드로소필라 세포의 인핵 하이-C

요약

게놈은 핵 공간에서 염색체 형성 포획 기술을 통해 드러나게 할 수 있는 다른 구조물로 조직됩니다. 핵 내 Hi-C 방법은 드로소필라 세포주에서 크로마티닌 상호작용의 게놈 전체 컬렉션을 제공하며, 이는 제한 단편 수준에서 메가베이스 해상도로 탐색할 수 있는 접촉 맵을 생성합니다.

초록

게놈은 도메인 간의 상호 작용을 격리하는 경계에 의해 구분되는 토폴로지적으로 연관된 도메인(TADs)으로 구성됩니다. Drosophila에서 TAD 형성과 경계의 기본 메커니즘은 여전히 조사 중입니다. 여기에 설명된 핵 내 Hi-C 방법의 적용은 노치 유전자를 분리하는 TAD 경계에서 건축 단백질(AP)결합 부위의 기능을 해부하는 데 도움이 되었다. AP의 손실을 일으키는 도메인 경계의 유전자 변형은 TAD 융합, 전사 결함 및 장거리 토폴로지 변경을 초래합니다. 이 결과는 Drosophila에 있는 도메인 경계 형성 및 유전자 발현 통제에 유전 요소의 기여를 보여주는 증거를 제공했습니다. 여기서, 핵 내 Hi-C 방법은 프로토콜과 함께 실험의 품질을 평가하기 위한 중요한 체크포인트를 제공하는 상세하게 기술되었다. 또한 다른 게놈 비늘에서 게놈 상호 작용을 분석하기 위해 시퀀싱 판독 및 유효한 Hi-C 쌍의 필요한 숫자가 도시되어 있습니다. CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집 은 규제 요소의 유전자 편집 및 이 핵 내 Hi-C 프로토콜을 사용하여 게놈 상호 작용의 고해상도 프로파일링은 유전 적 요소의 구조적 기능의 조사를위한 강력한 조합이 될 수 있습니다.

서문

진핵생물에서, 게놈은^1단계도중 핵 공간에 있는 특정 영토를 차지하는 염색체로 분할된다. 염색체를 형성하는 염색체는 두 개의 주요 국가로 나눌 수 있습니다: 전사적으로 허용되는 접근 가능한 크로마틴 의 하나, 그리고 전사적으로 억압되는 소형 크로마틴의 다른. 이 크로마틴 상태는 핵^2에두 개의 뚜렷한 구획을 형성하여 핵 공간에서 분리하고 거의 혼합되지 않습니다. 서브 메가베이스 척도에서 경계는 염색체조직^3,4,5를표시하는 TAD라는 고주파 크로마틴 상호 작용의 도메인을 분리합니다. 포유류에서 TAD 경계는 응집력 및 CCCTC 결합 계수(CTCF)^6,7,8에의해 점령된다. 응집력 복합체는 크롬라틴을 압출하고 유전체 서열에서 수렴 방향으로 배치되는 CTCF 결합 부위에서 정지하여 안정적인 크로마틴 루프^{9,10,13,14를}형성한다. CTCF DNA 결합 부위의 유전적 중단은 CTCF 및 응집력 있는 단백질 풍부의 경계 또는 감소로 조절 원소, TAD 형성의 손실 및 유전자 발현 완화^{9,10, 11,13,14}사이의 비정상적인 상호 작용을 초래한다.

드로소필라에서, TAD사이의 경계는 경계 요소 관련 인자 32 kDa(BEAF-32), 모티프 1 결합 단백질(M1BP), 센트로소말 단백질 190(CP190), 털이 날개(SuHW), 및 CTCF를 포함한 여러 EP에 의해 점유되고, 그의 변형 및^18,18,폴리머1에서 풍부하게 된다. 드로소필라에서는^13,17,19의전사의 결과로 TAD가 나타나고 경계 형성 및 절연 특성에서 독립적 인 AP의 정확한 역할은 아직 조사 중입니다. 따라서, Drosophila의 도메인이 유사한 전사 상태의 영역 집합의 유일한 결과인지 또는 CTCF를 포함한 AP가 경계 형성에 기여하는지 여부는 완전히 특징지어져야 한다. 차세대 시퀀싱과 결합된 염색체 형태 포획 기술의 개발을 통해 고해상도에서 게놈 접촉의 탐사가 가능해졌습니다. Hi-C 프로토콜은 크로마틴 단편 간의 스퓨리어스 결찰 제품을 피하기 위해 "솔루션"^2를 수행한 결찰 단계로 처음 설명되었다. 그러나, 여러 연구는 데이터에서 유용한 신호가 용액^20,21에없었던 부분적으로 리세드 핵에서 형성된 결찰 제품으로부터 왔다는 것을^{깨달았다.}

그런 다음 프로토콜은 단일 세포 Hi-C^{실험(22)의}일부로 핵 내부의 결찰을 수행하도록 수정하였다. 핵 내 Hi-C 프로토콜은 이후 세포 인구 Hi-C에 통합되어 전체 범위의 게놈 거리에서 보다 일관된 커버리지를 산출하고 덜 기술적^{노이즈(23,24)로}데이터를 생성한다. 여기서 상세히 기술된 프로토콜은, 핵 내^{의정서(23,24)를} 기반으로 하며 드로소필라(Drosophila)의 노치 유전자 궤적에서 도메인 경계에서 CTCF 및 M1BP에대한 DNA 결합 모티브를 유전적으로 제거하는 결과를 조사하는 데 사용되었다. 결과는 경계에 있는 AP를 위한 DNA 결합 모티프를 바꾸는 것은 노치 도메인 형성, 노치 메큐를 둘러싼 지역에 있는 더 큰 토폴로지 결함 및 유전자 발현 변압에 대한 과감한 결과를 가지고 있다는 것을 보여줍니다. 이것은 도메인 경계에 있는 유전 원소가 Drosophila^25에있는 게놈 토폴로지 및 유전자 발현의 유지를 위해 중요하다는 것을 표시합니다.

프로토콜

1. 고정

1. 1,000만 개의 슈나이더 라인 2 플러스(S2R+) 세포로 시작하여 실온(RT)에서 10%의 태아 소 혈청(FBS)을 함유한 슈나이더 배지에서 세포 현탁액 17.5mL를 준비합니다.
2. 메탄올이 없는 포름알데히드를 첨가하여 최종 농도를 2%로 얻습니다. RT에서 10분 동안 혼합하고 인큐베이션을 사용하여 매 분마다 섞어 주시합니다.
   참고: 포름알데히드는 유해 화학물질입니다. 적절한 건강 및 안전 규정을 따르고 연기 후드에서 작업하십시오.
3. 글리신을 첨가하여 반응을 담결하여 0.125 M의 최종 농도를 달성하고 혼합한다. RT에서 5분 동안 배양하고 얼음에 15분이 면됩니다.
4. 400 × G의 원심분리기는 RT에서 5분 동안, 그리고 4°C에서 10분 동안; 상부체를 폐기합니다. 차가운 1x 인산염 완충식식염 의 25 mL에서 조심스럽게 펠릿을 다시 중단합니다.
5. 4°C에서 10분 동안 400 × g의 원심분리기는 상수부를 폐기합니다.
   참고: 프로토콜을 계속 계속하면 용해의 경우 2.1단계로 이동하십시오. 그렇지 않으면, 액체 N_2에 펠릿을 플래시 동결하고 -80 °C에 펠릿을 저장합니다.

2. 리시스

1. 얼음-차가운 용해 완충제(10m Tris-HCl, pH 8; 비이온 계면활성제의 0.2%)로 세포를 재연하고,10mMM NaCl; 1x 프로테아제 억제제 참조), 얼음 냉기 용해 완충제로 10mL로 체적을 조절한다. 1 × 10⁶ 셀/mL의 농도를 얻기 위해 부피를 조정합니다. 30분 동안 얼음에 배양하여 튜브를 반전시켜 2분간격으로 섞습니다.
2. 4°C에서 5분 동안 300 × g에서 핵을 원심분리한 다음 주체를 조심스럽게 폐기합니다. 차가운 리시스 버퍼 1mL로 펠릿 1x를 씻고 마이크로 센트심분리기 튜브로 옮춥니까. 1mL의 차가운 1.25x 제한 버퍼로 펠릿 1x를 세척하고 각 셀 펠릿을 1.25x 제한 버퍼의 360 μL로 재보설한다.
3. 튜브 당 10% 나트륨 도데딜 황산염(SDS)의 11μL을 넣고 튜브(0.3% 최종 농도)로 조심스럽게 섞고, 37°C에서 45분 동안 배양하고 700-950 rpm에서 흔들어 주세요. 배양 중에 몇 번 덩어리를 방해하기 위해 위아래로 파이프.
4. 비이온 계면활성제의 75 μL(10% 용액, 재료표참조)을 튜브당 (1.6% 최종 농도)를 추가하고, 37°C에서 45분 동안 배양하여 950rpm에서 흔들어 SDS를 담급니다. 인큐베이션 중에 덩어리를 방해하기 위해 몇 번 위아래로 파이프.
   참고: 덩어리가 크고 방해가 어려운 경우 SDS 및 계면 활성제 치료 중 회전 속도를 400rpm으로 줄입니다. 덩어리가 파이펫팅으로 분해되기 어려운 경우 샘플을 두 개로 분할합니다. 제한 버퍼, SDS 및 계면 활성제의 볼륨을 조정합니다. 투과성화를 진행한다. 다음으로, 최소 속도(200 × g)로핵을 회전시키고, 주체를 조심스럽게 버리고, 1X 제한 버퍼로 샘플을 함께 풀링하고, 소화를 진행한다. 소화되지 않은 샘플(UD)으로 10 μL 알리쿼트를 가져 가라.

3. 효소 소화

1. 크롬토닌을 튜브당 Mbo I의 200대(U)를 추가하여 소화하고, 회전시 4시간에서 하룻밤 사이에 37°C에서 배양한다(950rpm).
2. 다음 날에는 튜브당 50U의 Mbo I를 추가하고 회전하는 동안 37 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오 (950 rpm).
3. 20 분 동안 60 °C에서 튜브를 배양하여 효소를 비활성화합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
   참고: 소화된 샘플(D)으로 10 μL 알리쿼트를 섭취하십시오.

4. DNA 끝의 생물학적

1. 제한 조각 오버행을 채우고 DNA 끝을 비오틴으로 표시하려면 각각 10mM dCTP의 1.5 μL을 추가하십시오. dGTP, dTTP, 0.4mm 비오틴 dATP의 20 μL, 트리스 저-EDTA(TLE) 버퍼의 17.5 μL [10m MM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0], 클렘의 5 U/μL(DNA) 37°C에서 75분 동안 조심스럽게 섞어서 배양합니다. 30 s에 대 한 10 s 마다 700 rpm에서 흔들어. 결찰 믹스를 준비하는 동안 모든 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

5. 결찰

1. 각 소화된 크로마틴 혼합물을 결찰 혼합으로 별도의 1mL 튜브로 옮기십시오(10x 결찰 버퍼의 100 μL, 10 mg/mL 소 세럼 살부 알부민의 10 μL, T4 DNA 리게아제 의 U 15, 이중 증류수 425 μL[ddH₂O]). 부드러운 파이펫팅으로 철저히 섞고 16°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

6. 크로스 링크 반전 및 DNA 정화

1. 튜브 당 10 mg / mL Proteinase K의 50 μL을 첨가하여 단백질을 저하시키고 2 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오. 온도를 65°C로 높이고 하룻밤 동안 배양하여 크로스링크를 역방향으로 연결합니다.
2. RNA를 10 mg/mL RNase A의 20 μL을 첨가하여 RNA를 저하시키고, 1h에 대해 37°C에서 배양한다.
3. 페놀:클로로폼 추출을 수행한 다음 에탄올 강수량을 수행합니다.
   1. 페놀 클로로폼 1부피를 넣고 반전으로 철저히 섞어 균일한 백색 상을 얻습니다.
      참고: 페놀은 유해한 화학물질입니다. 적절한 건강 및 안전 규정을 따르십시오. 연기 후드에서 작업.
   2. 15분 × 동안 15,000 g의 원심분리기. 수성 상면을 신선한 2mL 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기. TLE 버퍼의 100 μL로 하부 층의 백 추출을 수행하고 수성 위상을 동일한 2mL 튜브로 옮춥니까.
   3. 100% 에틸 알코올(EtOH), 3M 나트륨 아세테이트의 0.1부, 20 mg/mL 글리코겐의 2μL을 첨가하여 DNA를 침전시한다. -20°C에서 하룻밤 사이에 2h에 이르는 기간 동안 배양한다.
   4. 4°C에서 30분 동안 15,000 × g에서 회전하고, 얼음차가운 70% EtOH로 펠릿 2x를 세척합니다. RT에서 펠릿을 건조하고 TLE 버퍼의 100 μL에서 다시 중단하십시오. 제조 업체의 지침(재료의 표)에따라 DNA와 불소계에 선택적으로 결합하는 불소 염료를 사용하여 DNA를 정량화한다.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 단기 또는 -20 °C에서 장기적으로 4 °C에서 리기션 제품을 저장합니다. 품질 관리를 위해 리게티드 샘플(L)으로 재료의 알리쿼트(100 ng)를 사용한다.

7. Hi-C 템플릿 품질 평가

1. 소화 및 결찰 질적 컨트롤
   1. 교차 링크를 반전시켜 UD 및 D 알리쿼트에서 DNA를 정화하고, 위에서 설명한 바와 같이 페놀:클로로폼 추출 및 에탄올 침전을 수행한다.
   2. 1.5% 아가로즈 젤에 UD, D 및 L 샘플의 100 ng를 로드합니다. L 샘플에 대 한 높은 분자 량 대역 대 D 샘플에서 500 bp 를 중심으로 얼룩을 찾습니다 (대표 결과 참조).
2. 소화 효율 정량 제어
   참고: 소화 효율을 보다 정확하게 평가하기 위해 UD 및 D 샘플을 템플릿으로 사용하여 다음과 같이 설계된 프라이머를 사용하여 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)을 수행합니다.
   1. 7.2.3 단계에서 포뮬러에서 R이라고 불리는 소화(현재 프로토콜에서 Mbo I)를 위해 사용되는 효소에 대한 DNA 제한 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍을 설계한다.
   2. 7.2.3 단계에서 C라고 불리는 소화에 사용되는 효소(Mbo I)에 대한 제한 부위를 포함하지 않는 대조군 DNA 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍을 설계한다.
   3. 아래 표시된 수식에 따라 제한 효율을 계산하기 위해 증폭의 주기 임계값(Ct 값)을 사용합니다.
      % 제한 = 100 - 100 /2^{{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}}
      CtR이 조각 R의 Ct 값을 참조하고 CtC는 샘플 D 및 샘플 UD용 조각 C의 Ct 값을 나타냅니다.
      참고: 제한 백분율은 제한 DNA 부위를 포함하지 않는 대조군(C) DNA 단편에 비해 제한된(R) DNA 단편을 분비하는 제한 효소의 효율을 반영한다. 80%≥ 제한 효율을 권장합니다.
3. 알려진 상호 작용 감지
   1. PCR을 수행하여 내부 결찰 제어를 증폭하여 단거리 및/또는 중장거리 상호 작용을 검사합니다(대표 결과 참조).
   2. 또는 프라이머가 인접한 제한 조각에서 전방 또는 역방향 방향에 있는 계각 생성물을 증폭하도록 설계 할 수 있습니다.
4. 채우기 및 비오틴 라벨링 제어
   1. 위에서 설명한 바와 같이 게놈내의 인접 제한 단편 간의 알려진 상호 작용 또는 결찰 생성물의 증폭 및 소화에 의한 Hi-C 마킹 및 결찰 효율을 검증한다.
      참고: Mbo I 사이트(GATC)의 성공적인 채우기 및 결찰은 결찰 접합부에서 제한 효소 Cla I(ATCGAT)에 대한 새로운 부위를 생성하고 Mbo I 사이트를 재생합니다.
   2. Mbo I, Cla I 또는 둘 다로 PCR 제품을 소화합니다. 1.5-2% 젤에서 샘플을 실행한 후, 컷 및 절단 해제^{밴드(26)의}강도를 정량화하여 3C 및 Hi-C 계합 접합의 상대적 수를 추정한다.
      참고: 70%> 효율이 필요합니다(대표 결과 참조).

8. 초음파 처리

1. 200-500 bp DNA 단편을 얻기 위해 샘플을 초음파 처리합니다. 이 프로토콜에 사용되는 계측기의 경우(재료표참조), 튜브당 ddH₂O의 130 μL에서 샘플을 희석하고 400 bp로 초음파 처리하도록 계측기를 설정: 채우기 레벨: 10; 관세 요인: 10%; 피크 인시던트 전원(w): 140; 버스트당 사이클: 200; 시간(들): 80.

9. 비오틴 제거/엔드 수리

참고: 아래 표시된 단계는 Hi-C DNA 의 5 μg에 대해 조정됩니다.

1. 비오틴 제거를 수행하기 위해 시료(130 μL)를 신선한 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오. 10x 결찰 버퍼 16μL, 10mM dATP 2μL, T4 DNA 폴리머라제 5μL(15U), ddH₂O(총 부피 160μL)를 추가합니다. 20 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
2. 10mM dNTPs5 μL, 10배 결찰 버퍼 4μL, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 5μL(10 U/μL), 클레나우 1μL, ddH_2O(총부피 200μL)를 추가합니다. 20 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.

10. 크기 선택

1. 주로 250-550 bp 크기 범위에서 조각을 선택하려면 순차적 고체 위상 가역 고정(SPRI) 크기 선택을 0.6배로 먼저 수행하고 제조업체의 지침에 따라 0.90배, TLE100 μL을 사용하여 DNA를 엘ute한다.

11. 비오틴 풀다운/A-테일링/어댑터 리칭

참고: 소용돌이에 의해 자기 구슬을 다시 일시 중지하고, 회전 휠에서 3분 동안 샘플을 회전한 다음, 샘플을 잠시 회전시켜 자기 스탠드에 놓음으로써 세서스를 수행합니다. 구슬이 자석에 달라붙고, 상체를 버리고, 다음 세척 단계를 진행하도록 한다. 회전 휠 대신 회전하여 열 블록에서 55°C에서 세차작업을 수행합니다.

1. 최종 부피를 TLE로 샘플당 300 μL로 구성하여 풀다운합니다. 비드 세척 버퍼 준비: 1x 트위엔 버퍼 (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% 트위엔), 0.5x TB, 1x 노-트웬 버퍼(NTB) (5mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
2. 라이브러리당 스트렙타비딘과 연결된 자기 구슬 150μL을 사용하십시오(재료표참조). 1x TB의 400 μL로 구슬 2배 세척합니다. 그런 다음 300 μL 2x NTB로 구슬을 다시 일시 중지합니다.
3. 구슬을 300 μL Hi-C 재료와 혼합하고 회전 휠에서 30분 동안 RT에서 인큐베이션하여 비오틴이 스트렙타비딘 구슬에 결합할 수 있도록 합니다.
4. 구슬을 0.5배 TB400μL로 세척하고 55°C에서 3분 동안 배양하여 750rpm에서 회전합니다. 1x 제한 버퍼의 200 μL에서 구슬을 세척합니다.
5. dATP 테일링 믹스의 100 μL (10mM dATP의 5 μL, 10 x 제한 버퍼의 10 μL, Klenow 엑소의 5 μL, ddH₂O의 80 μL)의 구슬을 재연합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
6. 상류제를 제거하고, 55°C에서 3분 동안 배양하고 750 rpm에서 회전하여 0.5배 TB의 400 μL로 구슬 2x를 세척한다.
7. 구슬을 1x NTB의 400 μL로 씻은 다음 1x 결찰 버퍼의 100 μL로 세척합니다.
8. 1x 계합 버퍼의 50 μL에서 구슬을 다시 중단하고 현탁액을 새 튜브로 옮기습니다. 사전 어댑터(15μM 스톡)와 T4 리개제 2μL(400 U/μL, 즉 800 U/Tube)의 4μL을 추가합니다. 2 시간 동안 RT에서 인큐베이션하십시오.
   참고: PE 1.0 및 PE 2.0 어댑터(30μM 스톡)의 동일한 볼륨을 추가하고 RT에서 10분 동안 인큐베이팅하여 어댑터를 미리 작성합니다(재료 표참조).
9. 슈퍼나탄을 제거하고 400 μL의 TB로 구슬 2x를 세척하여 구슬을 다시 캡처합니다. 1x NTB의 200 μL로 구슬을 씻은 다음 1배 제한 버퍼의 100 μL로 구슬을 세척하고 1배 제한 버퍼의 40μL로 구슬을 재제한합니다.

12. PCR 증폭

1. 5, 6, 7 및 8 사이클로 25 μL 부피의 PcR을 설정합니다. 각 PCR에 대해 다음을 사용하십시오.

   반응 레시피
   하이-C 구슬	2.5 μL
   10 μM PE PCR 프라이머 1 (재료 의 표)	0.75 μL
   10 μM PE PCR 프라이머 2 (재료 의 표)	0.75 μL
   10mM dNTP	0.6 μL
   5x 반응 버퍼	5 μL
   DNA 폴리머라제	0.3 μL
   ddH2O	14.65 μL
   합계	25 μL

   사이클	온도	시간
   1	98 °C	30 s
   n 주기	98 °C	10 s
   	65 °C	30 s
   	72 °C	30 s
   1	72 °C	7분

13. 최종 PCR 증폭

1. 위에서 설명한 것과 동일한 조건과 선택한 사이클 수를 사용하여 최종 PCR 증폭을 수행합니다. 50 μL 반응에서 5 μL의 Hi-C 구슬을 템플릿으로 사용하여 샘플을 분할합니다.
2. 모든 PCR 반응을 수집하고 신선한 튜브로 전송합니다. 자석을 사용하여 스트렙타비딘 구슬을 제거하고 상체(PCR 제품)를 복구합니다. 구슬을 신선한 튜브로 옮기고, 11.2.9 단계에서 표시된 대로 구슬을 세척하고, 백업으로서 4°C에서 1x 제한 버퍼에 저장한다.
3. 제조업체의 지침에 따라 SPRI 구슬의 부피0.85배를 사용하여 PCR 제품을 정화합니다. 30μL의 TLE 버퍼를 갖춘 엘루트.
4. 불소 계측기를 사용하여 Hi-C 라이브러리를 정량화하고 칩 기반 모세관 전기포광에 의한 라이브러리의 품질을 확인합니다.
5. 마지막 품질 검사점으로서 Hi-C 라이브러리의 1 μL을 템플릿으로 사용하여 12.1 단계에서 설명된 동일한 조건을 사용하여 10사이클을 사용하여 PCR 반응을 수행합니다. PCR 제품을 두 개의 미세원심분리기 튜브로 나눕니다: Cla I로 하나를 소화하고 다른 하나는 대조군으로 소화되지 않은 상태로 둡니다. 1.5~2% 아가로즈 젤로 제품을 실행합니다(대표 결과 참조).
6. 적절한 시퀀싱 플랫폼에서 50bp 또는 75bp 페어링 엔드 시퀀싱으로 진행합니다.

결과

다음은 성공적인 Hi-C 프로토콜의 결과입니다(그림 1A의Hi-C 프로토콜 워크플로우 요약 참조). 핵 하이-C 실험 중에는 여러 가지 품질 관리 검사점이 있습니다. 샘플 알리쿼트는 (UD) 및 후 (D) 크로마틴 제한 단계뿐만 아니라 결찰 후(L)를 수집하였다. 크로스링크는 반전되었고, DNA는 정제되어 아가로즈 젤로 실행되었다. Mbo에 대한 제한이 성공했을 때 200-1000 bp의 얼룩이 관찰되었?...

토론

여기에 제시된 핵 내 Hi-C 방법은 고해상도로 드로소필라 게놈 토폴로지의 상세한 탐구를 허용하고, 발기인과 증강제 와 같은 조절 요소 간의 크로마틴 루프에서 부터 TAD 및 대형 구획^{식별(25)에}이르기까지 다양한 게놈 비늘에서 게놈 상호 작용의 전망을 제공한다. 동일한 기술은 또한 일부 수정^33을가진 포유류 조직에 효율적으로 적용되었습니다. 예를 들어, 단?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% (vol/vol) paraformaldehyde solution	Agar Scientific	R1026
Biotin-14-dATP	Invitrogen	CA1524-016
ClaI enzyme	NEB	R0197S
COVARIS Ultrasonicator	Covaris	LE220-M220
Cut Smart	NEB	B72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x	Life Technologies	41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1	Invitrogen	65002
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered	Sigma	F9665
Klenow Dna PolI large fragment	NEB	M0210L
Klenow exo(-)	NEB	M0210S
Ligation Buffer	NEB	B020S
MboI enzyme	NEB	R0147M
NP40-Igepal	SIGMA	CA-420	Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer
PE adapter 1.0	Illumina	5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'
PE adapter 2.0	Illumina	5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 1.0	Illumina	5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3'
PE PCR primer 2.0	Illumina	5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'
Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1	SIGMA	P2069
Primer 1 (known interaction, Figure 2A)	Sigma	5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'
Primer 2 (known interactions, Figure 2A)	Sigma	5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'
Protease inhibitor cocktail tablet	Roche	4693132001
Proteinase K	Roche	3115879001
Qubit	ThermoFisher	Q33327
RNAse	Roche	10109142001
SPRI Beads	Beckman	B23318
T4 DNA ligase	Invitrogen	15224-025
T4 DNA polymerase	NEB	M0203S
T4 polynucleotide kinase (PNK)	NEB	M0201L
TaqPhusion	NEB	M0530S	DNA polymerase
Triton X-100			Non-ionic surfactant for quenching of SDS