Transplante de Macrófagos Cardíacos de Camundongos Neonatais em Camundongos Adultos

Resumo

Fornecemos um protocolo para separação e transplante de macrófago cardíaco neonatal em um coração de rato adulto, o que pode ser uma maneira promissora de promover a reparação cardíaca.

Resumo

Em um miocárdio neonatal ferido, macrófagos facilitam a proliferação de cardiomiócitos e angiogênese e promovem a regeneração cardíaca. O presente estudo revela que o transplante de macrófagos cardíacos neonatais recrutados por lesão promove a regeneração cardíaca adulta após o infarto do miocárdio com melhora da função cardíaca e proliferação de cardiomiócitos. Os resultados indicam que o transplante de macrófago cardíaco neonatal pode ser uma estratégia promissora para o tratamento de lesões cardíacas. Aqui, fornecemos os detalhes técnicos, incluindo o isolamento de macrófagos cardíacos neonatais de corações de camundongos neonatais com ressecção apical, o transplante de macrófagos em camundongos adultos infartos do miocárdio e a estimativa de regeneração cardíaca após um enxerto de macrófago.

Introdução

A regeneração cardíaca é uma estratégia promissora para recuperar a função cardíaca após lesão cardíaca e proteger contra insuficiência cardíaca^1,2,3. Após a lesão do miocárdio, os macrófagos se infiltram no coração ferido e têm sido explorados como os principais fatores durante a regeneração cardíaca neonatal^4,5,6. Além de limpar detritos celulares necrosos e induzir inflamação, os macrófagos promovem angiogênese⁵ e a proliferação de cardiomiócitos⁷ após infarto do miocárdio de camundongos neonatais.

Nosso estudo anterior ilustra que o transplante de macrófagos cardíacos neonatais isolados do coração neonatal ferido aumenta a regeneração cardíaca adulta^7,indicando que o transplante de macrófago cardíaco neonatal pode ser uma estratégia promissora para tratar lesões cardíacas. Aqui fornecemos os detalhes técnicos, incluindo o isolamento de macrófagos cardíacos neonatais de corações de camundongos neonatais feridos por ressecção apical, o transplante de macrófagos em camundongos adultos infartados do miocárdio e a estimativa de regeneração cardíaca após enxerto de macrófago(Figura 1).

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guia de Uso e Cuidado de Animais de Laboratório. Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), Hospital Fuwai, Academia Chinesa de Ciências Médicas. A técnica asséptica é necessária durante todo o procedimento para evitar a contaminação do local cirúrgico.

1. Operação de ressecção apical no mouse Cx3cr1 ^GFP/+ neonatal de 1 dia de idade(C57BL/6 de fundo)

1. Anestesia
   1. Tire todos os filhotes de rato das gaiolas e coloque-os em uma caixa seca limpa.
   2. Incorpore cada rato no gelo por cerca de 2-3 minutos. Certifique-se de que há uma barreira fina, como látex ou gaze entre o gelo e o filhote de rato para evitar queimaduras de gelo.
   3. Identifique anestesia suficiente observando os seguintes sinais: pele pálida, falta de movimento dos membros e falta de reflexo do pedal.
2. Toracotomia
   1. Pré-prepare a plataforma operacional bronze durante a noite a -20 °C para ajudar a manter a anestesia.
   2. Tire o rato anestesiado da caixa de gelo e coloque-o em uma plataforma operacional de bronze. Ancore o mouse na plataforma de operação em uma posição supina usando fita adesiva médica.
   3. Coloque a plataforma operacional com o mouse nele sob um estereoscópio.
   4. Desinfete o baú do rato usando uma almofada de preparação encharcada com betadina e 70% de álcool ou conforme consistente com a política institucional.
   5. Incisar a pele com um corte de 1 cm na quarta área intercostal da cavidade torácica e, em seguida, separar os músculos intercostais usando tesoura microcirúrgica até que o coração seja acessado.
   6. Pressione alternadamente o peito e o abdômen com a ajuda de dois fórceps até que o coração seja exteriorizado para fora do peito sem qualquer dano mecânico.
   7. Coloque as costelas abaixo e acima da pequena incisão como uma fixação natural para imobilizar o coração.
3. Ressecção do ápice ventricular
   1. Localize o ápice do ventrículo esquerdo. Corte um diâmetro de 1 mm de tecido ápice ventricular usando uma tesoura de iridectomia sob um estereoscópio.
   2. Confirme se a câmara ventricular esquerda está exposta, e comece a escorrer.
   3. Pressione suavemente o coração de volta para a cavidade torácica usando um cotonete.
   4. Sutura os músculos, costelas e pele usando 8-0 Suturas de prolene.
   5. Limpe bem o mouse após a operação.
4. Cuidados pós-operação
   1. Transfira o mouse da plataforma de operação para uma manta de aquecimento de 37 °C para aquecer o corpo imediatamente após a operação.
   2. Confirme a anabiose do camundongo observando os seguintes sinais: restauração espontânea da respiração, mudança de cor da pele de pálida para rosa e movimento dos membros.
   3. Leve o rato operado de volta para sua mãe assim que ele se recuperar.
   4. Misture o rato operado com os materiais de aninhamento de sua mãe, se necessário.
      NOTA: É importante remover todos os filhotes de 1 dia de idade da mãe de uma vez e depois devolvê-los todos de uma vez depois que todos os filhotes são recuperados.

2. Preparação da suspensão do macrófago cardíaco neonatal

NOTA: Todos esses procedimentos experimentais devem ser realizados em local escuro e em condições estéreis.

1. Colher o coração de um rato Cx3cr1^GFP/+ neonatal 1 dia após a ressecção apical
   1. Eutanize o mouse Cx3cr1^GFP/+ um dia após a ressecção apical. Use um excesso de dióxido de carbono e decapite o rato sequencialmente para aplicar eutanásia.
   2. Tire o coração do peito e mergulhe-o em um prato de 10 cm com PBS.
   3. Corte os vasos e o tecido conjuntivo restante longe dos ventrículos. Corte o apêndice auricular e o trato de saída do coração.
   4. Depois que o coração parar de bater, corte o coração em 1-2 mm³ pedaços em tampão PBS usando tesoura microcirúrgica(Figura 2A).
2. Dissociação cardíaca do camundongo neonatal
   1. Transfira o tecido cardíaco colhido para um tubo contendo 2,5 mL de mistura de enzimas pré-aque(Tabela de Materiais),e feche firmemente o tubo.
   2. Inverta o tubo e coloque-o com a tampa para baixo(Figura 2B).
   3. Executar o programa de dissociação cardíaca neonatal (Tabela de Materiais).
   4. Retire o tubo do dissociador após a conclusão do programa.
   5. Adicione 7,5 mL de 1x DMEM com 10% de FBS ao tubo.
   6. Filtre e transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mL(Figura 2C). Centrifugar a suspensão da célula a 300 x g por 5 minutos.
   7. Resuspende a pelota celular em 1 mL de solução de lise de células sanguíneas e incubar por 2 minutos em temperatura ambiente.
   8. Adicione 5-10 mL de tampão PBS à suspensão e centrífuga a 300 x g por 5 minutos.
   9. Resuspense a pelota celular em 1 mL de DMEM com 10% de FBS.
3. Isolamento do macrófago cardíaco neonatal
   1. Classificar GFP⁺ macrófagos cardíacos neonatais por FACS. Receba os macrófagos classificados em um tubo estéril contendo 500 μL de DMEM com 10% de FBS.
   2. Conte o GFP⁺ macrófagos (Figura 2D). Resuspend o macrófago em DMEM com 10% de FBS na concentração de 1 x 10⁶ macrófagos por 200 μL de DMEM para injeção posterior.
      NOTA: O número de macrófagos GFP⁺ é pequeno em um recém-nascido (aproximadamente 1 x 10⁵); portanto, pelo menos 10 recém-nascidos devem ser usados para obter macrófagos suficientes para cada injeção de rato adulto.

3. Transplante de macrófago cardíaco neonatal

1. Realize uma operação de infarto do miocárdio em um camundongo C57BL/6 masculino adulto (6-8 semanas) por ligadura da artéria coronária anterior esquerda⁸.
2. Coloque o mouse operado em uma manta aquecida de 37 °C até que ele se recupere.
3. Injete por via intravenosa 200 μL de DMEM com 1 x 10⁶ GFP⁺ macrófagos cardíacos neonatais no camundongo adulto infartado após a operação (aproximadamente 6 horas depois) através da veia traseira.
4. Mande o rato de volta para uma gaiola limpa.

4. Avaliação do resultado

1. Validação de eficiência de injeção
   1. Anestesiar o rato operado e colher o coração 7 dias após a operação de infarto do miocárdio.
   2. Mergulhe o coração no buffer PBS pré-resfriado.
   3. Fixar o tecido cardíaco com 4% de poliformaldeído por 72 horas em temperatura ambiente com agitação.
   4. Desidratar o tecido cardíaco em dimetilbenzeno e etanol.
   5. Incorpore o tecido cardíaco em parafina e corte-o em seções com uma espessura de 5 μm.
   6. Realize o protocolo padrão de coloração de imunofluorescência¹. Use α-actinina para marcar cardiomiócitos.
   7. Detecte os macrófagos GFP⁺ no coração que recebem transplante.
   8. Realize o protocolo padrão de coloração de imunofluorescência¹. Use α-actinina e pH3 para marcar cardiomiócitos e proliferação celular, respectivamente (Figura 3A).
2. Avaliação de reparação cardíaca após o transplante
   1. Use ecocardiografia no mouse operado um mês após a operação¹.
   2. Analise a função cardíaca comparando a fração de ejeção ventricular esquerda e o encurtamento fracionado em diferentes grupos(Figura 3B).
   3. Anestesiar o rato operado e colher o coração.
   4. Repetição passos 4.1.2-4.1.5.
   5. Faça o protocolo de coloração do Masson.
   6. Analise a área infarto após a injeção de macrófago(Figura 3C).

Resultados

O protocolo descrito aqui é resumido em um fluxograma(Figura 1). Realizamos a operação de ressecção apical no mouse Cx3cr1^GFP/+ de 1 dia de idade. Como mostrado na Figura 2A,o mouse neonatal Cx3cr1^GFP/+ foi ancorado na plataforma operacional sob o estereoscópio após anestesia. Aplicamos pressão alternadamente no peito e abdômen do rato com a ajuda de dois fórceps, que podem ser configurados como um trato para guiar o coração saindo do peito. Qualquer dano mecânico extra no coração que possa afetar a regeneração cardíaca deve ser evitado. O coração foi imobilizado pelos tecidos torácicas circundantes, o que facilitou o funcionamento do miocárdio. Descobrimos que cortar menos de 1 mm de diâmetro do tecido ápice ressecado por tesoura de iridectomia era apropriado quando a câmara ventricular esquerda começou a escorrer. A indução bem sucedida do modelo de ressecção apical é necessária para o transplante de macrófago^8,9.

Separamos os macrófagos GFP⁺ seguindo rigorosamente um protocolo de dissociação cardíaca neonatal¹ (Figura 2).

Macrófagos cardíacos neonatais foram injetados no coração do camundongo adulto infartado logo após o isolamento. Para confirmar a eficiência do transplante de macrófago, realizamos a coloração de imunofluorescência aos 7 dias após a injeção. Os resultados mostraram que o GFP⁺ macrófagos poderia ser encontrado no coração de camundongo infartado do miocárdio adulto, indicando o transplante bem sucedido de macrófago cardíaco neonatal. Nós empregamos co-imunostaining de pH3 com α-actinin. A co-localização foi considerada como proliferação de cardiomiócitos. Os resultados ilustraram que o número de cardiomiócitos proliferativos foi regulado no grupo injetado pelo macrófago, indicando que a capacidade de proliferação de cardiomiócitos adultos foi aumentada após o transplante (Figura 3).

A regeneração cardíaca do camundongo adulto foi avaliada um mês após o transplante. Realizamos ecocardiograma no camundongo adulto e descobrimos que a injeção de macrófago poderia melhorar a função cardíaca após o infarto do miocárdio. A coloração de Masson foi realizada, e os resultados ilustraram que a área infarta foi notavelmente reduzida após o transplante de macrófago cardíaco neonatal(Figura 3). Todos esses resultados demonstraram que o transplante de macrófago cardíaco neonatal promove a regeneração cardíaca do camundongo adulto e a proliferação de cardiomiócitos.

Figura 1: Representação esquemática do transplante de macrófago cardíaco neonatal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens de isolamento do macrófago. A) Os corações são cortados em pequenos pedaços. B) Os corações do rato são dissociados. C) A suspensão é filtrada e transferida para um tubo de centrífuga de 15 mL. D) Calcula-se o número de macrófagos cardíacos neonatais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: O transplante de macrófago cardíaco neonatal promove a regeneração cardíaca adulta. A) (Esquerda) Imagens de imunofluorescência mostram os cardiomiócitos proliferativos (seta, pH3 verde, α-actinina vermelha). (À direita) A análise estatística mostra que a proliferação de cardiomiócitos aumenta após o transplante de macrófago. B) (Esquerda) Imagens de ecocardiograma mostram a função cardíaca no camundongo adulto 1 mês após o infarto do miocárdio. (À direita) A análise estatística mostra que a função cardíaca é aprimorada após o transplante de macrófago. C) A coloração de Masson mostra a área infarto em camundongo adulto 1 mês após o infarto do miocárdio. (À direita) A análise estatística mostra que a área infarta é reduzida após mφ, transplante de macrófago. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui, fornecemos uma abordagem eficaz para preparar, adquirir e transplantar macrófagos cardíacos neonatais para promover a regeneração cardíaca do camundongo adulto.

A ressecção apical é uma operação simples e eficaz para estimular a regeneração cardíaca. Otimizamos os detalhes da ressecção apical para garantir a máxima taxa de sobrevivência dos animais envolvidos na operação¹⁰. O tempo de anestesia não deve ser superior a 3 minutos, o que leva à morte induzida por hipotermia, ou menor que 2 minutos, o que causaria sangramento excessivo durante a operação. A ressecção apical padrão deveria amputar cerca de 1,5 mm de diâmetro do tecido ápice. No entanto, o objetivo da operação aqui foi estimular a infiltração abundante de macrófagos durante o processo de regeneração cardíaca. A ressecção de menos de 1,5 mm de diâmetro foi aceitável, pois poderia garantir uma taxa máxima de sobrevivência e recrutamento eficaz de macrófagos ao mesmo tempo. Apenas a habilidade do operador influenciou a taxa de sobrevivência, e os ratos operados não sobreviveram à duração prolongada da operação. O operador deve completar todo o procedimento dentro de 5 minutos.

Em nosso estudo anterior, descobrimos que a inflamação aguda promoveu a regeneração cardíaca neonatal. Microinjeção intramiocárdia de zimosã imunogênica Uma partículas no coração de camundongo neonatal poderia promover a proliferação de cardiomiócitos⁶. Recentemente, Molkentin et al. afirmaram que a infiltração de macrófagos estimulado pela injeção intracardiac de zimosão A, detritos celulares e células mortas congelantes/descongelamentos podem promover o reparo cardíaco, confirmando que inflamação aguda e macrófagos são essenciais no reparo cardíaco em vez de células-tronco diferenciadas em cardiomiócitos¹¹. Sadek et al.⁵ relataram que macrófagos poderiam promover a regeneração cardíaca neonatal através da angiogênese. Nosso estudo recente revelou que a injeção de macrófago cardíaco neonatal poderia promover a regeneração cardíaca adulta e aumentar a capacidade de proliferação de cardiomiócitos^{adultos 1,7}. O transplante de macrófago cardíaco neonatal pode ser uma estratégia promissora para promover a regeneração cardíaca do camundongo adulto. Aqui apresentamos os protocolos para ajudar mais pesquisadores no desenvolvimento de aplicações regenerativas e explorar mecanismos de regeneração cardíaca.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse alpha actinin	Abcam	Ab9465
Anti-phospho-Histone H3	Millipore	06-570
Anti-rabbit Aurora B	Abcam	Ab239837
Anti-rabbit Ki67	Abcam	Ab15580
gentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany	N/A
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21137
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Neonatal Heart Dissociation Kit	Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany	130-098-373