Medição máxima da Força Tetanica Isométrica do Músculo Tibialis Anterior no Rato

Resumo

A avaliação da recuperação motora continua sendo a medida de desfecho de referência em estudos experimentais de nervos periféricos. A medição da força tetanica isométrica do músculo tibialis anterior no rato é uma ferramenta inestimável para avaliar os resultados funcionais após a reconstrução de defeitos do nervo ciático. Os métodos e nuances estão detalhados neste artigo.

Resumo

Lesões nervosas traumáticas resultam em perda funcional substancial e defeitos nervosos segmentais muitas vezes exigem o uso de enxertos nervosos de interposição autólogos. Devido à sua disponibilidade limitada e morbidade lateral associada, muitos estudos no campo da regeneração nervosa focam em técnicas alternativas para preencher uma lacuna nervosa segmental. A fim de investigar os resultados das opções de tratamento experimental cirúrgico ou farmacológico, o modelo de nervo ciático de ratos é frequentemente usado como um bioensaio. Há uma variedade de medidas de desfecho usadas em modelos de ratos para determinar a extensão da regeneração nervosa. A força máxima de saída do músculo alvo continua sendo o resultado mais relevante para a tradução clínica de terapias experimentais. A medição da força isométrica da contração muscular tetanica foi descrita anteriormente como uma técnica reprodutível e válida para avaliar a recuperação motora após lesão nervosa ou reparo em modelos de ratos e coelhos. Neste vídeo, forneceremos uma instrução passo-a-passo deste procedimento inestimável para avaliação da recuperação funcional do músculo tibialis anterior em um modelo de defeito no nervo ciático de rato usando parâmetros otimizados. Descreveremos as preparações pré-cirúrgicas necessárias, além da abordagem cirúrgica e dissecção do nervo peronal comum e do tendão muscular anterior tíibal. A técnica de medição da força tetanica isométrica será detalhada. A determinação do comprimento muscular ideal e da frequência de pulso de estímulo é explicada e a medição da contração muscular tetanica máxima é demonstrada.

Introdução

A perda da função motora após lesão nervosa periférica traumática tem impacto significativo na qualidade de vida e no status socioeconômico dos pacientes^1,2,3. O prognóstico dessa população de pacientes permanece ruim devido a melhorias mínimas nas técnicas cirúrgicas ao longo dos anos⁴. O reparo peridural direto sem tensão forma a reconstrução cirúrgica padrão-ouro. No entanto, nos casos com lacunas nervosas prolongadas, a interposição de um enxerto nervoso autólogo provou ser superior a^5,6. A morbidade do local do doador associado e a limitada disponibilidade de enxertos nervosos autólogos impuseram a necessidade de técnicas alternativas^7,8.

Modelos experimentais de animais têm sido utilizados para elucidar o mecanismo de regeneração nervosa periférica e avaliar os resultados de uma variedade de opções de tratamento reconstrutivo e farmacológico^8,9. O modelo de nervo ciático de rato é o modelo animal¹⁰mais usado. Seu pequeno tamanho os torna fáceis de manusear e casa. Devido ao seu potencial neuroregenerativo superlativo, o tempo reduzido entre a intervenção e a avaliação dos desfechos pode resultar em custos relativamente menores^11,12. Outras vantagens de seu uso incluem similaridades morfológicas às fibras nervosas humanas e o alto número de estudos comparativos/históricos¹³. Embora este último deva ser abordado com cautela, uma vez que uma ampla variedade de diferentes medidas de desfecho entre estudos dificulta a comparação dos resultados^{14,15,16,17,18}.

As medidas de desfecho para avaliar a regeneração nervosa variam da eletrofisiologia à histomorfometria, mas esses métodos implicam uma correlação, mas não medem necessariamente diretamente o retorno da função motora^14,15. A regeneração das fibras nervosas pode não fazer conexões adequadas que possam causar uma superestimação do número de conexões funcionais^14,15,19,20. A melhor e clinicamente mais relevante medida para demonstrar a reinervação correta dos órgãos finais permanece a avaliação da função muscular^21,22,23. Criar ferramentas de avaliação de funções motoras para modelos animais é, no entanto, desafiador. Medinaceli et al. descreveram pela primeira vez a análise da pista de caminhada, que desde então tem sido o método mais utilizado para avaliar a recuperação funcional em estudos experimentais de nervo periférico^{21,24,25,26,27,28}. A análise da pista de caminhada quantifica o índice funcional ciático (SFI) com base em medidas de pegadas de ratos ambulantes^21,29. Grandes limitações da análise da pista de caminhada, como contraturas de dedos, automutilação, mancha da impressão e má correlação com outras medidas de reinervação, necessitaram do uso de outros parâmetros para quantificação da recuperação funcional^30,31.

Em estudos anteriores em ratos de Lewis³² e coelhos neozelandeses³³, validamos a medida da força tetanica isométrica (ITF) para o músculo tibialis anterior (TA) e demonstramos sua eficácia na avaliação da recuperação muscular após diferentes tipos de reparação nervosa^{34,35,36,37,38,39}. O músculo TA é bem adequado devido ao seu tamanho relativamente grande, inervação pelo ramo peroneal do nervo ciático e propriedades bioquímicas bem elucidadas^40,41,42,43. Quando o comprimento muscular (força de pré-carga) e os parâmetros elétricos são otimizados, o ITF fornece uma variabilidade lado a lado de 4,4% e 7,5% nos ratos³² e coelhos^{33, respectivamente.}

Este artigo fornece um protocolo detalhado da medição da ITF no modelo de nervo ciático de ratos, incluindo uma descrição completa do necessário planejamento pré-cirúrgico, abordagem cirúrgica e dissecção do nervo peronal comum e do tendão muscular distal. Utilizando valores predeterminados para a intensidade e duração do estímulo, será definido o comprimento e a frequência de pulso de estímulo ideal. Com esses quatro parâmetros, o ITF pode ser posteriormente medido de forma consistente e precisa.

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Protocolo

Todos os procedimentos animais foram realizados com aprovação do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC A334818).

1. Calibração do transdutor de força

1. Certifique-se de que o computador está devidamente conectado ao dispositivo de aquisição de dados de I/O multifuncional USB-6009 (DAQ), que por sua vez deve ser conectado ao transdutor de força.
   NOTA: Outras cepas de ratos e espécies podem exigir um transdutor de força de célula de carga diferente, pois forças mais altas devem ser esperadas ⁴⁴.
2. Conecte um grampo personalizado feito a partir de um hemostato cirúrgico modificado ao transdutor de força que é montado em um braço de alavanca ajustável da base de vácuo.
   NOTA: O grampo personalizado consiste em um hemostat cirúrgico modificado com um parafuso de aperto que permite o ajuste da tensão(Figura 1).
3. Posicione a plataforma de teste de vidro acrílico sob medida, que contém dois blocos de madeira para fixação do membro traseiro do rato, sobre a mesa.
   NOTA: Outros materiais como uretano também podem ser usados em vez de madeira, desde que os fios K sejam capazes de penetrar e fixar.
4. Conecte o grampo, force transducer e ajustável combinação de braço de alavanca verticalmente à plataforma de teste usando sua base de vácuo.
5. Aperte um gancho ou laço no grampo para os pesos de calibração.
6. Ligue o computador e abra o software (por exemplo, LabVIEW).
7. Uma vez aberto o software, inicie o instrumento virtual personalizado (VI) para medição itf(Figura 2).
   NOTA: A Figura 2 contém o código LabVIEW em um trecho VI. Este trecho VI pode ser arrastado para o diagrama do bloco no LabVIEW. Ele será automaticamente transformado em um código gráfico. Para este experimento, a taxa de amostragem foi fixada em 2000 Hz com 25 amostras para ler para cada iteração.
8. Execute o VI pressionando a seta branca no canto superior esquerdo e selecione Nova calibração. Uma nova janela se abrirá.
9. Inicie o processo de calibração com peso zero (apenas o grampo com um gancho ou laço ligado) e pressione OK.
10. Consecutivamente, adicione 10, 20, 30 e 50 gramas de peso e pressione OK entre cada medição de peso.
11. Uma vez que todas as cinco medidas sejam coletadas, clique em Processo.
12. Só aceite os valores se o gráfico no VI exibir uma curva linear positiva(Figura 3).
13. Reposicione o grampo, o transdutor de força e a combinação de braço de alavanca ajustável horizontalmente na plataforma de teste. Esta será a posição usada para medir o ITF.
14. Clique em Zero e a janela fechará automaticamente.

2. Sujeitos animais

1. Use ratos masculinos de Lewis pesando entre 300-500 g.
   NOTA: Para comparação da regeneração nervosa, é imprescindível o uso da mesma cepa de rato tanto no controle quanto nos grupos experimentais, uma vez que o peso e a incidência de autotomia são dependentes da tensão e podem influenciar tremendamente os resultados da ITF^{10,32,45,46,47}.

3. Preparação cirúrgica

1. Prepare todos os instrumentos cirúrgicos necessários antes da cirurgia(Tabela de Materiais).
2. Pesar os animais para determinar a quantidade necessária de anestesia.
3. Induzir anestesia colocando o rato em uma câmara gaseada com 3% de isoflurane em oxigênio.
4. Anestesia profundamente o rato usando um coquetel de dez partes de cetamina (100 mg/mL) e xilazina de uma parte (100 mg/mL) em uma dose de 1 mL/kg de peso corporal através de uma injeção intraperitoneal. Monitore a profundidade da anestesia com base na resposta a uma pitada do dedo do pé e observando a taxa respiratória.
5. Aproximadamente 30 minutos após a dosagem inicial do coquetel de cetamina/xilazina, administre uma dose suplementar de 0,3-0,6 mL/kg de peso corporal de apenas cetamina (100 mg/mL) intraperitonealmente para manter anestesia adequada durante todo o procedimento, que é definida como uma baixa taxa respiratória e uma resposta ausente a uma pitada de dedo do dedo.
   ATENÇÃO: É importante administrar meticulosamente a anestesia necessária, pois uma overdose não pode ser neutralizada.
6. Raspe cuidadosamente os membros traseiros do rato usando cortadores elétricos.
7. Coloque o rato em posição propensa em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 °C. Opcionalmente, a temperatura corporal pode ser monitorada usando um termômetro retal.
8. Injete 5 mL de cloreto de sódio (NaCl) subcutâneamente na pele solta sobre o pescoço do rato para preservar um estado adequado de hidratação durante todo o procedimento.
9. Devido à natureza não sobrevida deste procedimento, o campo cirúrgico e os instrumentos não precisam ser estéreis. O cirurgião deve utilizar equipamentos de proteção individual (EPI) e as lupas cirúrgicas são aconselhadas para a visualização adequada das estruturas anatômicas.

4. Abordagem cirúrgica ao nervo peroneal comum

1. Coloque o rato na posição lateral direita ou esquerda, dependendo de qual lado será medido primeiro.
2. Crie uma incisão de 2-3 cm na pele da coxa posterolateral paralela ao fêmur a partir do maior trochanter usando uma lâmina cirúrgica nº 15.
3. Identifique o plano entre o músculo bíceps femoral e o glúteo maximus e vasto músculos lateralis e realize uma dissecção contundente usando uma tesoura de tenotomia para separar esses músculos e expor o nervo ciático subjacente.
4. Localize a trifurcação do nervo ciático e coloque um retraídor para obter melhor acesso. Os três ramos do nervo ciático incluem o nervo peroneal comum, o nervo tibialis e o nervo sural.
5. Isole o ramo nervoso peroneal comum (geralmente o ramo mais ventral) do nervo ciático usando um fórceps microcirúrgicos curvos.
   NOTA: Em caso de incerteza, estimule suavemente o nervo isolado com um estimulador nervoso cirúrgico e observe a resposta motora. A estimulação do nervo peroneal comum resulta em dorsiflexão da pata.

5. Dissecção do tendão muscular distal tibialis anterior

1. A fim de expor o músculo TA e sua inserção, incisar a pele no aspecto anterolateral da perna inferior, começando na articulação do joelho e descendo para o lado mediodorso da pata traseira.
2. Dissecar o tendão muscular distal ta do tecido circundante usando um bisturi com uma lâmina cirúrgica nº 15.
3. Usando um fórceps de mosquito, dissecar sem rodeios o tendão muscular ta em direção à inserção e cortar o tendão o mais distal possível. Deixe o músculo TA proximal intacto, preservando o pedículo neurovascular.
   NOTA: Regularmente (aproximadamente a cada 5 minutos), úmido o músculo TA com NaCl aquecido 0,9% (37 °C) para evitar resfriamento e dessecação.

6. Medição da força tetanica isométrica

1. Conecte os cabos de eletrodo bipolares e o cabo de terra de acordo com sua cor a um dispositivo estimulador bipolar.
2. Conecte a outra extremidade dos cabos de eletrodo bipolar a um eletrodo de subminatura.
   NOTA: O eletrodo de referência (vermelho, ânodo) deve ser colocado distal e o eletrodo ativo (preto, cátodo) proximal.
3. Transfira o animal junto com a almofada de aquecimento para a plataforma de testes.
4. Fixar o membro traseiro do rato ao bloco de madeira usando dois fios kirschner de 1 mm através do tornozelo e o condíle lateral do fêmur distal evitando o aspecto posterior do joelho.
   ATENÇÃO: Evite danos vasculares na artéria popliteal e veia que estão localizadas dormente ao condíle do fêmur.
5. Conecte um suporte com um grampo personalizado à plataforma de teste usando sua base de vácuo.
6. Fixar o tendão muscular distal ta ao grampo ligado ao transdutor de força.
   NOTA: O grampo e o transdutor de força devem ser posicionados paralelamente ao curso do músculo TA.
7. Coloque o retrátil na coxa do rato para acessar o nervo peroneal comum.
   NOTA: O nervo ciático e seus ramos devem ser mantidos úmidos com 0,9% de NaCl aquecido (37 °C) para evitar o resfriamento e a dessecação.
8. Insira o cabo moído nos músculos circundantes (por exemplo, o músculo vasto lateralis).
   NOTA: O estimulador Grass SD9 requer um cabo de terra para reduzir artefatos elétricos. Estimuladores mais novos podem não precisar de um cabo de terra extra.
9. Gancho o nervo peroneal comum ao eletrodo de subminatura e fixe sua posição usando o suporte na plataforma (Figura 4).
   NOTA: Certifique-se de que apenas o nervo peroneal comum está ligado ao eletrodo de subminatura.
10. Otimização do comprimento muscular
    1. Ligue o dispositivo estimulador bipolar e ajuste as configurações da seguinte forma: pulso monofásico quadrado, atraso de 2 ms, duração do pulso de estímulo 0,4 ms, intensidade de estímulo 2 V.
       NOTA: O atraso determina o tempo entre o pulso de sincronização e a entrega da borda principal do pulso.
    2. Selecione o teste do parâmetro e acione a coleção Trigger no VI.
    3. Aumente o comprimento do músculo (pré-carga) ajustando o braço da alavanca preso ao transdutor de força.
    4. Comece com 10 g de pré-carga e use incrementos de 10 g até que a força muscular ativa máxima seja determinada.
    5. Para cada pré-carga, aplique dois únicos interruptores diretamente um após o outro usando o botão no dispositivo estimulador bipolar. A saída será visível na tela e o rato deve mostrar dorsiflexão da pata.
       NOTA: Antes de estimular o nervo, remova sempre qualquer excesso de 0,9% NaCl ao redor do nervo usando aplicadores de ponta de algodão para garantir que o sinal não seja conduzido ao tecido circundante.
    6. Para parar a medição, bata novamente na coleção Trigger no VI.
    7. Se o programa detectar automaticamente as duas forças de saída de pico clique em Aceitar. Caso o programa não selecione automaticamente essas forças de saída, pressione Declínio e selecione os picos manualmente. As duas forças de saída de pico serão médiadas a uma força média de saída de pico(Figura 5).
    8. Calcule a força muscular ativa subtraindo a pré-carga da força média de saída de pico.
    9. Anote a força ativa de cada pré-carga para visualizar a tendência e reconhecer a força ativa máxima(Figura 6). Uma planilha também pode ser usada.
11. Medição da força tetanica isométrica
    1. Depois de determinar o comprimento muscular ideal, deixe o músculo descansar em zero pré-carga por 5 minutos antes de iniciar as contrações musculares tetanicas.
    2. Enquanto isso, mude do teste de parâmetro para o teste de frequência no VI e ajuste a intensidade de estímulo para 10 V no dispositivo estimulador bipolar.
    3. Mantenha a duração do pulso de atraso e estímulo em 2 ms e 0,4 ms, respectivamente.
    4. Meça a força muscular tetanica isométrica utilizando frequências de estímulo crescentes a partir de 30 Hz com incrementos de 30 Hz até que o plano de força máxima seja observado.
    5. Clique na coleção Trigger e defina para o comprimento muscular ideal pré-determinado.
    6. Pressione o botão Repetir no dispositivo estimulador bipolar para induzir uma estimulação tetanic por um máximo de 5 segundos ou até que um pico de força seja claramente observado.
       NOTA: Antes de estimular o nervo, remova sempre qualquer excesso de 0,9% NaCl ao redor do nervo usando aplicadores de ponta de algodão para garantir que o sinal não seja conduzido ao tecido circundante.
    7. Para coletar os dados, pressione a coleta de gatilho novamente e documente a força máxima de saída. Caso o programa não detecte automaticamente a força máxima de saída de pico, pressione Declínio e selecione o pico manualmente.
    8. Deixe o músculo descansar novamente em zero pré-carga por 5 minutos antes de iniciar as próximas contrações musculares tetanicas.
       NOTA: Regularmente (aproximadamente a cada 5 minutos), úmido o músculo TA com Aquecido 0,9% NaCl (37 °C) para evitar resfriamento e dessecação.
    9. Continue aumentando a frequência de estímulo até que o planalto de força máxima seja atingido. O planalto de força será definido como a força tetanica isométrica máxima.
       NOTA: Após esta etapa, remova os fios K, grampeie ou sutura a pele e repita todo o procedimento ao membro traseiro contralateral, começando no passo 4.

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Resultados

Cinco parâmetros são usados para medir a medição itf. Estes incluem tensão muscular (força de pré-carga), intensidade de estímulo (tensão), frequência de pulso de estímulo, duração de estímulo de 0,4 ms e um atraso de 2 ms. Antes de medir o ITF, a tensão muscular ideal deve ser determinada usando duas contrações musculares de contração única a uma intensidade de 2 V durante o teste do parâmetro. Esses estímulos causam dorsiflexão da pata e produzem um sinal de saída no gráfico no VI (

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Discussão

Este protocolo descreve um método previamente validado para a aquisição de medições máximas de ITF precisas do músculo TA no modelo de rato³². A recuperação da força máxima após tratamentos experimentais de reconstrução nervosa é de interesse primário no cenário clínico, pois prova que o nervo não só se regenerou, mas também fez conexões de trabalho com o músculo alvo. O ITF pode ser usado em um pequeno modelo de lacuna nervosa, como o modelo de nervo ciático de rato

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA	G130203
1 mm Kirshner wires	Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ	N/A
Adson Tissue Forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	MTK-6801226
Bipolar electrode cables	Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Bipolar stimulator device	Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Cotton-tip Applicators	Cardinal Health, Waukegan, IL, USA	C15055-006
Curved Mosquito forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	MTK-1201112
Force Transducer MDB-2.5	Transducer Techniques, Temecula, CA	N/A
Gauze Sponges 4x4	Covidien, Mansfield, MA, USA	2733
Ground cable	Grass Instrument, Quincy, MA	N/A
Isoflurane chamber	N/A	N/A	Custom-made
Ketamine	Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ	42023-115-10
LabView Software	National Instruments, Austin, TX
Loop	N/A	N/A	Custom-made
Microsurgical curved forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	JFA-5B
Microsurgical scissors	ASSI, Westbury, NY, USA	SAS-15R-8-18
Microsurgical straight forceps	ASSI, Westbury, NY, USA	JF-3
Retractor	ASSI, Westbury, NY, USA	AG-124426
Scalpel Blade No. 15	Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA	371115
Slim Body Skin Stapler	Covidien, Mansfield, MA, USA	8886803512
Subminiature electrode	Harvard Apparatus, Holliston, MA	N/A
Surgical Nerve Stimulator	Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA	9094
Terrell Isoflurane	Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA	H961J19A
Testing platform	N/A	N/A	Custom-made
Tetontomy Scissors	ASSI, Westbury, NY, USA	ASIM-187
Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S407992
USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device	National Instruments, Austin, TX	779026-01
Vacuum Base Holder	Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal	N/A	Attached clamp is custom-made
Weight (10 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820010.4
Weight (20 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820020.4
Weight (50 g)	Denver Instruments, Denver, CO, USA	820050.4
Xylazine	Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada	1XYL002