ショウジョウバエ細胞におけるイン核Hi-C

要約

ゲノムは核空間内で異なる構造に編成され、染色体立体構造の捕捉技術によって明らかにすることができる。核内Hi-C法は、ショウジョウバエ細胞株におけるクロマチン相互作用のゲノム全体のコレクションを提供し、制限フラグメントレベルでメガベース解像度で探索できる接触マップを生成する。

要約

ゲノムは、ドメイン間の相互作用を分離する境界によって区切られたトポロジカルに関連付けられたドメイン(TAD)に編成される。ショウジョウバエでは、TADの形成と境界の根底にあるメカニズムはまだ調査中です。ここで説明する核内Hi-C法の適用は 、ノッチ 遺伝子を単離するTAD境界における建築タンパク質(AP)結合部位の機能を解剖するのに役立った。APの損失を引き起こすドメイン境界の遺伝子改変は、TAD融合、転写欠陥、および長距離トポロジカル変化をもたらす。これらの結果は、ショウジョウバエにおけるドメイン境界形成および遺伝子発現制御に対する遺伝要素の寄与を示す証拠を提供した。ここでは、核内Hi-C法について詳細に説明し、これはプロトコルと共に実験の品質を評価するための重要なチェックポイントを提供する。また、異なるゲノムスケールでゲノム相互作用を分析するために必要なシーケンシング読み取り数と有効なHi-Cペアも示されています。CRISPR/Cas9は、この核内Hi-Cプロトコルを用いたゲノム相互作用の調節要素の遺伝子編集と高解像度プロファイリングを、遺伝的要素の構造機能の調査のための強力な組み合わせとなり得る。

概要

真核生物では、ゲノム^は第1相間の核空間内の特定の領域を占める染色体に分割される。染色体を形成するクロマチンは、転写的に寛容であるアクセス可能なクロマチンの1つと、転写的に抑制的なコンパクトクロマチンの2つの主要な状態に分けることができます。これらのクロマチン状態は、核空間で分離し、めったに混ざらず、核²に2つの異なるコンパートメントを形成する。サブメガベーススケールでは、境界は、染色体組織^3、4、5をマークするTADと呼ばれる高周波クロマチン相互作用のドメイン^を分離します。哺乳類では、TAD境界は、凝集およびCCCTC結合因子(CTCF)6、7、8によって占め^られます。凝集複合体は、安定したクロマチンループ9、10、13、14を形成するためにゲノム配列において収束配向で配置されたCTCF結合部位においてクロマチンを押し出し

プロトコル

1. 固定

1. 1000万のシュナイダーのライン2プラス(S2R+)細胞から始め、室温(RT)で10%のウシ胎児血清(FBS)を含むシュナイダー培地で17.5mLの細胞懸濁液を調製する。
2. メタノールフリーホルムアルデヒドを添加し、2%の最終濃度を得る。RTで10分間混ぜてインキュベートし、毎分混ぜるように注意してください。
   注意:ホルムアルデヒドは有害な化学物質です。適切な安全衛生規則に従い、ヒュームフードで作業してください。
3. グリシンを加えて反応を焼き付け、0.125Mの最終濃度を達成し、混合する。RTで5分間インキュベートし、氷の上で15分間インキュベートします。
4. 遠心分離機 400 × G RT で 5 分間、4 °C で 10 分間;上清を捨てる25 mLの冷たいリン酸緩衝生理食塩分でペレットを慎重に再懸濁します。
5. 400×gで400gで4°Cで10分間遠心し、上清を捨てます。
   注: プロトコルを続行する場合は、手順 2.1 に進み、lysis を使用します。それ以外の場合は、ペレットを液体_N2 にフラッシュフリーズし、ペレットを-80°Cに保存します。

2. リシス

1. 氷冷ライシスバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8;非イオン界面活性剤の0.2%)(

結果

以下に、Hi-C プロトコルが正常に機能した結果を示します (図 1Aの Hi-C プロトコル ワークフローの概要を参照してください)。核のHi-C実験の間にはいくつかの品質管理のチェックポイントがある。サンプルアリコートは、(UD)および(D)後に、結紮後(L)と同様にクロマチン制限ステップを回収した。架橋を逆転させ、DNAを精製し、アガロースゲル上で動かした。Mbo Iとの制限.......

ディスカッション

ここで提示される核中のHi-C法は、ショウジョウバエゲノムトポロジーの詳細な探索を高解像度で可能にし、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節要素間のクロマチンループからTADおよび大きなコンパートメント識別²⁵までの異なるゲノムスケールでのゲノム相互作用の図を提供する。同じ技術は、いくつかの修飾³³を有する哺乳類組織にも効率的に?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% (vol/vol) paraformaldehyde solution	Agar Scientific	R1026
Biotin-14-dATP	Invitrogen	CA1524-016
ClaI enzyme	NEB	R0197S
COVARIS Ultrasonicator	Covaris	LE220-M220
Cut Smart	NEB	B72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x	Life Technologies	41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1	Invitrogen	65002
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered	Sigma	F9665
Klenow Dna PolI large fragment	NEB	M0210L
Klenow exo(-)	NEB	M0210S
Ligation Buffer	NEB	B020S
MboI enzyme	NEB	R0147M
NP40-Igepal	SIGMA	CA-420	Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer
PE adapter 1.0	Illumina	5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'
PE adapter 2.0	Illumina	5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 1.0	Illumina	5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 2.0	Illumina	5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1	SIGMA	P2069
Primer 1 (known interaction, Figure 2A)	Sigma	5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
Primer 2 (known interactions, Figure 2A)	Sigma	5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
Protease inhibitor cocktail tablet	Roche	4693132001
Proteinase K	Roche	3115879001
Qubit	ThermoFisher	Q33327
RNAse	Roche	10109142001
SPRI Beads	Beckman	B23318
T4 DNA ligase	Invitrogen	15224-025
T4 DNA polymerase	NEB	M0203S
T4 polynucleotide kinase (PNK)	NEB	M0201L
TaqPhusion	NEB	M0530S	DNA polymerase
Triton X-100			Non-ionic surfactant for quenching of SDS