一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

要約

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウスRPE細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。手続きには約3時間かかります。

要約

眼疾患は世界中の何百万人もの人々に影響を与えますが、人間の組織の利用可能性が限られていると研究が妨げられています。マウスモデルは、人体解剖学や生理学と類似しているため、眼疾患の病態生理を理解するための強力なツールです。網膜色素上皮(RPE)の変化は、形態および機能の変化を含め、多くの眼疾患によって共有される共通の特徴である。しかし、プライマリマウスRPE細胞の分離と培養は非常に困難です。この論文は、フェルナンデス・ゴディーノら2016年に発表されたプロトコルの更新された視聴覚バージョンであり、プライマリマウスRPE細胞を効率的に単離して培養する。この方法は非常に再現性が高く、トランスウェルズで数週間維持できる高度に偏光性および色素性の高いRPE単層の堅牢な培養を生じる。このモデルは、眼疾患の根底にある分子および細胞メカニズムの研究のための新しい道を開く。さらに、遺伝性の疾患や黄斑の過大代を含む、満たされていない医療ニーズを持つ重要な眼疾患を治療するために使用できる治療アプローチをテストするためのプラットフォームを提供します。

概要

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウス網膜色素上皮(RPE)細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。RPEは、神経性のレティナとブルッフの膜の間の目に位置する単層である。この単層は、高偏光性および色素上皮細胞で構成され、密接する接合によって結合され、ハニカム²に似た六角形の形状を呈する。この明らかな組織学的な単純さにもかかわらず、RPEは、レチナおよび正常な視覚サイクル^2、3、4に不可欠な多種多様な機能を実行する。RPE単層の主な機能は、光吸収、感光体の栄養および再生、代謝末端産物の除去、経皮下腔内のイオン恒常性の制御および血液-筋バリア^2、3の維持を含む。RPEはまた、眼^{5、6、7、8、9、10、11}の免疫系の局所的な調節において重要な役割^を果^{たしている}。RPEの変性および/または機能不全は、網膜色素変性症、レーバー先天性アマウロシス、アルビニズム、糖尿病性網膜症、および黄斑変性^症12、13、14、15のような多くの眼疾患によって共有される共通の特徴である。残念ながら、人間の組織の入手可能性は限られています。人間との高度に保存された遺伝的相同性を考えると、マウスモデルは、眼疾患^{16、17、18、19}を研究するための適切で有用なツールを表す。さらに、培養された一次RPE細胞の使用は、これらの視力を脅かす障害^9,11に対する新たな治療法の開発を加速することができる遺伝子操作および薬物検査などの利点を提供する。

マウスのRPEの分離と培養に利用可能な既存の方法は再現性に欠け、十分な信頼性を持つ生体内のRPE機能を再現しません。細胞は、培養^13,20において数日内に色素沈着、六角形および後上皮電気抵抗(TER)を失う傾向がある。マウスからこれらの主要なRPE細胞培養を確立することは困難なプロセスであるため、この最適化されたプロトコルは、ラットおよびヒトの目^21、22、23からRPE細胞を分離してマウスの目を解剖し、インビトロでマウスRPE細胞を培養する他のプロトコルに基づいて作成された。

プロトコル

眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明のガイドラインに従った。

注:この方法は、C57BL / 6J、B10を含む異なる遺伝的背景のマウスで成功することが証明されています。D2-Hc^o H2^d H2-T18^c/oSnJ,およびアルビノマウスは、様々な年齢で。好ましくは、RPE細胞を得るために8〜12週齢のマウスを使用する。古いマウスのRPE細胞は培養中に増殖が少なく、若いマウスは細胞が少なく、細胞が少なく、生存可能な培養物を持つために異なる動物から目をプールする必要があります。

試薬の調製と膜挿入物

1. 以下の試薬を準備します。
   1. HBSS-H−(カルシウムなしHBSS、マグネシウムバッファーなし+10 mM HEPES):HBSS-(Ca/Mgなし)バッファの99 mLに1 M HEPESの1 mLを追加します。4°Cで1ヶ月まで保管してください。
   2. HBSS-H+(カルシウム付きHBSS、マグネシウムバッファー+ 10 mM HEPES)を準備する:HBSS+(Ca/ Mg付き)バッファの99 mLに1 M HEPESの1 mLを追加します。4°Cで1ヶ月まで保管してください。
   3. ヒアルロニダーゼ溶液(1mg/mL):10mgのヒアルロニダーゼをHBSS-H−の10 mLに加え、10 mLシリンジを使用して0.4 μmの滅菌シリンジフィルターでフィルターします。使用前に新鮮な準備をし、室温(RT;20-25°C)にしておきます。
   4. FBSソリューションを準備する:HBSS-H+と20%FBSをミックス。HBSS-H+の8 mLにFBSの2 mLを加えます。使用前に新鮮な準備をしてください。
   5. RPE培地を準備する:N1培地サプリメント1/100(v/v)、グルタミン1/100(v/v)、ペニシリンストレプトマイシン1/100(v/v)および非必須アミノ酸溶液1/100(v/ v)、ヒドロコルチゾン(20μg/L)、タウリン(250mg/L)およびトリヨード-チロニン(0.013 μg/L)をアルファMEM+ 5%FBSまたはFBS^1、23、24なしにする。必要に応じて、FBS は熱不活化する可能性があります。違いは認められてない。RPE分離のために新鮮な準備をします。細胞培養のメンテナンスのため、4°Cで1ヶ月まで保管してください。
   6. トリプシン-EDTAを準備する:新鮮なトリプシンEDTA(0.25%)の小さな単独使用アリコート(約8 mL)を準備するそして-20 oCでそれらを凍結する。各使用前にRTでそれらを解凍します。フリーズ解凍サイクルを避けてください。
2. 膜挿入物(例えば、トランスウェル挿入物)を準備します。
   1. 6.5mm膜インサートを37°Cで30分間_、5%CO2-気泡インキュベーターで30分間、RPE培地と平衡化します。1つの膜挿入物を使用して、2つのマウスの目からRPE細胞をシードします。
   2. インキュベーション後、下部コンパートメントの培地を700 μLのPBSに交換します。
   3. 上部コンパートメントから培地を取り出し、100 μLのマウスラミニン(PBS)を100 μLの100 μLのRTで少なくとも2時間コーティングします(インキュベーションが短いほど、細胞のインサートへの取り付けが不十分になる可能性があります)。
   4. TER測定用のブランクとして使用する余分な膜挿入物をコーティングします。

2. マウスの目の解剖と核形成

1. マウスを_CO2チャンバーに入れ、1分間に30~70%の充填率でゆっくりと_CO2を放出することにより_、CO2窒息によりマウスを安楽死させます。
2. マウスの目の両側にマイクロ鉗子の角度付きの鋸歯状の先端を置き、眼球をプロプロトーゼ(核)に軽く押します。
3. 眼球の周りに配置された鉗子を閉じます。次に、前方と後方に移動しながら穏やかに引っ張って眼筋から視神経で目全体を切り離し、結合組織が瘢包に付着したままにならないようにします。
4. 70%エタノールで核眼球をリンスしてから、氷の上に3 mLのHBSS-H-Lを持つ6ウェルプレートの1ウェルに入れます。
5. マウスの 2 番目の目を削除するには、手順 2.2 ~ 2.4 を繰り返します。30分以内に次のステップに進みます。
   注:経験が得られるまで、一度に2つの目だけを核/解剖することをお勧めします。

3. RPEの収集

注:層流フードの無菌条件下で以下の手順を実行します。RPE細胞死を引き起こす可能性のある氷上の拡張インキュベーションを避けるために、一度に2つ以上の目を集めないでください。

1. 解剖した実体顕微鏡、デュモン#5鉗子、斜めのはさみを使用して、強眼球に切断することなく、眼球に取り付けられたすべての結合組織、血液および筋肉を慎重にきれいにします。HBSS-H-バッファの 3 mL を必要に応じて定期的に変更して、目を新鮮で清潔に保ち、RPE 培養物の汚染を避けてください。
2. 眼球を保持し、鋭い炭素鋼の#11刃で角膜の中央に穴を開けるハンドルとして視神経を使用してください。
3. デュモン#5はさみを使用して、前述の穴を通して角膜に3回の切開を行い、レンズを取り外す十分なスペースがあることを確認します。
4. 視神経を保持し、レンズが完全に出てくるまで斜めのはさみのベースで、オラ・コナラにわずかな圧力を加えます。インキュベーション中に神経網膜とRPEの剥離を防ぐために、虹彩上皮を所定の位置に残します。目をHBSS-Hバッファに入れます。
5. ステップ 3.1 ~ 3.4 を繰り返して、2 番目の目を解剖します。
6. 37°Cの12ウェルプレートにヒアルロニダーゼ溶液にレンズを入れずに目をインキュベートし、5%CO2-気泡インキュベーター(1.5 mL/well)で45分間、RPEから神経網膜を取り外します。
7. 各目を新しい井戸に入れ、氷の上で30分間、1.5 mLの冷たいHBSS-H+バッファーをウェルあたりでインキュベートし、ヒアルロニダーゼ活性を止めます。インキュベーションを45分以上延長しないでください。
8. 洗浄し、新鮮なHBSS-H +バッファを持つ35mmの培養皿に各目を入れ、8cmのヴァンナハサミを使用して、オラセラタに到達するまで元の切開を通して角膜をカットします。次いで、オレ・コナラの下に切り、虹彩上皮および角膜を除去する。
9. 湾曲したピンセットでアイカップエッジ/オロラセラタを保持し、角度付きマイクロ鉗子を使用して、RPE層が切断されないことを確認するために神経のretinaを引き離します。その後、視神経への内部付着を切断する。一部のRPE細胞が神経残りに付着したままの場合は、インキュベーション時間を延長しますが、合計で45分を超えません。
10. 視神経を切り、各眼球を1.5mLの新鮮なトリプシン-EDTAを含む別の12ウェルプレートに移します。眼のコップが開いたままで、トリプシンに完全に沈んだままであることを確認してください。37°Cで5%CO2インキュベーターで45分間、眼球をインキュベートします。
11. トリプシンインキュベーション中に取り外したRPEシートと一緒に各アイカップを収集し、ウェルあたり1.5 mLのFBS溶液を含む12ウェルプレートに転送します。RPEシートがトリプシン溶液に残っている場合は、マイクロピペットを使用してFBS溶液でウェルに転送します。

4. プライマリマウスRPE細胞の分離

1. 視神経で各眼球を保持し、RPEシートの完全な剥離が達成されるまで、HBSS-H+で20%FBSの1.5 mLを含む12ウェルプレートに下に振ります。
2. マイクロピペットを使用してRPEシートとRPEクラスタを収集し、15mLチューブに入れます。白い白い部分の白い部分の白い部分は、培養を汚染する可能性があり、または脈絡膜を避ける。1つのチューブに同じマウスから2つの目をプールします。
3. 340 x g で2分間RTで遠心分離し、上清を捨てます。
4. リプシン-EDTAの1 mLでRPEペレットを穏やかに再懸濁(0.25%)37°Cの水浴中で1分間インキュベートし、RPEシートを単一細胞に分解します。インキュベーション後、マイクロピペットで10倍上下に軽くピペットを入れ、ピペットしながら泡形成を避けます。
5. 9 mLの新しく調製した RPE 培地を加えて、トリプシンを希釈し、不活性化し、340 x g で混合物を RT で 2 分間遠心分離します。
6. 上清を吸引し、マイクロピペットを使用して5%FBSのRPE培地中の細胞ペレットを150μL慎重に再懸濁し、細胞が均一に再懸濁されることを保証し、ピペット化しながら気泡形成を回避します。
7. ステップ1.2からラミニンコーティング膜挿入物を取り、底のチャンバからPBSを取り出し、RPE培地の700 μLを加えます。
8. 膜挿入液の上部チャンバーからラミニンを取り出し、RPE細胞懸濁液をチャンバの中央にドロップして均一に分配し、ピペット処理中に泡形成を回避します。
9. 膜インサートを37°Cの5%CO2インキュベーターに入れ、少なくとも24時間は邪魔しません。
10. 24時間後、顕微鏡下の膜挿入物を調べて、ほとんどのRPE細胞が挿入物に取り付けられ、合流率が少なくとも50%であることを確認してください(図1A)。最初の 72 時間の間にメディアを変更しないことが重要です。

5. 偏光RPE単層の培養

1. 細胞の取り付けができるようにRPE培地をリフレッシュする前に、培養中の単離されたRPE細胞を少なくとも72時間維持してください。播種時に50%以上の細胞合流は、適切な偏光RPE単層の形成に必要な基本である。
2. 細胞が結合された後に、新鮮で事前に温めたRPE培地(ステップ1.1.5)を使用して、週2回培養培地を変更する。血清は、最初の72時間後に培養培地から除去することができる。
   注:培養の1週間後、細胞はコンフルエント、六角形、二核、色素沈着および偏光(図1B)で、予想される細胞数は6.5mmトランスウェル挿入物あたり約50,000細胞であるべきである。培養で2週間後、健康な細胞を含むRPE単層が観察される。RPE カルチャには、補助的なマイクロビリ、基底面の折り畳み、およびタイトな接合部が表示されます (図 1C)。

6. TER測定

注: 培養で最低 4 日後に RPE 細胞の TER 測定を行い、RPE 単層の良好な整合性と分極化を確保してください。

1. 70%エタノールでボルトメータの電極を洗浄し、慎重に乾燥させます。
2. インキュベーターからトランスウェルを取り出し、温度変動による変化を避けるために3分以内にTER測定を行います。TERを測定するために、ボルトメーターの短い電極を上部チャンバーに浸し、長い電極を膜挿入部の底面チャンバーに浸す。細胞の剥離を防ぐためにRPE単層との接触を避けてください。
3. TERを計算するには、試料からブランク(細胞のないラミニンでコーティングされた膜挿入)の値を差し引く。次に、得られた値(オームで)に膜挿入物の表面積(6.5mm膜挿入物の場合は0.33cm2)を掛けます。製品は、培養72時間後に少なくとも200 Ω x cm²でなければなりません。TER 値は、2 週間後に 400 Ω x cm²を超える値を測定する必要があります。TER 値が小さい RPE カルチャを破棄します。

結果

このプロトコルは、遺伝子組み換えマウス¹からRPE細胞を単離および培養するために使用されてきた。マウス株や性別の間に違いは認められてはいない。この結果は、高齢者⁹の視力低下の最も一般的な原因である加齢黄斑変性症などの眼疾患のメカニズムの重要な側面を理解するのに役立った。このプロトコルに従って単離されたRPE細胞は、播種後24時間後...

ディスカッション

マウスRPE細胞の分離および培養のためのいくつかの方法は、1、13、20、22、26、27の前に開発されていたが、フェルナンデス・ゴディーノの方法は、最初に培養^1、9の培養でRPE細胞の効率的な増殖を可能...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable	BD Biosciences	309604
15 ml centrifuge tube	VWR International	21008-103
50 ml centrifuge tube	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Angled micro forceps	WPI	501727
Bench-top centrifuge	any
CO2 incubator	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope	Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length	WPI	14101
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm	BD Biosciences	353001
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Laminar flow hood	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long	WPI	503216
Non-essential amino acids 100X	Gibco	11140050
N1 Supplement 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Tissue culture treated 12-well plates	Fisher-Scientific	08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell supports 6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size	Fisher-Scientific	6780-2504