Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Resumo

Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 2016^1,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células RPE do mouse, que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas Transwell. O procedimento leva aproximadamente 3 horas.

Resumo

Os distúrbios oculares afetam milhões de pessoas em todo o mundo, mas a disponibilidade limitada de tecidos humanos dificulta seu estudo. Modelos de camundongos são ferramentas poderosas para entender a fisiopatologia de doenças oculares devido às suas semelhanças com a anatomia humana e a fisiologia. Alterações no epitélio pigmento da retina (RPE), incluindo alterações na morfologia e função, são características comuns compartilhadas por muitas doenças oculares. No entanto, o isolamento bem sucedido e a cultura das células RPE do mouse primário é muito desafiador. Este artigo é uma versão audiovisual atualizada do protocolo publicado anteriormente por Fernandez-Godino et al. em 2016 para isolar e cultivar eficientemente células RPE do mouse primário. Este método é altamente reproduzível e resulta em culturas robustas de monocamadas RPE altamente polarizadas e pigmentadas que podem ser mantidas por várias semanas na Transwells. Este modelo abre novos caminhos para o estudo dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes às doenças oculares. Além disso, fornece uma plataforma para testar abordagens terapêuticas que podem ser usadas para tratar doenças oculares importantes com necessidades médicas não atendidas, incluindo distúrbios hereditários da retina e degenerações maculares.

Introdução

Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 2016^1,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células de pigmento de retina de camundongos (RPE), que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas transwell. O RPE é uma monocamada localizada no olho entre a retina neural e a membrana do Bruch. Esta camada única consiste em células epiteliais altamente polarizadas e pigmentadas unidas por junções apertadas, exibindo uma forma hexagonal que se assemelha a um favo de mel². Apesar dessa aparente simplicidade histológica, o RPE executa uma grande variedade de funções críticas à retina e ao ciclo visual normal^2,3,4. As principais funções da monocamada RPE incluem absorção de luz, nutrição e renovação de fotorreceptores, remoção de produtos finais metabólicos, controle da homeostase de íon no espaço subretral e manutenção da barreira hemintária^2,3. O RPE também tem um papel importante na modulação local do sistema imunológico no olho^{5,6,7,8,9,10,11}. Degeneração e/ou disfunção do RPE são características comuns compartilhadas por muitas doenças oculares como retinite pigmentosa, amaurose congênita leber, albinismo, retinopatia diabética e degeneração macular^12,13,14,15. Infelizmente, a disponibilidade de tecidos humanos é limitada. Dada a sua homologia genética altamente conservada com humanos, os modelos de camundongos representam uma ferramenta adequada e útil para o estudo de distúrbios oculares^16,17,18,19. Além disso, o uso de células RPE primárias cultivadas proporciona vantagens como manipulação genética e testes de drogas que podem acelerar o desenvolvimento de novas terapias para esses transtornos que ameaçam a visão^9,11.

Os métodos existentes disponíveis para isolamento e cultura de RPE do mouse carecem de reprodutivelmente e não recapitulam os recursos RPE in vivo com confiabilidade suficiente. As células tendem a perder pigmentação, forma hexagonal e resistência elétrica transeptelial (TER) dentro de poucos dias na cultura^13,20. Uma vez que estabelecer essas culturas primárias de células RPE a partir de camundongos é um processo desafiador, este protocolo otimizado foi criado com base em outros protocolos para isolar células RPE de ratos e olhos humanos^21,22,23 para dissecar os olhos do rato, coletar o RPE e cultivar as células RPE do mouse in vitro.

Protocolo

Foram seguidas as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão.

NOTA: Este método tem sido comprovado com sucesso com camundongos de diferentes origens genéticas, incluindo C57BL/6J, B10. D2-Hc^o H2^d H2-T18^c/oSnJ, e ratos albinos, em várias idades. Use preferencialmente camundongos de 8 a 12 semanas para obter células RPE. As células RPE de camundongos mais velhos proliferam menos na cultura e os camundongos mais jovens têm células cada vez menores, o que requer a junção de olhos de diferentes animais para ter culturas viáveis.

1. Preparação de reagentes e inserções de membrana

1. Prepare os seguintes reagentes.
   1. Prepare o HBSS-H− (HBSS sem cálcio, sem tampão de magnésio + 10 mM HEPES): Adicione 1 mL de 1 M HEPES a 99 mL de hbss- (sem Ca/Mg). Armazenar a 4 °C até 1 mês.
   2. Prepare o HBSS-H+ (HBSS com cálcio, com tampão de magnésio + 10 mM HEPES): Adicione 1 mL de 1 M HEPES a 99 mL de tampão HBSS+ (com Ca/Mg). Armazenar a 4 °C até 1 mês.
   3. Preparar solução de hialuronidase (1 mg/mL): Adicionar 10 mg de hialuronidase a 10 mL de HBSS-H e filfiliá-lo com um filtro de seringa estéril de 0,4 μm usando uma seringa de 10 mL. Prepare-se fresco antes de usar e deixe-o em temperatura ambiente (RT; 20-25 °C).
   4. Prepare a solução FBS: Misture 20% de FBS com HBSS-H+. Adicione 2 mL de FBS a 8 mL de HBSS-H+. Prepare-se fresco antes do uso.
   5. Preparar o meio RPE: N1 Suplemento Médio 1/100 (v/v), glutamina 1/100 (v/v), penicilina-estreptomicina 1/100 (v/v) e solução de aminoácido não essencial 1/100 (v/v), hidrocortisona (20 μg/L), taurina (250 mg/L) e triiodo-thyronin (0,013 μg/L) em mem alfa + 5% FBS ou sem FBS^1,23,24. Se desejar, o FBS pode ser inativado pelo calor; nenhuma diferença foi observada. Prepare-se fresco para o isolamento RPE. Para manutenção da cultura celular, armazene a 4 °C até 1 mês.
   6. Prepare trypsin-EDTA: Prepare pequenas alíquotas de uso único (~8 mL) de trypsin-EDTA fresco (0,25%) e congelá-los a -20 oC. Descongele-os no RT antes de cada uso. Evite ciclos de congelamento.
2. Prepare as pastilhas de membrana (por exemplo, inserções Transwell).
   1. Equilibre as pastilhas de membrana de 6,5 mm com meio RPE por pelo menos 30 min a 37 °C, em uma incubadora de 5% de CO₂-aeradas. Use uma inserção de membrana para células RPE de duas células de camundongos.
   2. Após a incubação, substitua o meio do compartimento inferior por 700 μL de PBS.
   3. Retire o meio do compartimento superior e cubra a inserção da membrana com 100 μL de laminina de rato de 10 μg/mL (em PBS) por pelo menos 2 h no RT (incubações mais curtas podem levar à má fixação das células à pastilha).
   4. Cubra uma inserção de membrana extra para usar em branco para medições ter.

2. Dissecção e enucleação dos olhos do rato

1. Eutanize os camundongos por asfixia de CO₂ colocando-os em uma câmara de CO₂ e liberando lentamente CO₂ a uma taxa de preenchimento de 30-70% do volume da câmara por minuto.
2. Coloque as pontas em ângulo e serrilhadas de micro-fórceps em cada lado do olho do mouse e pressione suavemente para proptose o globo ocular (enucleação).
3. Feche as fórceps colocadas ao redor do globo ocular. Em seguida, puxe suavemente enquanto se move para frente e para trás para desprender todo o olho com o nervo óptico dos músculos oculares, garantindo que nenhum tecido conjuntivo permaneça preso à esclera.
4. Enxágüe o globo ocular enucleado em 70% de etanol antes de colocá-los em um poço de uma placa de seis poços com 3 mL de HBSS-H- no gelo.
5. Repita as etapas 2.2 a 2.4 para remover o segundo olho do mouse. Prossiga com os próximos passos dentro de 30 minutos.
   NOTA: Recomenda-se enuclear/dissecar apenas dois olhos por vez até que alguma experiência seja adquirida.

3. Coleta do RPE

NOTA: Execute as seguintes etapas em condições estéreis em um capô de fluxo laminar. Para evitar incubações estendidas no gelo, que podem resultar em morte celular RPE, não colecione mais de dois olhos por vez.

1. Use um estereótipo dissecador, Dumont #5 fórceps e tesouras angulares para limpar cuidadosamente todo o tecido conjuntivo, sangue e músculos que permanecem presos ao globo ocular sem fazer nenhum corte na esclera. Altere o tampão de 3 mL de HBSS-H regularmente, conforme necessário, para manter os olhos frescos e limpos, e evitar a contaminação das culturas RPE.
2. Use o nervo óptico como alça para segurar o globo ocular e fazer um buraco no centro da córnea com uma lâmina de #11 de aço carbono afiada.
3. Use Dumont #5 tesoura para fazer três incisões na córnea através do orifício acima mencionado, garantindo que haja espaço suficiente para remover a lente.
4. Segure o nervo óptico e aplique uma leve pressão na ora serrata com a base da tesoura angular até que a lente saia completamente. Deixe o epitélio de íris no lugar para evitar o descolamento da retina neural e do RPE durante a incubação. Coloque o olho no tampão HBSS-H.
5. Repita os passos 3.1-3.4 para dissecar o segundo olho.
6. Incubar os olhos sem lentes em solução de hialuronidase em uma placa de 12 poços a 37 °C por 45 min em uma incubadora de 5% de CO₂-aerado (1,5 mL/bem) para desprender a retina neural do RPE.
7. Coloque cada olho em um novo poço e incuba-o no gelo por 30 minutos com 1,5 mL de tampão HBSS-H+ frio por poço para parar a atividade de hialuronidase. Não prolongue a incubação por mais de 45 minutos.
8. Lave e coloque cada olho em um prato de cultura de 35 mm com tampão HBSS-H+ fresco e corte a córnea através das incisões originais até chegar à serrata de ora usando uma tesoura Vannas de 8 cm. Em seguida, corte abaixo da ora serrata para remover o epitélio de íris e córnea.
9. Segure a borda da opa/serrata de ora com pinças curvas e, usando microforceps angulares, afaste a retina neural certificando-se de que a camada RPE não seja cortada. Em seguida, corte o apego interno ao nervo óptico. Se algumas células RPE permanecerem ligadas à retina neural, estenda o tempo de incubação, mas não exceda o total de 45 minutos.
10. Corte o nervo óptico e transfira cada pálpebra para uma placa diferente de 12 poços contendo 1,5 mL de trippsina-EDTA fresca por poço. Certifique-se de que as copas dos olhos permaneçam abertas e completamente submersas na trippsina. Incubar as soluços a 37 °C por 45 min em uma incubadora de CO₂ de 5%.
11. Colete cada ocular juntamente com quaisquer folhas de RPE destacadas durante a incubação de trippsina e transfira-as para uma placa de 12 poços contendo 1,5 mL de solução FBS por poço. Se as folhas RPE permanecerem na solução trypsin, use uma micropipette para transferi-las para o poço com a solução FBS.

4. Isolamento das células RPE do mouse primário

1. Segure cada xícara ocular pelo nervo óptico e agite-a de frente para baixo na placa de 12 poços contendo 1,5 mL de 20% de FBS no HBSS-H+ até que o desprendimento completo das folhas RPE seja alcançado.
2. Colete quaisquer folhas RPE e clusters RPE com uma micropipette e coloque-as em um tubo de 15 mL. Evite quaisquer pedaços brancos de esclera ou coroide, que possam contaminar as culturas. Piscina dois olhos do mesmo rato em um tubo.
3. Centrifugar a mistura a 340 x g por 2 min no RT e descartar o supernaspe.
4. Ressuspenque suavemente a pelota RPE em 1 mL de trypsin-EDTA (0,25%) e incubar a mistura por 1 min em um banho de água a 37 °C para desagregar as folhas RPE em células únicas. Após a incubação, cochilhe suavemente para cima e para baixo 10x com uma micropipette, evitando a formação de bolhas durante a pipetação.
5. Adicione 9 mL de meio RPE recém-preparado para diluir e inativar a trippsina e centrifugar a mistura a 340 x g por 2 min no RT.
6. Aspire o supernascer e resuspenque cuidadosamente a pelota celular em 150 μL de meio RPE com 5% de FBS usando uma micropipette, garantindo que as células sejam resuspensadas e evitando a formação de bolhas durante a pipeta.
7. Faça a pastilha de membrana revestida de laminina a partir da etapa 1.2, remova o PBS da câmara inferior e adicione 700 μL de meio RPE.
8. Remova a laminina da câmara superior da inserção da membrana e distribua a suspensão da célula RPE de forma gota e uniformemente para o centro da câmara, evitando a formação de bolhas durante a pipetação.
9. Coloque a inserção da membrana em uma incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C e deixe intacta por pelo menos 24 h.
10. Após 24h, verifique a inserção da membrana sob o microscópio para certificar-se de que a maioria das células RPE estão presas à inserção e a confluência é de pelo menos 50%(Figura 1A). É fundamental não mudar a mídia durante as primeiras 72 h.

5. Cultura de monocamadas RPE polarizadas

1. Mantenha as células RPE isoladas na cultura por pelo menos 72 h antes de atualizar o meio RPE para permitir o apego celular. Uma confluência celular de 50% ou mais na semeadura é fundamental para a formação de uma monocamada RPE polarizada adequada.
2. Altere o meio de cultura duas vezes por semana usando meio RPE fresco e pré-aquecido (passo 1.1.5) depois que as células estiverem conectadas. O soro pode ser removido do meio de cultura após as primeiras 72 h.
   NOTA: Após uma semana na cultura, as células devem ser confluentes, hexagonais, binucleadas, pigmentadas e polarizadas(Figura 1B),com o número de células esperados em torno de 50.000 células por inserção transwell de 6,5 mm. Após duas semanas na cultura, são observadas monocamadas RPE compostas por células saudáveis. As culturas RPE exibem microvilli apical, dobras basais e junções apertadas(Figura 1C).

6. Medição ter

NOTA: Realize medições TER das células RPE após um mínimo de 4 dias na cultura para garantir uma boa integridade e polarização da monocamada RPE.

1. Limpe os eletrodos do voltohmômetro com 70% de etanol e seque-os cuidadosamente.
2. Pegue as transes da incubadora e realize a medição do TER dentro de 3 minutos para evitar alterações devido às flutuações de temperatura. Para medir o TER, mergulhe o eletrodo curto do voltohmômetro na câmara superior e o eletrodo longo na câmara inferior da pastilha da membrana. Evite contato com a monocamada RPE para evitar o descolamento celular.
3. Para calcular o TER, deduza o valor do vazio (inserção de membrana revestida com laminina sem células) da amostra. Em seguida, multiplique o valor obtido (em ohms) pela área superficial da pastilha da membrana (0,33 cm² no caso da pastilha de membrana de 6,5 mm). O produto deve ter pelo menos 200 Ω x cm^{2 após} 72 h na cultura. Os valores ter devem medir acima de 400 Ω x cm² após duas semanas. Descarte culturas RPE com baixos valores ter.

Resultados

Este protocolo tem sido usado para isolar e cultivar células RPE de camundongos geneticamente modificados¹. Não foram observadas diferenças entre cepas de camundongos ou sexo. Os resultados têm ajudado a compreender alguns aspectos importantes do mecanismo subjacente às doenças oculares subjacentes, como a degeneração macular relacionada à idade, que é a causa mais comum de perda de visão entre os idosos⁹. As células RPE isoladas após este protocolo foram compl...

Discussão

Enquanto vários métodos para o isolamento e cultura das células RPE do camundongo haviam sido desenvolvidos antes^{de 1,13,20,22,26,27}, o método de Fernandez-Godino usou pela primeira vez inserções de membrana permitindo o crescimento eficiente das células RPE na cultura durante as semanas^1,<...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable	BD Biosciences	309604
15 ml centrifuge tube	VWR International	21008-103
50 ml centrifuge tube	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Angled micro forceps	WPI	501727
Bench-top centrifuge	any
CO2 incubator	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope	Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length	WPI	14101
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm	BD Biosciences	353001
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Laminar flow hood	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long	WPI	503216
Non-essential amino acids 100X	Gibco	11140050
N1 Supplement 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Tissue culture treated 12-well plates	Fisher-Scientific	08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell supports 6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size	Fisher-Scientific	6780-2504