Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Riepilogo

Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. La procedura dura circa 3 ore.

Abstract

I disturbi oculari colpiscono milioni di persone in tutto il mondo, ma la limitata disponibilità di tessuti umani ostacola il loro studio. I modelli di topo sono strumenti potenti per comprendere la fisiopatologia delle malattie oculari a causa delle loro somiglianze con l'anatomia e la fisiologia umana. Le alterazioni dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), inclusi i cambiamenti nella morfologia e nella funzione, sono caratteristiche comuni condivise da molti disturbi oculari. Tuttavia, l'isolamento e la coltura di successo delle cellule RPE del topo primario sono molto impegnativi. Questo documento è una versione audiovisiva aggiornata del protocollo precedentemente pubblicato da Fernandez-Godino et al. Questo metodo è altamente riproducibile e si traduce in solide colture di monostrati RPE altamente polarizzati e pigmentati che possono essere mantenuti per diverse settimane su Transwells. Questo modello apre nuove strade per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari alla base delle malattie oculari. Inoltre, fornisce una piattaforma per testare approcci terapeutici che possono essere utilizzati per trattare importanti malattie oculari con esigenze mediche non soddisfatte, compresi disturbi ereditari della retina e degenerazioni maculari.

Introduzione

Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. L'RPE è un monostrato situato nell'occhio tra la retina neurale e la membrana di Bruch. Questo singolo strato è costituito da cellule epiteliali altamente polarizzate e pigmentate unite da giunzioni strette, che presentano una forma esagonale che ricorda un nido d'ape². Nonostante questa apparente semplicità istologica, l'RPE svolge un'ampia varietà di funzioni critiche per la retina e il normale ciclo^{visivo 2,3,4}. Le funzioni principali del monostrato RPE includono l'assorbimento della luce, il nutrimento e il rinnovamento dei fotorecettori, la rimozione dei prodotti finali metabolici, il controllo dell'omeostasi ionica nello spazio subretinale e il mantenimento della barriera emato-retinica^2,3. L'RPE ha anche un ruolo importante nella modulazione locale del sistema immunitario nell'occhio^{5,6,7,8,9,10,11}. Degenerazione e/o disfunzione dell'RPE sono caratteristiche comuni condivise da molti disturbi oculari come retinite pigmentosa, amaurosi congenita di Leber, albinismo, retinopatia diabetica e degenerazione maculare^12,13,14,15. Sfortunatamente, la disponibilità di tessuti umani è limitata. Data la loro omologia genetica altamente conservata con l'uomo, i modelli di topo rappresentano uno strumento adatto e utile per studiare i disturbi^{oculari 16,17,18,19}. Inoltre, l'uso di cellule RPE primarie coltivate offre vantaggi come la manipolazione genetica e il test farmacologico che possono accelerare lo sviluppo di nuove terapie per questi disturbi potenzialmente^{letali per la vista 9,11}.

I metodi esistenti disponibili per l'isolamento e la coltura dell'RPE del mouse mancano in modo riproducibile e non ricapitolano le funzionalità RPE in vivo con sufficiente affidabilità. Le cellule tendono a perdere pigmentazione, forma esagonale e resistenza elettrica transepiteliale (TER) entro pochi giorni in^{coltura 13,20}. Poiché stabilire queste colture primarie di cellule RPE dai topi è un processo impegnativo, questo protocollo ottimizzato è stato creato sulla base di altri protocolli per isolare le cellule RPE dal ratto e dagli occhi^{umani 21,22,23 per} sezionare gli occhi del mouse, raccogliere l'RPE e coltura le cellule RPE del topo in vitro.

Protocollo

Sono state seguite le linee guida della dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e della visione.

NOTA: Questo metodo si è dimostrato efficace con topi di diversa origine genetica, tra cui C57BL/6J, B10. D2-Hc^o H2^d H2-T18^c/oSnJ, e topi albini, a varie età. Preferibilmente utilizzare topi da 8 a 12 settimane per ottenere cellule RPE. Le cellule RPE dei topi più anziani proliferano meno in coltura e i topi più giovani hanno sempre più cellule, il che richiede la messa in comune di occhi di animali diversi per avere colture vitali.

1. Preparazione dei reagenti e degli inserti a membrana

1. Preparare i seguenti reagenti.
   1. Preparare HBSS-H− (HBSS senza calcio, senza tampone di magnesio + 10 mM HEPES): Aggiungere 1 mL di 1 M HEPES a 99 mL di tampone HBSS- (senza Ca/Mg). Conservare a 4 °C fino a 1 mese.
   2. Preparare HBSS-H+ (HBSS con calcio, con tampone di magnesio + 10 mM HEPES): Aggiungere 1 mL da 1 M HEPES a 99 mL di tampone HBSS+ (con Ca/Mg). Conservare a 4 °C fino a 1 mese.
   3. Preparare la soluzione di ialuronidasi (1 mg/mL): Aggiungere 10 mg di ialuronidasi a 10 ml di HBSS-H− e filtrarla con un filtro siringa sterile da 0,4 μm utilizzando una siringa da 10 ml. Preparare fresco prima dell'uso e lasciarlo a temperatura ambiente (RT; 20-25 °C).
   4. Preparare la soluzione FBS: mescolare FBS al 20% con HBSS-H+. Aggiungere 2 mL di FBS a 8 mL di HBSS-H+. Preparare fresco prima dell'uso.
   5. Preparare il supporto RPE: N1 Medium Supplement 1/100 (v/v), glutammina 1/100 (v/v), penicillina-streptomicina 1/100 (v/v) e soluzione di amminoacido non essenziali 1/100 (v//v), idrocortisone (20 μg/L), taurina (250 mg/L) e triiodo-tironenina (0,013 μg/L) in alfa MEM + 5% FBS o senza FBS^1,23,24. Se lo si desidera, FBS potrebbe essere inattivato termicamente; non sono state osservate differenze. Prepararsi fresco per l'isolamento RPE. Per la manutenzione della coltura cellulare, conservare a 4 °C fino a 1 mese.
   6. Preparare la tripside-EDTA: Preparare piccole aliquote mono impiego (~8 mL) di tripsiderina fresca-EDTA (0,25%) e congelarli a -20 oC. Scongelarli a RT prima di ogni utilizzo. Evitare cicli di congelamento-scongelamento.
2. Preparare gli inserti a membrana (ad esempio, inserti Transwell).
   1. Equilibrare gli inserti a membrana da 6,5 mm con mezzo RPE per almeno 30 min a 37 °C, in un incubatore aerato al 5% di CO_2. Utilizzare un inserto a membrana per seminare cellule RPE da due occhi del mouse.
   2. Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo del vano inferiore con 700 μL di PBS.
   3. Rimuovere il mezzo dal vano superiore e rivestire l'inserto della membrana con 100 μL di laminina di topo 10 μg/mL (in PBS) per almeno 2 ore a RT (le incubazioni più brevi possono portare a uno scarso fissaggio delle cellule all'inserto).
   4. Rivestire un inserto a membrana aggiuntivo da utilizzare come vuoto per le misurazioni TER.

2. Dissezione ed enucleazione degli occhi del topo

1. Eutanasia dei topi mediante asfissia di CO₂ posizionandoli in una camera di CO₂ e rilasciando lentamente CO₂ ad una velocità di riempimento del 30-70% del volume della camera al minuto.
2. Posizionare le punte angolate e seghettate delle micro-forcep su ciascun lato dell'occhio del mouse e premere delicatamente per proposizione del bulbo oculare (enucleazione).
3. Chiudere le forcep poste attorno al bulbo oculare. Quindi, tirare delicatamente mentre ci si muove in avanti e all'indietro per staccare l'intero occhio con il nervo ottico dai muscoli oculari, assicurando che nessun tessuto connettivo rimanga attaccato alla sclera.
4. Risciacquare il bulbo oculare enucleato in etanolo al 70% prima di metterli in un pozzo di una piastra a sei po porsi con 3 mL di HBSS-H− sul ghiaccio.
5. Ripetere i passaggi da 2.2 a 2.4 per rimuovere il secondo occhio del mouse. Procedere con i passaggi successivi entro 30 minuti.
   NOTA: Si consiglia di enucleare / sezionare solo due occhi alla volta fino a quando non viene acquisita una certa esperienza.

3. Raccolta dell'RPE

NOTA: Eseguire i seguenti passaggi in condizioni sterili in una cappa di flusso laminare. Per evitare estese incubazioni sul ghiaccio, che possono causare la morte cellulare RPE, non raccogliere più di due occhi alla volta.

1. Usa uno stereomicroscopio sezionante, le forcelle Dumont #5 e le forbici angolate per pulire con cura tutto il tessuto connettivo, il sangue e i muscoli che rimangono attaccati al bulbo oculare senza effettuare tagli nella sclera. Cambiare regolarmente il tampone di 3 mL di HBSS-H−, se necessario, per mantenere l'occhio fresco e pulito ed evitare la contaminazione delle colture RPE.
2. Usa il nervo ottico come maniglia per tenere il bulbo oculare e fare un buco al centro della cornea con una lama affilata in acciaio al carbonio #11 aerea.
3. Utilizzare Dumont #5 forbici per fare tre incisioni nella cornea attraverso il foro di cui sopra, assicurando che ci sia spazio sufficiente per rimuovere l'obiettivo.
4. Tenere il nervo ottico e applicare una leggera pressione all'ora serrata con la base delle forbici angolate fino a quando l'obiettivo non esce completamente. Lasciare l'epitelio dell'iride in posizione per prevenire il distacco della retina neurale e dell'RPE durante l'incubazione. Posizionare l'occhio in HBSS-H-buffer.
5. Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.4 per sezionare il secondo occhio.
6. Incubare gli occhi senza lenti in soluzione di ialuronidasi in una piastra da 12 pozzetti a 37 °C per 45 minuti in un incubatore aerato di CO₂al 5% (1,5 mL / pozzo) per staccare la retina neurale dall'RPE.
7. Mettere ogni occhio in un nuovo pozzo e incubarlo sul ghiaccio per 30 minuti con 1,5 mL di tampone freddo HBSS-H+ per pozzo per fermare l'attività dell'ialuronidasi. Non estendere l'incubazione per più di 45 minuti.
8. Lavare e posizionare ogni occhio in un piatto da coltura da 35 mm con tampone fresco HBSS-H+ e tagliare la cornea attraverso le incisioni originali fino a raggiungere l'ora serrata utilizzando forbici Vannas da 8 cm. Quindi, tagliare sotto l'ora serrata per rimuovere l'epitelio dell'iride e la cornea.
9. Tenere il bordo/o lo serrata dell'oculare con una pinzetta curva e, utilizzando microforze angolate, estrarre la retina neurale assicurandosi che lo strato RPE non sia tagliato. Quindi, tagliare l'attacco interno al nervo ottico. Se alcune cellule RPE rimangono attaccate alla retina neurale, prolungare il tempo di incubazione ma non superare i 45 minuti totali.
10. Tagliare il nervo ottico e trasferire ogni oculare su una diversa piastra da 12 pozzi contenente 1,5 mL di tripside-EDTA fresca per pozzo. Assicurarsi che gli occhi rimangano aperti e completamente immersi nella tripina. Incubare gli occhi a 37 °C per 45 minuti in un incubatore di CO_{2 al 5%.}
11. Raccogliere ogni oculare insieme a eventuali fogli di RPE staccati durante l'incubazione della tripparina e trasferirli in una piastra da 12 po porsi contenente 1,5 mL di soluzione FBS per pozzo. Se i fogli RPE rimangono nella soluzione di tripina, utilizzare una micropipetta per trasferirli al pozzo con la soluzione FBS.

4. Isolamento delle celle RPE primarie del mouse

1. Tenere ogni oculare vicino al nervo ottico e scuoterlo a faccia in giù nella piastra da 12 porri contenente 1,5 mL di FBS al 20% in HBSS-H+ fino a raggiungere il completo distacco dei fogli RPE.
2. Raccogliere eventuali fogli RPE e cluster RPE con una micropipetta e posizionarli in un tubo da 15 ml. Evitare pezzi bianchi di sclera o coroide, che potrebbero contaminare le colture. Mettere in piscina due occhi dallo stesso mouse in un tubo.
3. Centrifugare la miscela a 340 x g per 2 minuti a RT e scartare il supernatante.
4. Rimorsiva delicatamente il pellet di RPE in 1 mL di tripsiderina-EDTA (0,25%) e incubare la miscela per 1 minuto in un bagno d'acqua a 37 °C per disaggregare i fogli di RPE in singole cellule. Dopo l'incubazione, pipettare delicatamente su e giù 10x con una micropipetta, evitando la formazione di bolle durante la pipettazione.
5. Aggiungere 9 mL di mezzo RPE appena preparato per diluire e inattivare la tripparina e centrifugare la miscela a 340 x g per 2 minuti a RT.
6. Aspirare il supernatante e rimescolare con cura il pellet cellulare in 150 μL di mezzo RPE con FBS al 5% utilizzando una micropipetta, assicurando che le cellule siano rimorsi in modo omogeneo ed evitando la formazione di bolle durante la pipettazione.
7. Prendere l'inserto a membrana rivestito di laminina dal passo 1.2, rimuovere pbs dalla camera inferiore e aggiungere 700 μL di mezzo RPE.
8. Rimuovere la laminina dalla camera superiore dell'inserto della membrana e distribuire la sospensione della cella RPE in modo dropwise e uniformemente al centro della camera, evitando la formazione di bolle durante la pipettazione.
9. Posizionare l'inserto della membrana in un incubatore di CO_{2 al 5%} a 37 °C e lasciare indisturbato per almeno 24 ore.
10. Dopo 24 ore, controllare l'inserto della membrana al microscopio per assicurarsi che la maggior parte delle cellule RPE siano attaccate all'inserto e che la confluenza sia almeno del 50%(Figura 1A). È fondamentale non cambiare i supporti durante le prime 72 ore.

5. Coltura di monostrati RPE polarizzati

1. Mantenere le celle RPE isolate in coltura per almeno 72 ore prima di aggiornare il supporto RPE per consentire l'attacco cellulare. Una confluenza cellulare del 50% o più alla semina è fondamentale per la formazione di un monostrato RPE polarizzato adatto.
2. Cambiare il mezzo di coltura due volte a settimana utilizzando un mezzo RPE fresco e preri riscaldato (passaggio 1.1.5) dopo che le cellule sono collegate. Il siero può essere rimosso dal mezzo di coltura dopo le prime 72 ore.
   NOTA: Dopo una settimana di coltura, le cellule devono essere confluenti, esagonali, bi-nucleate, pigmentate e polarizzate (Figura 1B), con un numero di cellule previsto di circa 50.000 cellule per inserto Transwell da 6,5 mm. Dopo due settimane di coltura, si osservano monostrati RPE composti da cellule sane. Le colture RPE mostrano microvilli apicali, informazione basale e giunzioni strette (Figura 1C).

6. Misurazione TER

NOTA: Eseguire misurazioni TER delle cellule RPE dopo un minimo di 4 giorni in coltura per garantire una buona integrità e polarizzazione del monostrato RPE.

1. Pulire gli elettrodi del voltohmmetro con il 70% di etanolo e asciugarli con cura.
2. Prendere i traslitti dall'incubatore ed eseguire la misurazione TER entro 3 minuti per evitare alterazioni dovute a fluttuazioni di temperatura. Per misurare ter, immergere l'elettrodo corto del voltohmmetro nella camera superiore e l'elettrodo lungo nella camera inferiore dell'inserto della membrana. Evitare il contatto con il monostrato RPE per evitare il distacco cellulare.
3. Per calcolare ter, detrarre il valore dello spazio vuoto (inserto a membrana rivestito con laminina senza celle) dal campione. Quindi moltiplicare il valore ottenuto (in ohm) per la superficie dell'inserto della membrana (0,33 cm² nel caso di inserto a membrana da 6,5 mm). Il prodotto deve essere di almeno 200 Ω x cm² dopo 72 ore di coltura. I valori TER devono misurare oltre 400 Ω x cm² dopo due settimane. Scartare le impostazioni cultura RPE con valori TER bassi.

Risultati

Questo protocollo è stato utilizzato per isolare e coltura cellule RPE da topi geneticamente modificati¹. Non sono state osservate differenze tra ceppi di topi o sesso. I risultati hanno contribuito a comprendere alcuni aspetti importanti del meccanismo alla base delle malattie oculari come la degenerazione maculare legata all'età, che è la causa più comune di perdita della vista tra gli anziani⁹. Le cellule RPE isolate a seguito di questo protocollo sono state completa...

Discussione

Mentre diversi metodi per l'isolamento e la coltura delle cellule RPE del topo^{erano stati sviluppati prima di 1,13,20,22}, 26^,27, il metodo di Fernandez-Godino ha utilizzato per la prima volta inserti a membrana che consentono la crescita efficiente delle cellule RPE in^{coltura per le settimane 1,9<...}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable	BD Biosciences	309604
15 ml centrifuge tube	VWR International	21008-103
50 ml centrifuge tube	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Angled micro forceps	WPI	501727
Bench-top centrifuge	any
CO2 incubator	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope	Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length	WPI	14101
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm	BD Biosciences	353001
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Laminar flow hood	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long	WPI	503216
Non-essential amino acids 100X	Gibco	11140050
N1 Supplement 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Tissue culture treated 12-well plates	Fisher-Scientific	08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell supports 6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size	Fisher-Scientific	6780-2504