Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Resumo

Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 2016^1,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células RPE do mouse, que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas Transwell. O procedimento leva aproximadamente 3 horas.

Resumo

Os distúrbios oculares afetam milhões de pessoas em todo o mundo, mas a disponibilidade limitada de tecidos humanos dificulta seu estudo. Modelos de camundongos são ferramentas poderosas para entender a fisiopatologia de doenças oculares devido às suas semelhanças com a anatomia humana e a fisiologia. Alterações no epitélio pigmento da retina (RPE), incluindo alterações na morfologia e função, são características comuns compartilhadas por muitas doenças oculares. No entanto, o isolamento bem sucedido e a cultura das células RPE do mouse primário é muito desafiador. Este artigo é uma versão audiovisual atualizada do protocolo publicado anteriormente por Fernandez-Godino et al. em 2016 para isolar e cultivar eficientemente células RPE do mouse primário. Este método é altamente reproduzível e resulta em culturas robustas de monocamadas RPE altamente polarizadas e pigmentadas que podem ser mantidas por várias semanas na Transwells. Este modelo abre novos caminhos para o estudo dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes às doenças oculares. Além disso, fornece uma plataforma para testar abordagens terapêuticas que podem ser usadas para tratar doenças oculares importantes com necessidades médicas não atendidas, incluindo distúrbios hereditários da retina e degenerações maculares.

Introdução

Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 2016^1,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células de pigmento de retina de camundongos (RPE), que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas transwell. O RPE é uma monocamada localizada no olho entre a retina neural e a membrana do Bruch. Esta camada única consiste em células epiteliais altamente polarizadas e pigmentadas unidas por junções apertadas, exibindo uma forma hexagonal que se assemelha a um favo de mel². Apesar dessa aparente simplicidade histológica, o RPE executa uma grande ....

Protocolo

Foram seguidas as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão.

NOTA: Este método tem sido comprovado com sucesso com camundongos de diferentes origens genéticas, incluindo C57BL/6J, B10. D2-Hc^o H2^d H2-T18^c/oSnJ, e ratos albinos, em várias idades. Use preferencialmente camundongos de 8 a 12 semanas para obter células RPE. As células RPE de camundongos mais velhos proliferam menos na cultura e os camundongos mais jovens têm células cada vez menores, o que requer a junção de olhos de diferentes animais para ter culturas viáveis.

1. Preparação ....

Resultados

Este protocolo tem sido usado para isolar e cultivar células RPE de camundongos geneticamente modificados¹. Não foram observadas diferenças entre cepas de camundongos ou sexo. Os resultados têm ajudado a compreender alguns aspectos importantes do mecanismo subjacente às doenças oculares subjacentes, como a degeneração macular relacionada à idade, que é a causa mais comum de perda de visão entre os idosos⁹. As células RPE isoladas após este protocolo foram compl.......

Discussão

Enquanto vários métodos para o isolamento e cultura das células RPE do camundongo haviam sido desenvolvidos antes^{de 1,13,20,22,26,27}, o método de Fernandez-Godino usou pela primeira vez inserções de membrana permitindo o crescimento eficiente das células RPE na cultura durante as semanas^1,<.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable	BD Biosciences	309604
15 ml centrifuge tube	VWR International	21008-103
50 ml centrifuge tube	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Angled micro forceps	WPI	501727
Bench-top centrifuge	any
CO2 incubator	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope	Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length	WPI	14101
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm	BD Biosciences	353001
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Laminar flow hood	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long	WPI	503216
Non-essential amino acids 100X	Gibco	11140050
N1 Supplement 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Tissue culture treated 12-well plates	Fisher-Scientific	08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell supports 6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size	Fisher-Scientific	6780-2504