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要約

ゲノムは核空間内で異なる構造に編成され、染色体立体構造の捕捉技術によって明らかにすることができる。核内Hi-C法は、ショウジョウバエ細胞株におけるクロマチン相互作用のゲノム全体のコレクションを提供し、制限フラグメントレベルでメガベース解像度で探索できる接触マップを生成する。

要約

ゲノムは、ドメイン間の相互作用を分離する境界によって区切られたトポロジカルに関連付けられたドメイン(TAD)に編成される。ショウジョウバエでは、TADの形成と境界の根底にあるメカニズムはまだ調査中です。ここで説明する核内Hi-C法の適用は 、ノッチ 遺伝子を単離するTAD境界における建築タンパク質(AP)結合部位の機能を解剖するのに役立った。APの損失を引き起こすドメイン境界の遺伝子改変は、TAD融合、転写欠陥、および長距離トポロジカル変化をもたらす。これらの結果は、ショウジョウバエにおけるドメイン境界形成および遺伝子発現制御に対する遺伝要素の寄与を示す証拠を提供した。ここでは、核内Hi-C法について詳細に説明し、これはプロトコルと共に実験の品質を評価するための重要なチェックポイントを提供する。また、異なるゲノムスケールでゲノム相互作用を分析するために必要なシーケンシング読み取り数と有効なHi-Cペアも示されています。CRISPR/Cas9は、この核内Hi-Cプロトコルを用いたゲノム相互作用の調節要素の遺伝子編集と高解像度プロファイリングを、遺伝的要素の構造機能の調査のための強力な組み合わせとなり得る。

概要

真核生物では、ゲノムは第1相間の核空間内の特定の領域を占める染色体に分割される。染色体を形成するクロマチンは、転写的に寛容であるアクセス可能なクロマチンの1つと、転写的に抑制的なコンパクトクロマチンの2つの主要な状態に分けることができます。これらのクロマチン状態は、核空間で分離し、めったに混ざらず、核2に2つの異なるコンパートメントを形成する。サブメガベーススケールでは、境界は、染色体組織3、4、5をマークするTADと呼ばれる高周波クロマチン相互作用のドメインを分離します。哺乳類では、TAD境界は、凝集およびCCCTC結合因子(CTCF)6、7、8によって占められます。凝集複合体は、安定したクロマチンループ9、10、13、14を形成するためにゲノム配列において収束配向で配置されたCTCF結合部位においてクロマチンを押し出し、停止する。CTCFDNA結合部位の境界または凝集タンパク質の存在量の減少における遺伝的破壊は、調節要素間の異常な相互作用、TAD形成の喪失、および遺伝子発現調節緩和9、10、11、13、14をもたらす。

ショウジョウバエでは、TAD間の境界は、境界元素関連因子32 kDa(BEAF-32)、モチーフ1結合タンパク質(M1BP)、中心タンパク質190(CP190)、毛深翼(SuHW)の抑制剤、CTCFを含むいくつかのAPによって占められており、活性なトーン修飾およびポリメラーゼII.17において濃縮される。ショウジョウバエでは、TADが転写13、17、19の結果として現れ、境界形成および絶縁特性における独立APの正確な役割はまだ調査中であると示唆されている。したがって、ショウジョウバエのドメインが類似した転写状態の領域の凝集の唯一の結果であるかどうか、またはCTCFを含むAPが境界形成に寄与するかどうかは、完全に特徴づけられるままである。染色体立体構造キャプチャ技術の開発と次世代シーケンシングを通じて、ゲノム接点の高解像度の探索が可能になった。Hi-Cプロトコルは、クロマチンフラグメント間のスプリアスライゲーション産物を回避するために「溶液中」2を行うライゲーションステップで最初に記載した。しかし、いくつかの研究は、データ中の有用なシグナルが溶液20,21になかった部分的に溶解した核で形成されたライゲーション生成物から来たという認識を指摘した。

次に、単細胞Hi-C実験22の一部として核内部のライゲーションを行うようにプロトコルを改変した。核内Hi-Cプロトコルは、その後、ゲノム距離の全範囲にわたってより一貫したカバレッジを生み出し、より少ない技術的なノイズ23、24でデータを生成するために、細胞集団Hi-Cに組み込まれた。ここで詳細に説明するプロトコルは、核内Hi-Cプロトコル23,24の集団に基づいており、ショウジョウバエ25のノッチ遺伝子遺伝子座遺伝子のドメイン境界からCTCFおよびM1BPのDNA結合モチーフを遺伝的に除去した結果を調査するために使用された。この結果は、境界でAPのDNA結合モチーフを変更することは、ノッチドメイン形成、ノッチ座を取り巻く領域におけるより大きなトポロジカル欠陥、および遺伝子発現調節緩和に大きな影響を及ぼすことを示している。これは、ドメイン境界における遺伝的要素が、ショウジョウバエ25におけるゲノムトポロジーおよび遺伝子発現の維持にとって重要であることを示している。

プロトコル

1. 固定

  1. 1000万のシュナイダーのライン2プラス(S2R+)細胞から始め、室温(RT)で10%のウシ胎児血清(FBS)を含むシュナイダー培地で17.5mLの細胞懸濁液を調製する。
  2. メタノールフリーホルムアルデヒドを添加し、2%の最終濃度を得る。RTで10分間混ぜてインキュベートし、毎分混ぜるように注意してください。
    注意:ホルムアルデヒドは有害な化学物質です。適切な安全衛生規則に従い、ヒュームフードで作業してください。
  3. グリシンを加えて反応を焼き付け、0.125Mの最終濃度を達成し、混合する。RTで5分間インキュベートし、氷の上で15分間インキュベートします。
  4. 遠心分離機 400 × G RT で 5 分間、4 °C で 10 分間;上清を捨てる25 mLの冷たいリン酸緩衝生理食塩分でペレットを慎重に再懸濁します。
  5. 400×gで400gで4°Cで10分間遠心し、上清を捨てます。
    注: プロトコルを続行する場合は、手順 2.1 に進み、lysis を使用します。それ以外の場合は、ペレットを液体N2 にフラッシュフリーズし、ペレットを-80°Cに保存します。

2. リシス

  1. 氷冷ライシスバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8;非イオン界面活性剤の0.2%)( 材料表参照)、10 mM NaCl;1xプロテアーゼ阻害剤)の1mLで細胞を再懸濁し、氷冷ライシスバッファーで体積を10 mLに調整します。106 細胞/mLの1×の濃度を得るためにボリュームを調整します。氷の上で30分間インキュベートし、チューブを反転して2分ごとに混合します。
  2. 4°Cで5分間300×gで核を遠心し、上清を慎重に捨てます。ペレット1xを1mLの冷たいリシスバッファーで洗浄し、マイクロ遠心チューブに移します。ペレット1xを1mLの冷たい1.25x制限バッファーで洗浄し、各細胞ペレットを360 μLの1.25x制限バッファーに再懸濁します。
  3. 1管当たり10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)11μL(最終濃度0.3%)を加え、ピペット処理で慎重に混合し、37°Cで45分間インキュベートし、700-950rpmで振ります。インキュベーション中に数回塊を破壊するために上下にピペット。
  4. 非イオン性界面活性剤(10%溶液、材料表を参照)をチューブあたり75μL(10%溶液、 材料表を参照)を加えてSDSをクエンチし、37°Cで45分間インキュベートし、950rpmで振る。インキュベーション中に塊を混乱させるために数回上下にピペット。
    注:束が大きく、破壊しにくい場合は、SDSおよび界面活性剤の処理中に回転速度を400rpmに下げます。塊がピペット処理によって分解しにくい場合は、サンプルを2つに分割します。制限バッファー、SDS、および界面活性剤の量を調整する。透過処理を進めます。次に、最小速度(200×g)で核を回転させ、上清を慎重に捨て、サンプルを1X制限バッファに一緒にプールし、消化を進めます。未消化サンプル(UD)として10μLアリコートを取る。

3. 酵素消化

  1. 1チューブ当たりMbo Iの200単位(U)を加えてクロマチンを消化し、回転しながら4時間から一晩(950rpm)の範囲の37°Cでインキュベートします。
  2. 翌日、チューブあたりMbo Iを50U追加し、回転しながら2時間37°Cでインキュベートします(950 rpm)。
  3. 60°Cで20分間チューブをインキュベートすることにより酵素を不活性化する。チューブを氷の上に置きます。
    注:10 μL アリコートを消化サンプルとして取ります (D)。

4. DNAのビオチン化終了

  1. 制限フラグメントのオーバーハングを埋め、DNAの端にビオチンを付けるには、10 mM dCTPをそれぞれ1.5 μL追加し、 dGTP、dTTP、0.4 mMビオチンdATPの20 μL、トリス低EDTA(TLE)バッファーの17.5 μL[10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH 8.0]、および10 μLの5 U/μLの5 U/μLの全ての断片に断片する。慎重に混ぜ、37°Cで75分間インキュベートします。 30 sの場合は10 sごとに700 rpmで振ります。ライゲーションミックスを準備しながら、氷の上にすべてのチューブを置きます。

5. ライゲーション

  1. 各消化クロマチン混合物を、ライゲーションミックス(10xライゲーションバッファーの100 μL、10 mg/mLのウシ血清アルブミンの10 μL、T4 DNAリガーゼの15 U、および425 μLの二重蒸留水[ddH2O])に移します。穏やかなピペットで十分に混ぜ、16°Cで一晩インキュベートします。

6. 架橋反転とDNA精製

  1. 1管あたり50mg/mLプロテイナーゼKを50μL加えてタンパク質を分解し、37°Cで2時間インキュベートします。温度を65°Cに上げることで逆クロスリンクし、一晩インキュベートします。
  2. 10 mg/mL RNase Aの20 μLを加えてRNAを分解し、37°Cで1時間インキュベートします。
  3. フェノール:クロロホルム抽出を行い、その後エタノール沈殿を行います。
    1. 1体積のフェノールクロロホルムを加え、反転によって十分に混ぜ合わせて均質な白相を得る。
      注:フェノールは有害な化学物質です。適切な安全衛生規則に従ってください。ヒュームフードで作業します。
    2. 15,000×gで遠心分離機を15分間使用します。水相を新しい2 mLマイクロ遠心チューブに移します。TLEバッファの100 μLで下層のバック抽出を行い、水相を同じ2 mLチューブに移します。
    3. 100%エチルアルコール(EtOH)の2体積、酢酸ナトリウム3Mの0.1容量、20mg/mLグリコーゲンの2μLを加えることによってDNAを沈殿させます。2時間から一晩の範囲の期間-20°Cでインキュベートする。
    4. 4°Cで30分間15,000×gで回転し、氷冷70%EtOHでペレット2倍を洗います。 RTでペレットを乾燥させ、TLEバッファの100 μLで再懸濁します。メーカーの指示に従ってDNAと蛍光計に選択的に結合する蛍光色素を用いてDNAを定量化する(材料表)。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。ライゲーション製品は、4 °C(短期)または-20°Cで長期間保存します。品質管理のために、合字サンプル(L)として材料のアリコート(100 ng)を使用してください。

7. Hi-C テンプレートの品質を評価する

  1. 消化および結紮の定性的制御
    1. 架橋を反転させることでUDおよびDアリコートからDNAを精製し、フェノール:クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を上述のように行う。
    2. 1.5%アガロースゲルにUD、D、およびLサンプルの100 ngをロードします。Dサンプルの約500bpを中心としたスミアとLサンプルの高分子量バンドを探します(代表的な結果を参照)。
  2. 消化効率定量制御
    注: 消化効率をより正確に評価するには、UD および D サンプルをテンプレートとして使用し、次のように設計されたプライマーを使用して定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) を実行します。
    1. 消化に使用される酵素のDNA制限部位を含むDNA断片を増幅するプライマーペア(本プロトコルではMbo I)を、ステップ7.2.3の式でRと呼ぶ。
    2. 消化に使用される酵素の制限部位を含まない制御DNA断片を増幅するプライマーペアを設計する(本プロトコルのMbo I)、ステップ7.2.3の式でCと呼ばれる。
    3. 増幅のサイクル閾値(Ct値)を使用して、以下の式に従って制限効率を計算します。
      % 制限 = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
      ここでCtRはフラグメントRのCt値を指し、CtCはサンプルDおよびサンプルUDのフラグメントCのCt値を指す。
      注:制限率は、制限DNA部位を含まないコントロール(C)DNA断片と比較して制限酵素が制限(R)DNA断片を切断する効率を反映している。80%≥の制限効率が推奨されます。
  3. 既知の相互作用の検出
    1. PCRを実行して内部ライゲーションコントロールを増幅し、短距離および/または中距離または長期相互作用を調べます(代表的な結果を参照)。
    2. あるいは、プライマーが隣接する制限フラグメントにおいて前方または逆方向にあるライゲーション生成物を増幅する設計プライマー。
  4. 充填およびビオチン標識制御
    1. 上述したように、ゲノム中の隣接する制限断片間の既知の相互作用またはライゲーション産物の増幅および消化によってHi-Cマーキングおよびライゲーション効率を検証する。
      注:Mbo Iサイト(GATC)の正常な充填およびライゲーションは、結紮接合部で制限酵素Cla I(ATCGAT)の新しい部位を生成し、Mbo Iサイトを再生します。
    2. PCR産物を Mbo I、Cla I、またはその両方で消化します。サンプルを1.5〜2%ゲルで実行した後、カットバンドとノーカットバンド26の強度を定量することにより、3CおよびHi-Cライゲーション接合部の相対数を推定する。
      注:70%>の効率が望まれます(代表的な結果を参照)。

8. 超音波処理

  1. サンプルを超音波処理して200-500 bp DNA断片を得る。このプロトコルで使用される装置(材料表を参照)については、サンプル(5~10 μg)を1管当たりdH2Oの130 μLで希釈し、400 bp:充填レベルに超音波処理するように装置を設定します。関税係数: 10% ;ピークインシデント電力(w):140;バーストあたりのサイクル数: 200;時間(s):80。

9. ビオチン除去/終了修復

注:以下に示すステップは、Hi-C DNAの5 μgに合わせて調整されています。

  1. ビオチン除去を行うために、サンプル(130 μL)を新しいマイクロ遠心分離管に移します。10xライゲーションバッファーの16 μL、10 mM dATP の 2 μL、T4 DNA ポリメラーゼの 5 μL (15U)、および 7 μL の ddH2O (全容量の 160 μL) を加えます。20°Cで30分間インキュベートします。
  2. 10 mM dNTPs 5 μL、10xライゲーションバッファー4 μL、T4ポリヌクレオチドキナーゼ5 μL(10 U/μL)、クレノウ1 μL、および25 μLのddH2O(総体積200μL)を加えます。20°Cで30分間インキュベートします。

10. サイズの選択

  1. 主に250-550 bpサイズの範囲の断片を選択するには、最初に0.6xで順次固相可逆固定化(SPRI)サイズ選択を行い、次いでメーカーの指示に従って0.90倍を選択し、100 μLのTLEを使用してDNAを溶出させます。

11. ビオチンプルダウン/Aテーリング/アダプターライゲーション

注:磁性ビーズを渦で再懸濁して、回転ホイールでサンプルを3分間回転させてから、サンプルを短時間回転させて磁気スタンドに置きます。ビーズを磁石に貼り付け、上澄み物を捨て、次の洗浄工程を進めます。回転ホイールの代わりに回転するサーモブロックで55°Cでの打ち付けを行います。

  1. TLEを使用して、最終ボリュームをサンプルあたり300 μLに設定します。ビーズ洗浄バッファーを準備する:1xトゥイーンバッファー(TB)(TB:5 mMトリスHCl pH 8.0、 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% トゥイーン), 0.5x TB, 1x No-Tween バッファー (NTB) (5 mM トリス HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
  2. ストレプトアビジンにリンクされた磁気ビーズをライブラリごとに150 μL( 材料表を参照)を使用します。ビーズ2xを400μLの1tbで洗います。その後、ビーズを300 μL 2x NTBで再懸濁します。
  3. ビーズを300 μL Hi-C材料と混合し、回転ホイールでRTで30分間インキュベートし、ビオチンがストレプトアビジンビーズに結合できるようにします。
  4. 400 μLの0.5x TBでビーズを洗浄し、55°Cで3分間インキュベートし、750 rpmで回転します。1x制限バッファーの200 μLでビーズを洗浄します。
  5. ビーズを100 μLのdATPテーリングミックス(5 μLの10 mM dATP、10x制限バッファの10 μL、クレノウエキソ-5 μL、ddH2Oの80 μL)で再懸濁します。37°Cで30分間インキュベートします。
  6. 上清を取り除き、55°Cで3分間インキュベートし、750rpmで回転させることで、ビーズ2xを0.5x TBの400 μLで洗浄します。
  7. 1x NTBの400 μLでビーズを洗浄し、1xライゲーションバッファーを100 μLで洗浄します。
  8. ビーズを50 μLの1xライゲーションバッファーに再懸濁し、懸濁液を新しいチューブに移します。4 μL のプレアニール型 PE アダプター (15 μM ストック) と 2 μL の T4 リガーゼ (400 U/μL、すなわち 800 U/チューブ) を追加します。RTで2時間インキュベートする。
    注: PE 1.0 および PE 2.0 アダプタ (30 μM ストック) の両方の等量を追加し、RT で 10 分間インキュベートすることでアダプタを事前アニールします( 資料表を参照)。
  9. 上清を取り除き、400 μLのTBでビーズを2倍洗ってビーズを取り戻します。1x NTBの200 μLでビーズを洗浄し、1x制限バッファを100 μLで洗浄し、ビーズを40 μLの1x制限バッファで再中断します。

12. PCR増幅

  1. 25 μL ボリュームの PCR を 5、6、7、8 サイクルで設定します。PCR ごとに、次の方法を使用します。
    反応レシピ
    ハイCビーズ2.5 μL
    10 μM PE PCR プライマー 1(材料表)0.75 μL
    10 μM PE PCR プライマー 2(材料表)0.75 μL
    10 mM dNTP0.6 μL
    5x反応バッファー5 μL
    DNAポリメラーゼ0.3 μL
    ddH2O14.65 μL
    トータル25 μL
    サイクル温度時間
    198°C30 s
    n サイクル98°C10 s
    65°C30 s
    72°C30 s
    172°C7分

13. 最終 PCR 増幅

  1. 上記と同じ条件と選択したサイクル数を使用して、最終PCR増幅を行います。50 μL反応で、5 μLのHi-Cビーズをテンプレートとしてサンプルを分割します。
  2. すべてのPCR反応を収集し、新鮮なチューブに転送します。磁石を使用してストレプトアビジンビーズを除去し、上清(PCR産物)を回収します。新しいチューブにビーズを移し、ステップ11.2.9に示すようにビーズを洗浄し、バックアップとして4°Cの1x制限バッファーに保管します。
  3. メーカーの指示に従って、SPRIビーズの量0.85倍を使用してPCR製品を精製してください。TLEバッファの30 μLとエルルート。
  4. 蛍光計測器を使用してHi-Cライブラリを定量化し、チップベースのキャピラリー電気泳動によりライブラリの品質を確認します。
  5. 最後の品質チェックポイントとして、ステップ12.1で説明したのと同じ条件を使用して10サイクルを使用してPCR反応を行うテンプレートとして、Hi-Cライブラリの1μLを使用します。PCR産物を2つのマイクロ遠心分離チューブに分けます:1つをCla Iで消化し、もう1つをコントロールとして未消化のままにします。1.5-2%アガロースゲルで製品を実行します(代表的な結果を参照)。
  6. 適切なシーケンスプラットフォーム上で 50 bp または 75 bp ペアエンドシーケンスに進みます。

結果

以下に、Hi-C プロトコルが正常に機能した結果を示します (図 1Aの Hi-C プロトコル ワークフローの概要を参照してください)。核のHi-C実験の間にはいくつかの品質管理のチェックポイントがある。サンプルアリコートは、(UD)および(D)後に、結紮後(L)と同様にクロマチン制限ステップを回収した。架橋を逆転させ、DNAを精製し、アガロースゲル上で動かした。Mbo Iとの制限...

ディスカッション

ここで提示される核中のHi-C法は、ショウジョウバエゲノムトポロジーの詳細な探索を高解像度で可能にし、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節要素間のクロマチンループからTADおよび大きなコンパートメント識別25までの異なるゲノムスケールでのゲノム相互作用の図を提供する。同じ技術は、いくつかの修飾33を有する哺乳類組織にも効率的に?...

開示事項

著者らは競合する利益を宣言しない。

謝辞

この研究は、UNAM技術イノベーション研究支援プログラム(PAPIIT)助成金番号IN207319と科学技術国家評議会(CONACyT-FORDECyT)助成金番号303068によって支援されました。A.E.-L.科学技術国家評議会(CONACyT)CVU番号968128によってサポートされている修士課程の学生です。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
16% (vol/vol) paraformaldehyde solutionAgar ScientificR1026
Biotin-14-dATPInvitrogenCA1524-016
ClaI enzymeNEBR0197S
COVARIS UltrasonicatorCovarisLE220-M220
Cut SmartNEBB72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1xLife Technologies41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1Invitrogen65002
Fetal bovine serum (FBS) sterile filteredSigmaF9665
Klenow Dna PolI large fragmentNEBM0210L
Klenow exo(-)NEBM0210S
Ligation BufferNEBB020S
MboI enzymeNEBR0147M
NP40-IgepalSIGMACA-420Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer
PE adapter 1.0Illumina5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'
PE adapter 2.0Illumina5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 1.0Illumina5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 2.0Illumina5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1SIGMAP2069
Primer 1 (known interaction, Figure 2A)Sigma5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
Primer 2 (known interactions, Figure 2A)Sigma5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
Protease inhibitor cocktail tabletRoche4693132001
Proteinase KRoche3115879001
QubitThermoFisherQ33327
RNAseRoche10109142001
SPRI BeadsBeckmanB23318
T4 DNA ligaseInvitrogen15224-025
T4 DNA polymeraseNEBM0203S
T4 polynucleotide kinase (PNK) NEBM0201L
TaqPhusionNEBM0530SDNA polymerase
Triton X-100Non-ionic surfactant for quenching of SDS

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