成体マウスへの新生児マウス心臓マクロファージ移植

要約

新生児心臓マクロファージの成人マウス心臓への移植と移植のプロトコルを提供し、心臓修復を促進する有望な方法となり得る。

要約

負傷した新生児心筋では、マクロファージは心筋細胞増殖および血管新生を促進し、心臓再生を促進する。本研究は、傷害によって採用された新生児心臓マクロファージの移植が心機能および心筋細胞増殖の改善を伴う心筋梗塞後の成人心臓再生を促進することを明らかにした。この結果は、新生児心臓マクロファージ移植が心臓傷害治療の有望な戦略である可能性があることを示している。ここでは、頭膜切除術を受けた新生児マウス心臓からの新生児心臓マクロファージの分離、心筋梗塞型成体マウスへのマクロファージの移植、マクロファージ移植後の心臓再生の推定など、技術的な詳細を提供する。

概要

心臓再生は、心臓損傷後に心機能を回復し^{、心不全1、2、3}から保護するための有望な戦略です。心筋損傷の後、マクロファージは、損傷した心臓に浸透し、新生児の心臓再生^4、5、6の間に重要な要因として探求されてきた。壊死性細胞の破片を除去し炎症を誘発することに加えて、マクロファージは新生児マウスの心筋梗塞後に血管新生⁵および心筋細胞増殖⁷を促進する。

我々の以前の研究は、負傷した新生児心臓から分離された新生児心臓マクロファージの移植が成人心臓再生⁷を高めることを示し、新生児心臓マクロファージ移植が心臓損傷を治療するための有望な戦略となり得ることを示している。ここでは、経道切除術を受けた新生児マウス心臓からの新生児心臓マクロファージの分離、心筋梗塞型成体マウスへのマクロファージ移植、マクロファージ移植後の心臓再生の推定など、技術的な詳細を提供します(図1)。

プロトコル

すべての実験は、実験動物の使用とケアのためのガイドに従って行われました。すべての動物の議定書は、機関動物のケアと使用委員会(IACUC)、ふワイ病院、中国医学アカデミーによって承認されました。手術部位の汚染を防ぐために、手順全体を通して無菌技術が必要です。

1. 新生児1日 Cx3cr1 ^GFP/+ マウスのアプリカル切除手術(C57BL/6 バックグラウンド)

1. 麻酔
   1. ケージからすべてのマウスの子犬を取り出し、きれいな乾燥した箱に入れます。
   2. 各マウスを氷の中に約2〜3分間埋め込みます。凍傷を防ぐために、氷とマウスの子犬の間にラテックスやガーゼなどの薄い障壁があることを確認してください。
   3. 青白い皮膚、四肢の動きの欠如、およびペダル反射の欠如の徴候を観察することによって十分な麻酔を識別する。
2. 開 胸
   1. 麻酔を維持するために-20 °Cで一晩青銅の操作のプラットホームを予冷する。
   2. 麻酔をかけ、アイスボックスからマウスを取り出し、青銅の操作プラットフォームに置きます。医療用粘着テープを使用して、作動プラットフォーム上のサイン位置にマウスを固定します。
   3. 操作プラットフォームをマウスでステレオスコープの下に置きます。
   4. ベタジンと70%アルコールを浸した準備パッドを使用して、または制度的な方針と一致してマウスの胸部を消毒する。
   5. 胸腔の第4肋間領域で1cmの切り傷を切り取り、心臓がアクセスされるまで微小手術ハサミを使用して肋間筋を分離して皮膚を切り開く。
   6. 心臓が機械的損傷を受けずに胸部から外装されるまで、2つの鉗子の助けを借りて胸と腹部を押してください。
   7. 小さな切開部の下と上の肋骨を、心臓を固定する自然な固定として設定します。
3. 心室の頂点切除
   1. 左心室の頂点を見つけます。ステレオスコープ下で虹十次はさみを使用して心室の頂点組織の直径1mmをカットします。
   2. 左心室が露出していることを確認し、にじみ出る。
   3. 綿棒を使用して心臓を胸腔に軽く押し付けます。
   4. 8-0を使用して筋肉、肋骨、および皮膚を縫合するプロレン縫合糸。
   5. 操作後、マウスを十分に清掃してください。
4. 手術後のケア
   1. 操作プラットフォームから37°Cの加熱毛布にマウスを移し、操作直後にボディを温めます。
   2. 自然呼吸の回復、肌の色の淡い色からピンクへの変化、手足の動きなど、マウスのアナビオシスを確認します。
   3. 回復したら、操作したマウスを母親に戻します。
   4. 必要に応じて、操作したマウスを母親のネスティング材料と混ぜ合わせたりします。
      注意:一度に母親からすべての1日の子犬を削除し、すべての子犬が回復した後、一度にそれらを返す必要があります。

2. 新生児心臓マクロファージ懸濁液の調製

注:これらすべての実験手順は、暗い場所で、無菌条件下で行われるべきです。

1. 新生児 Cx3cr1^GFP/+ マウスの心臓部を、頭蓋切除後1日収穫する
   1. Cx3cr1^GFP/+マウスは、補助的切除の翌日に安楽死させる。過剰な二酸化炭素を使用し、マウスを順次切断して安楽死を適用します。
   2. 胸から心臓を取り出し、PBSで10cmの皿に浸します。
   3. 血管と残りの結合組織を心室から切り離します。耳介の付録と流出管を心臓から切り取ります。
   4. 心臓が拍動を止めた後、心臓をマイクロサージシカルハサミを用いてPBSバッファー内の1〜2mm3個に切り込む(図2A)。
2. 新生児マウス心臓解離
   1. 収穫した心臓組織を、予熱酵素ミックス(材料表)の2.5mLを含むチューブに移し、チューブをしっかりと閉じます。
   2. チューブを反転し、キャップを下にして配置します(図2B)。
   3. 新生児心臓解離プログラム(材料表)を実行します。
   4. プログラムが完了したら、解離器からチューブを取り外します。
   5. 10%FBSの7.5 mLの1x DMEMをチューブに加えます。
   6. 懸濁液を15mL遠心管に移し、移す(図2C)。細胞懸濁液を300xgで5分間遠心分離する。
   7. 血液細胞溶解液1mLで細胞ペレットを再懸濁し、室温で2分間インキュベートする。
   8. 5~10mLのPBSバッファーを懸濁液に加え、遠心分離機を300xgで5分間加えます。
   9. 10%FBSでDMEMの1 mLで細胞ペレットを再懸濁します。
3. 新生児心臓マクロファージ分離
   1. FACSによってGFP⁺ 新生児心臓マクロファージを並べ替える。10%FBSのDMEMの500 μLを含む無菌の管で選別されたマクロファージを受け取る。
   2. GFP⁺ マクロファージをカウントします (図 2D)。DMEMのマクロファージを、DMEMの200 μLあたり1 x 10⁶ マクロファージの濃度で10%FBSで再中断し、後でインジェクションします。
      注:GFP⁺ マクロファージの数は、1つの新生児(およそ1 x 10⁵⁾で小さいです。したがって、少なくとも10の新生児は、各成人マウス注射のための十分なマクロファージを得るために使用されるべきである。

3. 新生児心臓マクロファージ移植

1. 左前冠動脈⁸の結紮により、成人(6-8週齢)の雄C57BL/6マウスに対して心筋梗塞手術を行う。
2. 操作したマウスを37°Cの加熱毛布の上に置いて、回復します。
3. 1 x 10⁶ GFP⁺ 新生児心臓マクロファージを用いて200μLDMEMを、手術後(約6時間後)尾静脈 を介して 梗塞した成体マウスに静脈内に注入する。
4. マウスをクリーンケージに戻します。

4. 結果評価

1. 射出効率の検証
   1. 手術マウスを麻酔し、心筋梗塞手術の7日後に心臓を収穫する。
   2. あらかじめ冷却されたPBSバッファーに心臓を浸します。
   3. 心臓組織を4%ポリホルムアルデヒドで室温で72時間揺れで固定します。
   4. ジメチルベンゼンおよびエタノールで心臓組織を脱水する。
   5. パラフィンに心臓組織を埋め込み、厚さ5μmのセクションにスライスします。
   6. 標準免疫蛍光染色プロトコル¹を実行する。心筋細胞をマークするにはα-アクチニンを使用してください。
   7. 移植を受けている心臓のGFP⁺ マクロファージを検出する。
   8. 標準免疫蛍光染色プロトコル¹を実行する。α-アクチニンとpH3を使用して、それぞれ心筋細胞および細胞増殖をマークする(図3A)。
2. 移植後の心臓修復評価
   1. 操作¹の1ヶ月後に操作されたマウスに心エコー検査を使用する。
   2. 左心室の駆出率と異なるグループの分数短縮を比較して心機能を解析する(図3B)。
   3. 操作されたマウスを麻酔し、心臓を収穫する。
   4. ステップ 4.1.2 から 4.1.5 を繰り返します。
   5. マッソンの染色プロトコルを実行します。
   6. マクロファージ注射後の梗塞領域を解析する(図3C)。

結果

ここで説明するプロトコルはフローチャートに要約されています (図 1)。1日前のCx3cr1^GFP/+マウスでアプリカル切除操作を行いました。図2Aに示すように、新生児Cx3cr1^GFP/+マウスは、麻酔後のステレオスコープ下の動作プラットフォームに固定された。私たちは、胸から飛び出す心臓を導く道として設定することができる2つの鉗子の助けを借りて、マウスの胸と腹部に交互に圧力をかけた。心臓の再生に影響を与える可能性のある心臓への余分な機械的損傷は避けるべきです。心臓は周囲の胸部組織によって固定化され、心筋の手術を容易にした。左心室室がにじみ出始めた場合、虹色はさみによって切除された頂点組織の直径1mm未満を切断することが適切であることがわかった。マクロファージ移植^8,9には、アプリカル切除モデルの誘導に成功する必要がある。

新生児心臓解離プロトコル¹に厳密に従ってGFP⁺マクロファージを選別した(図2)。

新生児心臓マクロファージは、隔離直後に心筋梗塞された成人マウス心臓に注射された。マクロファージ移植の効率を確認するため、注射後7日目に免疫蛍光染色を行った。その結果、成人心筋梗塞マウス心臓に^GFP+マクロファージが見つかり、新生児心臓マクロファージの移植に成功したことを示した。pH3のαアクチニンによる共免疫染色を採用した。共局在化は心筋細胞増殖であると考えられた。結果は、マクロファージ注入群において増殖性心筋細胞の数がアップレギュレートされたことを示し、移植後に成体心筋細胞増殖能力が増強されたことを示す(図3)。

成人マウス心臓再生は移植後1ヶ月後に評価した。我々は、成人マウスに心エコー検査を行い、マクロファージ注射が心筋梗塞後の心機能を高める可能性があることを発見した。マッソンの染色を行い、新生児心臓マクロファージ移植後に梗塞領域が著しく減少したことを示した結果を示した(図3)。これらの結果は、新生児心臓マクロファージ移植が成人マウスの心臓再生および心筋細胞増殖を促進することを実証した。

図1: 新生児心臓マクロファージ移植の模式図を示す。

図2:マクロファージの分離のイメージA)心は小さく切り取られます。 B)マウスの心臓の解離 C)懸濁液を濾過し、15 mL遠心管に移す。 D)新生児心臓マクロファージの数を計算する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:新生児心臓マクロファージ移植は、成人の心臓再生を促進する。A)(左)免疫蛍光画像は増殖性心筋細胞(矢印、pH3緑色、αアクチニン赤色)を示す。(右)統計解析は、マクロファージ移植後に心筋細胞増殖が増加することを示す。 B)(左)心エコー図画像は、心筋梗塞1ヶ月後の成人マウスにおける心機能を示す。(右)統計解析は、マクロファージ移植後に心機能が増強されることを示す。 C)マッソンの染色は、心筋梗塞の1ヶ月後に成体マウスの梗塞領域を示す。(右)統計解析は、Mφ、マクロファージ移植後に梗塞領域が減少することを示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、成人マウス心臓再生を促進するために新生児心臓マクロファージを調製、取得、移植するための効果的なアプローチを提供する。

心臓切除は、心臓再生を刺激する簡単で効果的な操作です。我々は、手術¹⁰に関与する動物の最大生存率を確保するために、尖体切除の詳細を最適化した。麻酔時間は3分より長く、低体温症による死亡につながるか、または手術中に過度の出血を引き起こす2分未満であるべきである。標準的な尖形切除術は、頂点組織の直径約1.5mmを切断することになっていた。しかし、ここでの操作の目的は、心臓再生過程における豊富なマクロファージ浸潤を刺激することであった。直径1.5mm未満の切除は、同時に最大生存率と効果的なマクロファージ募集を保証することができるため許容可能であった。オペレータの熟練だけが生存率に影響を与え、操作されたマウスは長時間の操作期間を生き残ることができなかった。オペレータは5分以内に全ての手続きを完了する必要があります。

私たちの以前の研究では、急性炎症が新生児心臓再生を促進することを発見しました。新生児マウス心臓への免疫原性ザイモサンA粒子の心筋内微小注射は、心筋細胞増殖を促進する^{可能性がある6。}最近、Molkentinらは、ザイモサンAの心臓内注射によって刺激されるマクロファージ浸潤、細胞の破片、および凍結/解凍死んだ細胞が心臓修復を促進することができると主張し、心筋細胞¹¹に分化する幹細胞ではなく心臓修復に急性炎症およびマクロファージが不可欠であることを確認した。Sadekら 5 は、マクロファージが血管新生による新生児の心臓再生を促進^{できると報告した}。我々の最近の研究は、新生児心臓マクロファージ注射が成人の心臓再生を促進し、成人心筋細胞増殖^の能力を高めることができることを明らかにした^1,7.新生児心臓マクロファージ移植は、成人マウス心臓再生を促進するための有望な戦略である可能性があります。ここでは、再生アプリケーション開発に関するより多くの研究者を支援し、心臓再生メカニズムの探求を支援するプロトコルを紹介します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse alpha actinin	Abcam	Ab9465
Anti-phospho-Histone H3	Millipore	06-570
Anti-rabbit Aurora B	Abcam	Ab239837
Anti-rabbit Ki67	Abcam	Ab15580
gentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany	N/A
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21137
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Neonatal Heart Dissociation Kit	Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany	130-098-373