettrodi bipolari a un elettrodo di sottominiatura.
    NOTA: L'elettrodo di riferimento (rosso, anodo) deve essere posizionato distale e l'elettrodo attivo (nero, catodo) prossimale.
  3. Trasferire l'animale insieme alla pastiglia di riscaldamento alla piattaforma di prova.
  4. Fissare l'arto posteriore del topo al blocco di legno usando due fili Kirschner da 1 mm attraverso la caviglia e il condilo laterale del femore distale evitando l'aspetto posteriore del ginocchio.
    ATTENZIONE: Evitare danni vascolari all'arteria e alla vena poplitea che si trovano dorsalmente al condilo del femore.
  5. Collegare un supporto con un morsetto personalizzato alla piattaforma di prova utilizzando la sua base sottovuoto.
  6. Fissare il tendine muscolare TA distale al morsetto attaccato al trasduttore di forza.
    NOTA: Il morsetto e il trasduttore di forza devono essere posizionati parallelamente al decorso del muscolo TA.
  7. Posizionare il riavvolgitore alla coscia posterolaterale del ratto per accedere al comune nervo peroneale.
    NOTA: Il nervo sciatico e i suoi rami devono essere mantenuti umidi con NaCl riscaldato dello 0,9% (37 °C) per prevenire il raffreddamento e l'essiccazione.
  8. Inserire il cavo di terra nei muscoli circostanti (ad esempio, il muscolo vastus lateralis).
    NOTA: Lo stimolatore Grass SD9 richiede un cavo di terra per ridurre gli artefatti elettrici. Gli stimolatori più nuovi potrebbero non richiedere un cavo di terra aggiuntivo.
  9. Agganciare il comune nervo peroneico all'elettrodo della sottominiatura e fissarne la posizione utilizzando il supporto sulla piattaforma (Figura 4).
    NOTA: Assicurarsi che solo il nervo peroneale comune sia agganciato all'elettrodo della sottominiatura.
  10. Ottimizzazione della lunghezza muscolare
    1. Accendere il dispositivo stimolatore bipolare e regolare le impostazioni come segue: impulso monofasico quadrato, ritardo 2 ms, durata dell'impulso di stimolo 0,4 ms, intensità di stimolo 2 V.
      NOTA: Il ritardo determina il tempo tra l'impulso di sincronizzazione e l'erogazione del bordo anteriore dell'impulso.
    2. Selezionare Test parametro e attivare la raccolta Trigger nel VI.
    3. Aumentare la lunghezza muscolare (precaricare) regolando il braccio della leva attaccato al trasduttore di forza.
    4. Iniziare da 10 g di precaricamento e utilizzare incrementi di 10 g fino a quando non viene determinata la forza muscolare attiva massima.
    5. Per ogni precaricamento, applicare due singole contrazioni direttamente l'una dopo l'altra utilizzando il pulsante sul dispositivo di stimolatore bipolare. L'uscita sarà visibile sullo schermo e il topo dovrebbe mostrare la dorsiflessione della zampa.
      NOTA: Prima di stimolare il nervo, rimuovere sempre qualsiasi NaCl in eccesso dello 0,9% che circonda il nervo utilizzando applicatori con punta di cotone per garantire che il segnale non sia condotto al tessuto circostante.
    6. Per interrompere la misurazione, premi nuovamente la raccolta trigger nel VI.
    7. Se il programma rileva automaticamente le due forze di output di picco, fare clic su Accetta. Nel caso in cui il programma non selezioni automaticamente queste forze di output, premere Rifiuta e selezionare manualmente i picchi. Le due forze di uscita di picco saranno medie ad una forza media di uscita di picco (Figura 5).
    8. Calcola la forza muscolare attiva sottraendo il precarico dalla forza media di uscita del picco.
    9. Annotare la forza attiva per ogni precarico per visualizzare la tendenza e riconoscere la forza attiva massima (Figura 6). È inoltre possibile utilizzare un foglio di calcolo.
  11. Misurazione della forza tetanica isometrica
    1. Dopo aver determinato la lunghezza muscolare ideale, lasciare riposare il muscolo a zero precaricarsi per 5 minuti prima di iniziare le contrazioni muscolari tetaniche.
    2. Nel frattempo, passare dal test di parametro al test di frequenza sul VI e regolare l'intensità dello stimolo a 10 V sul dispositivo di stimolatore bipolare.
    3. Mantenere il ritardo e la durata dell'impulso di stimolo rispettivamente a 2 ms e 0,4 ms.
    4. Misurare la forza muscolare tetanica isometrica usando frequenze di stimolo crescenti a partire da 30 Hz con incrementi di 30 Hz fino a quando non si osserva l'altopiano massimo della forza.
    5. Fare clic sulla raccolta trigger e impostare sulla lunghezza muscolare ottimale predeterminata.
    6. Premere il tasto Ripeti sul dispositivo stimolatore bipolare per indurre una stimolazione tetanica per un massimo di 5 secondi o fino a quando non viene chiaramente osservato un picco di forza.
      NOTA: Prima di stimolare il nervo, rimuovere sempre qualsiasi NaCl in eccesso dello 0,9% che circonda il nervo utilizzando applicatori con punta di cotone per garantire che il segnale non sia condotto al tessuto circostante.
    7. Per raccogliere i dati, premere nuovamente la raccolta Trigger e documentare la forza di output massima. Nel caso in cui il programma non rilevi automaticamente la forza massima di uscita di picco, premere Rifiuta e selezionare manualmente il picco.
    8. Lasciare riposare di nuovo il muscolo a zero precaricamento per 5 minuti prima di iniziare le prossime contrazioni muscolari tetaniche.
      NOTA: Regolarmente (circa ogni 5 minuti), idratare il muscolo TA con NaCl riscaldato dello 0,9% (37 °C) per prevenire il raffreddamento e l'essiccazione.
    9. Continuare ad aumentare la frequenza di stimolo fino al raggiungere l'altopiano massimo della forza. L'altopiano di forza sarà definito come la forza tetanica isometrica massima.
      NOTA: Dopo questo passaggio, rimuovere i fili K, graffettare o suturare la pelle e ripetere l'intera procedura all'arto posteriore contralto, a partire dal passaggio 4.

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Risultati

Cinque parametri vengono utilizzati per misurare la misurazione ITF. Questi includono tensione muscolare (forza di precarico), intensità di stimolo (tensione), frequenza dell'impulso di stimolo, durata dello stimolo di 0,4 ms e un ritardo di 2 ms. Prima di misurare l'ITF, la tensione muscolare ottimale deve essere determinata utilizzando due contrazioni muscolari a contrazione singola ad un'intensità di 2 V durante il test dei parametri. Questi stimoli causano la dorsiflessione della zampa e producono un segnale di usc...

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Discussione

Questo protocollo descrive un metodo precedentemente convalidato per acquisire misurazioni ITF massime accurate del muscolo TA nel modello di ratto32. Il recupero della massima forza dopo trattamenti sperimentali di ricostruzione nervosa è di primario interesse nell'ambiente clinico in quanto dimostra che il nervo non solo si è rigenerato, ma ha anche fatto connessioni di lavoro con il muscolo bersaglio. L'ITF può essere utilizzato in un piccolo modello di nerve gap, come il ratto sciatico nerv...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke del National Institutes of Health con il premio Numero RO1 NS 102360. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Sodium ChlorideBaxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USAG130203
1 mm Kirshner wiresPfizer Howmedica, Rutherford, NJN/A
Adson Tissue ForcepsASSI, Westbury, NY, USAMTK-6801226
Bipolar electrode cablesGrass Instrument, Quincy, MAN/A
Bipolar stimulator deviceGrass SD9, Grass Instrument, Quincy, MAN/A
Cotton-tip ApplicatorsCardinal Health, Waukegan, IL, USAC15055-006
Curved Mosquito forcepsASSI, Westbury, NY, USAMTK-1201112
Force Transducer MDB-2.5Transducer Techniques, Temecula, CAN/A
Gauze Sponges 4x4Covidien, Mansfield, MA, USA2733
Ground cableGrass Instrument, Quincy, MAN/A
Isoflurane chamberN/AN/ACustom-made
KetamineKetalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ42023-115-10
LabView SoftwareNational Instruments, Austin, TX
LoopN/AN/ACustom-made
Microsurgical curved forcepsASSI, Westbury, NY, USAJFA-5B
Microsurgical scissorsASSI, Westbury, NY, USASAS-15R-8-18
Microsurgical straight forcepsASSI, Westbury, NY, USAJF-3
RetractorASSI, Westbury, NY, USAAG-124426
Scalpel Blade No. 15Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA371115
Slim Body Skin StaplerCovidien, Mansfield, MA, USA8886803512
Subminiature electrodeHarvard Apparatus, Holliston, MAN/A
Surgical Nerve StimulatorCheckpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA9094
Terrell IsofluranePiramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USAH961J19A
Testing platformN/AN/ACustom-made
Tetontomy ScissorsASSI, Westbury, NY, USAASIM-187
Traceable Big-Digit Timer/StopwatchFisher Scientific, Waltham, MA, USAS407992
USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) deviceNational Instruments, Austin, TX779026-01
Vacuum Base HolderNoga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, IsrealN/AAttached clamp is custom-made
Weight (10 g)Denver Instruments, Denver, CO, USA820010.4
Weight (20 g)Denver Instruments, Denver, CO, USA820020.4
Weight (50 g)Denver Instruments, Denver, CO, USA820050.4
XylazineXylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada1XYL002

Riferimenti

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