Trapianto di macrofagi cardiaci di topo neonatale in topi adulti

Riepilogo

Forniamo un protocollo per la separazione e il trapianto di macrofagi cardiaci neonatali in un cuore di topo adulto, che potrebbe essere un modo promettente per promuovere la riparazione cardiaca.

Abstract

In un miocardio neonatale ferito, i macrofagi facilitano la proliferazione dei cardiomiociti e l'angiogenesi e promuovono la rigenerazione del cuore. Il presente studio rivela che il trapianto di macrofagi cardiaci neonatali reclutati da lesioni promuove la rigenerazione del cuore adulto dopo infarto miocardico con miglioramento della funzione cardiaca e della proliferazione cardiomiocitaria. I risultati indicano che il trapianto di macrofagi cardiaci neonatali potrebbe essere una strategia promettente per il trattamento delle lesioni cardiache. Qui, forniamo i dettagli tecnici, tra cui l'isolamento dei macrofagi cardiaci neonatali dai cuori di topo neonatale feriti da resezione apicale, il trapianto di macrofagi in topi adulti infartuati miocardici e la stima della rigenerazione cardiaca dopo un innesto di macrofagi.

Introduzione

La rigenerazione cardiaca è una strategia promettente per recuperare la funzione cardiaca dopo una lesione cardiaca e per proteggere dall'insufficienza cardiaca^1,2,3. A seguito di lesioni miocardiche, i macrofagi si infiltrano nel cuore ferito e sono stati esplorati come i fattori chiave durante la rigenerazione del cuore neonatale^4,5,6. Oltre a eliminare i detriti cellulari necrotici e indurre l'infiammazione, i macrofagi promuovono l'angiogenesi⁵ e la proliferazione dei cardiomiociti⁷ dopo l'infarto miocardico dei topi neonatali.

Il nostro studio precedente illustra che il trapianto di macrofagi cardiaci neonatali isolati dal cuore neonatale ferito migliora la rigenerazione del cuore adulto⁷, indicando che il trapianto di macrofagi cardiaci neonatali potrebbe essere una strategia promettente per trattare le lesioni cardiache. Qui forniamo i dettagli tecnici, tra cui l'isolamento dei macrofagi cardiaci neonatali dai cuori di topo neonatale feriti da resezione apicale, il trapianto di macrofagi in topi adulti infartuati miocardici e la stima della rigenerazione cardiaca dopo innesto di macrofagi (Figura 1).

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida per l'uso e la cura degli animali da laboratorio. Tutti i protocolli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), dal Fuwai Hospital, dall'Accademia cinese delle scienze mediche. La tecnica asettica è necessaria durante tutta la procedura per prevenire la contaminazione del sito chirurgico.

1. Operazione di resezione apicale in topo neonatale Cx3cr1 ^GFP/+ di 1 giorno (backgroundC57BL/6)

1. Anestesia
   1. Prendi tutti i cuccioli di topo dalle gabbie e mettili in una scatola asciutta e pulita.
   2. Incorporare ogni mouse nel ghiaccio per circa 2-3 minuti. Assicurarsi che ci sia una barriera sottile come il lattice o una garza tra il ghiaccio e il cucciolo di topo per prevenire il congelamento.
   3. Identifica un'anestesia sufficiente osservando i seguenti segni: pelle pallida, mancanza di movimento degli arti e mancanza di riflesso del pedale.
2. Thoracotomy
   1. Preraffreddare la piattaforma operativa in bronzo durante la notte a -20 °C per aiutare a mantenere l'anestesia.
   2. Prendi il mouse anestetizzato dalla ghiacciaia e mettilo su una piattaforma operativa in bronzo. Ancorare il mouse sulla piattaforma operativa in posizione supina utilizzando nastro adesivo medico.
   3. Metti la piattaforma operativa con il mouse su di essa sotto uno stereoscopio.
   4. Disinfettare il torace del topo utilizzando un pad di preparazione imbevuto di betadine e alcol al 70% o in linea con la politica istituzionale.
   5. Incidere la pelle con un taglio di 1 cm nella quarta area intercostale della cavità toracica e quindi separare i muscoli intercostali usando forbici microchirurgiche fino ad accedere al cuore.
   6. In alternativa, premere il torace e l'addome con l'aiuto di due pinza fino a quando il cuore non è esteriorizzato dal torace senza alcun danno meccanico.
   7. Impostare le costole sotto e sopra la piccola incisione come una fissazione naturale per immobilizzare il cuore.
3. Resezione dell'apice ventricolare
   1. Individuare l'apice del ventricolo sinistro. Tagliare un diametro di 1 mm di tessuto apicale ventricolare usando le forbici per iridectomia sotto uno stereoscopio.
   2. Confermare che la camera ventricolare sinistra sia esposta e iniziare a trasudare.
   3. Premere delicatamente il cuore nella cavità toracica usando un batuffolo di cotone.
   4. Suturare i muscoli, le costole e la pelle usando 8-0 Suture di prolene.
   5. Pulire accuratamente il mouse dopo l'operazione.
4. Assistenza post-operatoria
   1. Trasferire il mouse dalla piattaforma operativa a una coperta riscaldante a 37 °C per riscaldare il corpo immediatamente dopo l'operazione.
   2. Confermare l'anabiosi del topo osservando i seguenti segni: ripristino spontaneo della respirazione, cambiamento del colore della pelle da pallido a rosa e movimento degli arti.
   3. Riporta il mouse operato a sua madre una volta che si è ripreso.
   4. Mescolare il mouse operato con i materiali di nidificazione della madre, se necessario.
      NOTA: È importante rimuovere tutti i cuccioli di 1 giorno dalla madre contemporaneamente e quindi restituirli tutti in una volta dopo che tutti i cuccioli sono stati recuperati.

2. Preparazione della sospensione del macrofago cardiaco neonatale

NOTA: Tutte queste procedure sperimentali devono essere eseguite in un luogo buio e in condizioni sterili.

1. Raccogli il cuore di un topo neonatale Cx3cr1^GFP/+ 1 giorno dopo la resezione apicale
   1. Eutanasia del mouse Cx3cr1^GFP/+ un giorno dopo la resezione apicale. Utilizzare un eccesso di anidride carbonica e decapitare il topo in sequenza per applicare l'eutanasia.
   2. Togli il cuore dal petto e immergilo in un piatto da 10 cm con PBS.
   3. Tagliare i vasi e il tessuto connettivo rimanente lontano dai ventricoli. Tagliare l'appendice auricolare e il tratto di deflusso lontano dal cuore.
   4. Dopo che il cuore smette di battere, tagliare il cuore in 1-2 mm³ pezzi nel tampone PBS usando forbici microchirurgiche (Figura 2A).
2. Dissociazione cardiaca neonatale del topo
   1. Trasferire il tessuto cardiaco raccolto in un tubo contenente 2,5 ml di miscela enzimatica preriscaldata (Tabella dei materiali) e chiudere ermeticamente il tubo.
   2. Invertire il tubo e posizionarlo con il cappuccio verso il basso (Figura 2B).
   3. Eseguire il programma di dissociazione del cuore neonatale (Tabella dei materiali).
   4. Staccare il tubo dal dissociatore dopo che il programma è stato completato.
   5. Aggiungere 7,5 ml di 1x DMEM con il 10% fbS al tubo.
   6. Filtrare e trasferire la sospensione in un tubo centrifuga da 15 mL (Figura 2C). Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti.
   7. Risuspenare il pellet cellulare in 1 mL di soluzione di lisi delle cellule del sangue e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente.
   8. Aggiungere 5-10 ml di tampone PBS alla sospensione e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
   9. Rispendare il pellet cellulare in 1 mL di DMEM con il 10% di FBS.
3. Isolamento dei macrofagi cardiaci neonatali
   1. Ordina GFP⁺ macrofagi cardiaci neonatali di FACS. Ricevi i macrofagi ordinati in un tubo sterile contenente 500 μL di DMEM con il 10% di FBS.
   2. Contare i macrofagi GFP⁺ (Figura 2D). Sospendare il macrofago in DMEM con 10% FBS alla concentrazione di 1 x 10⁶ macrofagi per 200 μL di DMEM per successiva iniezione.
      NOTA: Il numero di macrofagi GFP⁺ è piccolo in un neonato (circa 1 x 10⁵); pertanto, almeno 10 neonati devono essere utilizzati per ottenere un numero sufficiente di macrofagi per ogni iniezione di topo adulto.

3. Trapianto di macrofagi cardiaci neonatali

1. Eseguire un'operazione di infarto miocardico su un topo C57BL/6 maschio adulto (6-8 settimane) maschio legando l'arteria coronaria anteriore sinistra⁸.
2. Mettere il mouse operato su una coperta riscaldata a 37 °C fino a quando non si riprende.
3. Iniettare per via endovenosa 200 μL di DMEM con 1 x 10⁶ GFP⁺ macrofagi cardiaci neonatali nel topo adulto infartato dopo l'operazione (circa 6 ore dopo) attraverso la vena della coda.
4. Rimanda il mouse in una gabbia pulita.

4. Valutazione dei risultati

1. Convalida dell'efficienza di iniezione
   1. Anestetizzare il topo operato e raccogliere il cuore 7 giorni dopo l'operazione di infarto miocardico.
   2. Immergere il cuore nel buffer PBS pre-raffreddato.
   3. Fissare il tessuto cardiaco con il 4% di poliformaldeide per 72 ore a temperatura ambiente con agitazione.
   4. Disidratare il tessuto cardiaco in dimetilbenzene ed etanolo.
   5. Incorporare il tessuto cardiaco nella paraffina e tagliarlo in sezioni con uno spessore di 5 μm.
   6. Eseguire il protocollo standard di colorazione dell'immunofluorescenza¹. Utilizzare α-actinina per marcare i cardiomiociti.
   7. Rileva i macrofagi GFP⁺ nel cuore che riceve il trapianto.
   8. Eseguire il protocollo standard di colorazione dell'immunofluorescenza¹. Utilizzare α-actinina e pH3 per marcare rispettivamente i cardiomiociti e la proliferazione cellulare (Figura 3A).
2. Valutazione della riparazione cardiaca dopo il trapianto
   1. Utilizzare l'ecocardiografia sul mouse operato un mese dopo^{l'operazione 1}.
   2. Analizzare la funzione cardiaca confrontando la frazione di eiezione ventricolare sinistra e l'accorciamento frazionario in diversi gruppi (Figura 3B).
   3. Anestetizzare il topo operato e raccogliere il cuore.
   4. Ripetere i passaggi 4.1.2-4.1.5.
   5. Eseguire un protocollo di colorazione di Masson.
   6. Analizzare l'area infartata dopo l'iniezione di macrofagi (Figura 3C).

Risultati

Il protocollo qui descritto è riassunto in un diagramma di flusso (Figura 1). Abbiamo eseguito un'operazione di resezione apicale su un mouse Cx3cr1^GFP/+ di 1 giorno. Come mostrato nella Figura 2A,il mouse neonatale Cx3cr1^GFP/+ è stato ancorato sulla piattaforma operativa sotto lo stereoscopio dopo l'anestesia. Abbiamo applicato una pressione alternativa sul torace e sull'addome del topo con l'aiuto di due pinci, che possono essere impostati come un tratto per guidare il cuore che spunta fuori dal torace. Qualsiasi danno meccanico extra al cuore che può influenzare la rigenerazione del cuore dovrebbe essere evitato. Il cuore è stato immobilizzato dai tessuti toracici circostanti, che hanno facilitato l'operazione sul miocardio. Abbiamo scoperto che tagliare meno di un diametro di 1 mm del tessuto apice resecato con le forbici per iridectomia era appropriato quando la camera ventricolare sinistra ha iniziato a trasudare. L'induzione riuscita del modello di resezione apicale è necessaria per il trapianto di macrofagi^8,9.

Abbiamo ordinato i macrofagi GFP⁺ seguendo rigorosamente un protocollo di dissociazione cardiaca neonatale¹ (Figura 2).

I macrofagi cardiaci neonatali sono stati iniettati nel cuore miocardico di topo adulto infartuato poco dopo l'isolamento. Al fine di confermare l'efficacia del trapianto di macrofagi, abbiamo eseguito la colorazione di immunofluorescenza a 7 giorni dopo l'iniezione. I risultati hanno mostrato che i macrofagi GFP⁺ potrebbero essere trovati nel cuore di topo infartuato del miocardio adulto, indicando il successo del trapianto di macrofagi cardiaci neonatali. Abbiamo impiegato la co-immunoimtainingazione del pH3 con α-actinina. La co-localizzazione è stata considerata come proliferazione dei cardiomiociti. I risultati hanno mostrato che il numero di cardiomiociti proliferativi era sovraregolato nel gruppo iniettato con macrofagi, indicando che la capacità di proliferazione dei cardiomiociti adulti era migliorata dopo il trapianto (Figura 3).

La rigenerazione del cuore del topo adulto è stata valutata 1 mese dopo il trapianto. Abbiamo eseguito l'ecocardiogramma sul topo adulto e abbiamo scoperto che l'iniezione di macrofagi potrebbe migliorare la funzione cardiaca dopo infarto miocardico. La colorazione di Masson è stata eseguita e i risultati hanno illustrato che l'area infarto è stata notevolmente ridotta dopo il trapianto di macrofagi cardiaci neonatali (Figura 3). Tutti questi risultati hanno dimostrato che il trapianto di macrofagi cardiaci neonatali promuove la rigenerazione del cuore del topo adulto e la proliferazione dei cardiomiociti.

Figura 1: Rappresentazione schematica del trapianto di macrofagi cardiaci neonatali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini di isolamento dei macrofagi. R)I cuori sono tagliati a pezzetti. B)I cuori dei topi sono dissociati. C)La sospensione viene filtrata e trasferita in un tubo centrifugo da 15 ml. D)Viene calcolato il numero di macrofagi cardiaci neonatali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Il trapianto di macrofagi cardiaci neonatali promuove la rigenerazione del cuore adulto. A)(a sinistra) Le immagini di immunofluorescenza mostrano i cardiomiociti proliferativi (freccia, pH3 verde, rosso α-attinina). (Destra) L'analisi statistica mostra che la proliferazione dei cardiomiociti aumenta dopo il trapianto di macrofagi. B)(a sinistra) Le immagini dell'ecocardiogramma mostrano la funzione cardiaca nel topo adulto 1 mese dopo l'infarto del miocardio. (Destra) L'analisi statistica mostra che la funzione cardiaca è migliorata dopo il trapianto di macrofagi. C)La colorazione di Masson mostra l'area infartuale nel topo adulto 1 mese dopo l'infarto miocardico. (Destra) L'analisi statistica mostra che l'area infarto è ridotta dopo Mφ, trapianto di macrofagi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Qui, forniamo un approccio efficace per preparare, acquisire e trapiantare macrofagi cardiaci neonatali per promuovere la rigenerazione del cuore del topo adulto.

La resezione apicale è un'operazione semplice ed efficace per stimolare la rigenerazione del cuore. Abbiamo ottimizzato i dettagli della resezione apicale per garantire il massimo tasso di sopravvivenza degli animali coinvolti^{nell'operazione 10.} Il tempo di anestesia non deve essere superiore a 3 minuti, che porta alla morte indotta da ipotermia, o inferiore a 2 minuti, che causerebbe un eccessivo sanguinamento durante l'operazione. La resezione apicale standard avrebbe dovuto amputare circa 1,5 mm di diametro del tessuto apicale. Tuttavia, lo scopo dell'operazione qui era quello di stimolare un'abbondante infiltrazione di macrofagi durante il processo di rigenerazione del cuore. La resezione di diametro inferiore a 1,5 mm era accettabile in quanto poteva garantire un tasso massimo di sopravvivenza e un efficace reclutamento di macrofagi allo stesso tempo. Solo l'abilità dell'operatore ha influenzato il tasso di sopravvivenza e i topi operati non sono riusciti a sopravvivere alla prolungata durata dell'operazione. L'operatore deve completare l'intera procedura entro 5 minuti.

Nel nostro precedente studio, abbiamo scoperto che l'infiammazione acuta promuoveva la rigenerazione del cuore neonatale. La microiniezione intramiocardica di particelle immunogeniche di zimosan A nel cuore del topo neonatale potrebbe promuovere la proliferazione dei cardiomiociti⁶. Recentemente, Molkentin et al. hanno affermato che l'infiltrazione dei macrofagi stimolata dall'iniezione intracardiaca di zymosan A, detriti cellulari e cellule uccise da congelamento / scongelamento può promuovere la riparazione cardiaca, confermando che l'infiammazione acuta e i macrofagi sono essenziali nella riparazione cardiaca piuttosto che le cellule staminali che si differenziano in cardiomiociti¹¹. Sadek et al.⁵ hanno riferito che i macrofagi potrebbero promuovere la rigenerazione del cuore neonatale attraverso l'angiogenesi. Il nostro recente studio ha rivelato che l'iniezione di macrofagi cardiaci neonatali potrebbe promuovere la rigenerazione del cuore adulto e aumentare la capacità di proliferazione dei cardiomiociti adulti^1,7. Il trapianto di macrofagi cardiaci neonatali potrebbe essere una strategia promettente per promuovere la rigenerazione del cuore del topo adulto. Qui presentiamo i protocolli per aiutare più ricercatori nello sviluppo di applicazioni rigenerative ed esplorare i meccanismi di rigenerazione del cuore.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse alpha actinin	Abcam	Ab9465
Anti-phospho-Histone H3	Millipore	06-570
Anti-rabbit Aurora B	Abcam	Ab239837
Anti-rabbit Ki67	Abcam	Ab15580
gentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany	N/A
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21137
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Neonatal Heart Dissociation Kit	Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany	130-098-373