Dissection efficace et culture des cellules épithéliales rétiniennes primaires de pigment de souris

Résumé

Ce protocole, qui a été initialement rapporté par Fernandez-Godino et coll. en 2016¹, décrit une méthode pour isoler efficacement et culturer les cellules RPE de souris, qui forment un monocouche RPE fonctionnel et polarisé en moins d’une semaine sur les plaques Transwell. La procédure dure environ 3 heures.

Résumé

Les troubles oculaires affectent des millions de personnes dans le monde, mais la disponibilité limitée des tissus humains entrave leur étude. Les modèles murins sont des outils puissants pour comprendre la pathophysiologie des maladies oculaires en raison de leurs similitudes avec l’anatomie et la physiologie humaines. Les altérations de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), y compris les changements de morphologie et de fonction, sont des caractéristiques communes partagées par de nombreux troubles oculaires. Cependant, l’isolement et la culture réussis des cellules primaires de RPE de souris sont très provocants. Cet article est une version audiovisuelle mise à jour du protocole précédemment publié par Fernandez-Godino et coll. en 2016 pour isoler et culture efficacement les cellules primaires de l’EPR de souris. Cette méthode est hautement reproductible et se traduit par des cultures robustes de monomères RPE fortement polarisés et pigmentés qui peuvent être maintenus pendant plusieurs semaines sur Transwells. Ce modèle ouvre de nouvelles voies pour l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents aux maladies oculaires. En outre, il fournit une plate-forme pour tester des approches thérapeutiques qui peuvent être utilisées pour traiter les maladies oculaires importantes avec des besoins médicaux non satisfaits, y compris les troubles rétiniens héréditaires et les dégénérescences maculaires.

Introduction

Ce protocole, qui a été initialement rapporté par Fernandez-Godino et coll. en 2016¹, décrit une méthode pour isoler efficacement et culturer les cellules d’épithélium rétinien de pigment de souris (RPE), qui forment un monocouche RPE fonctionnel et polarisé en moins d’une semaine sur les plaques Transwell. Le RPE est un monocouche situé dans l’œil entre la rétine neurale et la membrane du Bruch. Cette seule couche se compose de cellules épithéliales fortement polarisées et pigmentées reliées par des jonctions serrées, présentant une forme hexagonale qui ressemble à un nid^{d’abeilles 2}. Malgré cette apparente simplicité histologique, le RPE remplit une grande variété de fonctions critiques pour la rétine et le cycle visuel normal^2,3,4. Les fonctions principales du monocouche rpe incluent l’absorption de lumière, l’alimentation et le renouvellement des photorécepteurs, l’enlèvement des produits finaux métaboliques, le contrôle de l’homéostasie irationnelle dans l’espace subretinal et le maintien de la barrière hémato-rétinienne^2,3. L’EPR a également un rôle important dans la modulation locale du système immunitaire dans^{l’œil 5,6,7,8,9,10,11}. La dégénérescence et/ou le dysfonctionnement de l’EPR sont des caractéristiques communes partagées par de nombreux troubles oculaires tels que la rétinite pigmentaire, l’amaurose congénitale de Leber, l’albinisme, la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire^12,13,14,15. Malheureusement, la disponibilité des tissus humains est limitée. Compte tenu de leur homologie génétique très conservée avec les humains, les modèles muraux représentent un outil approprié et utile pour étudier les troubles^{oculaires 16,17,18,19}. En outre, l’utilisation de cellules primaires d’EPR cultivés offre des avantages tels que la manipulation génétique et le dépistage des drogues qui peuvent accélérer le développement de nouvelles thérapies pour ces troubles potentiellement menaçant la vision^9,11.

Les méthodes existantes disponibles pour l’isolement et la culture rpe souris manquent reproductiblement et ne récapitulent pas les caractéristiques rpe in vivo avec suffisamment de fiabilité. Les cellules ont tendance à perdre la pigmentation, la forme hexagonale et la résistance électrique transepithelial (TER) en quelques jours dans la culture^13,20. Depuis l’établissement de ces cultures primaires de cellules RPE à partir de souris est un processus difficile, ce protocole optimisé a été créé sur la base d’autres protocoles pour isoler les cellules RPE des yeux de rat^{et humains 21,22,23} pour disséquer les yeux de souris, recueillir l’EPR et la culture des cellules RPE souris in vitro.

Protocole

Les lignes directrices de l’Énoncé arvo sur l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle ont été suivies.

REMARQUE : Cette méthode a été prouvée réussie avec des souris de différents milieux génétiques, y compris C57BL/6J, B10. D2-Hc^o H2^d H2-T18^c/oSnJ, et souris albinos, à différents âges. Utilisez de préférence des souris âgées de 8 à 12 semaines pour obtenir des cellules RPE. Les cellules RPE de souris plus âgées prolifèrent moins en culture et les souris plus jeunes ont des cellules de moins en moins petites, ce qui nécessite la mise en commun des yeux de différents animaux pour avoir des cultures viables.

1. Préparation des réachageurs et des inserts membranaires

1. Préparez les réhésifs suivants.
   1. Préparer HBSS-H− (HBSS sans calcium, sans tampon de magnésium + 10 mM HEPES): Ajouter 1 mL de 1 M HEPES à 99 mL de HBSS- (sans Ca/Mg) tampon. Conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
   2. Préparer HBSS-H+ (HBSS avec calcium, avec tampon magnésium + 10 mM HEPES): Ajouter 1 mL de 1 M HEPES à 99 mL de HBSS+ (avec Ca / Mg) tampon. Conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
   3. Préparer la solution hyaluronidase (1 mg/mL) : Ajouter 10 mg d’hyaluronidase à 10 mL de HBSS-H− et filtrer à l’aide d’un filtre stérile de seringue de 0,4 μm à l’aide d’une seringue de 10 mL. Préparer frais avant utilisation et le laisser à température ambiante (RT; 20-25 °C).
   4. Préparer la solution FBS : Mélangez 20 % de FBS avec HBSS-H+. Ajouter 2 mL de FBS à 8 mL de HBSS-H+. Préparer frais avant utilisation.
   5. Préparer le milieu de l’EPR : Supplément moyen N1 1/100 (v/v), glutamine 1/100 (v/v), pénicilline-streptomycine 1/100 (v/v) et solution d’acides aminés non essentiels 1/100 (v/v), hydrocortisone (20 μg/L), taurine (250 mg/L) et triiodo-thyronin (0,013 μg/L) en alpha MEM + 5% FBS ou sans FBS^1,23,24. Si vous le souhaitez, FBS peut être inactivé par la chaleur; aucune différence n’a été observée. Préparez-vous frais pour l’isolement rpe. Pour l’entretien de la culture cellulaire, conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
   6. Préparer trypsine-EDTA: Préparer de petits aliquots à usage unique (~8 mL) de trypsine-EDTA frais (0,25%) et les congeler à -20 oC. Décongelez-les à RT avant chaque utilisation. Évitez les cycles gel-dégel.
2. Préparer les inserts membranaires (p. ex., inserts Transwell).
   1. Equilibrez les inserts membranaires de 6,5 mm avec milieu RPE pendant au moins 30 min à 37 °C, dans un incubateur aéré de 5 % de CO_2. Utilisez un insert membrane pour ensemencer les cellules RPE de deux yeux de souris.
   2. Après l’incubation, remplacer le milieu du compartiment inférieur par 700 μL de PBS.
   3. Retirer le milieu du compartiment supérieur et enduire l’insert membrane de 100 μL de laminine de souris de 10 μg/mL (en PBS) pendant au moins 2 h à RT (des incubations plus courtes peuvent entraîner un faible attachement des cellules à l’insert).
   4. Enduire un insert membrane supplémentaire à utiliser comme blanc pour les mesures TER.

2. Dissection et enucleation des yeux de souris

1. Euthanasier les souris par asphyxie au CO₂ en les plaçant dans une chambre de CO₂ et en libérant lentement du CO₂ à un taux de remplissage de 30 à 70 % du volume de la chambre par minute.
2. Placez les pointes inclinées et dentelés des micro-forceps de chaque côté de l’œil de la souris et appuyez doucement pour proptose le globe oculaire (enucleation).
3. Fermez les forceps placés autour du globe oculaire. Puis, tirez doucement tout en se déplaçant vers l’avant et vers l’arrière pour détacher l’œil entier avec le nerf optique des muscles oculaires, en veillant à ce qu’aucun tissu conjonctif reste attaché à la sclère.
4. Rincer le globe oculaire enucilé dans 70 % d’éthanol avant de le placer dans un puits d’une assiette de six puits avec 3 mL de HBSS-H− sur la glace.
5. Répétez les étapes 2.2 à 2.4 pour enlever le deuxième œil de la souris. Procéder aux prochaines étapes dans les 30 minutes.
   REMARQUE : Il est recommandé d’enduler/disséquer seulement deux yeux à la fois jusqu’à ce qu’une certaine expérience soit acquise.

3. Collection de l’EPR

REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes dans des conditions stériles dans un capot d’écoulement laminaire. Pour éviter des incubations prolongées sur la glace, qui peuvent entraîner la mort des cellules de l’EPR, ne recueillez pas plus de deux yeux à la fois.

1. Utilisez un stéréomicroscope disséquant, des forceps Dumont #5 et des ciseaux inclinés pour nettoyer soigneusement tout le tissu conjonctif, le sang et les muscles restant attachés au globe oculaire sans faire de coupures dans la sclère. Modifiez régulièrement les 3 mL de tampon HBSS-H−H−, au besoin, pour garder l’œil frais et propre, et éviter la contamination des cultures d’EPR.
2. Utilisez le nerf optique comme poignée pour tenir le globe oculaire et faire un trou au centre de la cornée avec une lame de #11 carbone.
3. Utilisez les #5 Dumont pour faire trois incisions dans la cornée à travers le trou susmentionné, en veillant à ce qu’il y ait suffisamment d’espace pour enlever la lentille.
4. Maintenez le nerf optique et appliquez une légère pression sur l’ora serrata avec la base des ciseaux inclinés jusqu’à ce que la lentille sorte complètement. Laissez l’épithélium de l’iris en place pour empêcher le décollement de la rétine neurale et de l’EPR pendant l’incubation. Placez l’œil dans hbss-H-buffer.
5. Répétez les étapes 3.1-3.4 pour disséquer le deuxième œil.
6. Incuber les yeux sans lentilles dans la solution hyaluronidase dans une plaque de 12 puits à 37 °C pendant 45 min dans un incubateur aéré de CO 2 à₅% (1,5 mL/puits) pour détacher la rétine neurale de l’EPR.
7. Placez chaque œil dans un nouveau puits et incubez-le sur la glace pendant 30 min avec 1,5 mL de tampon HBSS-H+ froid par puits pour arrêter l’activité hyaluronidase. Ne prolongez pas l’incubation pendant plus de 45 min.
8. Lavez et placez chaque œil dans un plat de culture de 35 mm avec un tampon HBSS-H+ frais et coupez la cornée à travers les incisions d’origine jusqu’à atteindre l’ora serrata à l’aide de ciseaux Vannas de 8 cm. Ensuite, coupez en dessous de l’ora serrata pour enlever l’épithélium de l’iris et la cornée.
9. Tenez le bord de la coupe oculaire/ora serrata avec des pinces incurvées et, à l’aide de microforceps inclinés, retirez la rétine neurale en vous assurant que la couche RPE n’est pas coupée. Ensuite, coupez l’attachement interne au nerf optique. Si certaines cellules RPE restent attachées à la rétine neurale, prolongez le temps d’incubation mais ne dépassent pas 45 min au total.
10. Couper le nerf optique et transférer chaque oculaire dans une plaque différente de 12 puits contenant 1,5 mL de trypsine-EDTA frais par puits. Assurez-vous que les oculaires restent ouverts et complètement immergés dans la trypsine. Incuber les cils à 37 °C pendant 45 min dans un incubateur de CO_{2 à 5} %.
11. Recueillir chaque oculaire avec toutes les feuilles rpe détachées pendant l’incubation de la trypsine et les transférer dans une plaque de 12 puits contenant 1,5 mL de solution FBS par puits. Si les feuilles RPE restent dans la solution trypsine, utilisez une micropipette pour les transférer au puits avec la solution FBS.

4. Isolement des cellules primaires de RPE de souris

1. Tenez chaque oculaire par le nerf optique et secouez-le face vers le bas dans la plaque de 12 puits contenant 1,5 mL de 20% de FBS dans HBSS-H+ jusqu’à ce que le détachement complet des feuilles rpe soit atteint.
2. Recueillir les feuilles rpe et les grappes RPE avec une micropipette et les placer dans un tube de 15 mL. Évitez les morceaux blancs de scléra ou de choroïde, qui pourraient contaminer les cultures. Mettre en commun deux yeux de la même souris dans un tube.
3. Centrifuger le mélange à 340 x g pendant 2 min à RT et jeter le supernatant.
4. Resuspendez doucement la pastille RPE dans 1 mL de trypsine-EDTA (0,25%) et incuber le mélange pendant 1 min dans un bain d’eau à 37 °C pour désaggréger les feuilles d’EPR en cellules individuelles. Après l’incubation, pipet doucement de haut en bas 10x avec une micropipette, en évitant la formation de bulles tout en pipetting.
5. Ajouter 9 mL de milieu RPE fraîchement préparé pour diluer et inactiver la trypsine et centrifugeuse le mélange à 340 x g pendant 2 min à RT.
6. Aspirer le supernatant et resuspendre soigneusement la pastille cellulaire dans 150 μL de milieu RPE avec 5% de FBS à l’aide d’une micropipette, en veillant à ce que les cellules sont homogènement résuspendus et en évitant la formation de bulles pendant le pipetage.
7. Prenez l’insert membrane recouverte de laminine de l’étape 1.2, retirez le PBS de la chambre inférieure et ajoutez 700 μL de milieu RPE.
8. Retirer la laminine de la chambre haute de l’insertion membranaire et distribuer la suspension cellulaire RPE dans le sens de la goutte et uniformément au centre de la chambre, en évitant la formation de bulles pendant le pipetage.
9. Placer l’insert membrane dans un incubateur de CO_{2 à} 5% à 37 °C et laisser intact pendant au moins 24 h.
10. Après 24 h, vérifiez l’insertion membranaire au microscope pour vous assurer que la plupart des cellules RPE sont fixées à l’insert et que la confluence est d’au moins 50 %(figure 1A). Il est essentiel de ne pas changer de média pendant les 72 premières heures.

5. Culture des monomères polarisés rpe

1. Maintenir les cellules RPE isolées en culture pendant au moins 72 h avant de rafraîchir le milieu de l’EPR pour permettre l’attachement cellulaire. Une confluence cellulaire de 50 % ou plus à l’ensemencement est fondamentale pour la formation d’un monocouche RPE polarisé approprié.
2. Modifiez le milieu de culture deux fois par semaine à l’aide d’un milieu d’EPR frais et préchauffé (étape 1.1.5) après l’attache des cellules. Le sérum peut être retiré du milieu de culture après les 72 premières h.
   REMARQUE : Après une semaine de culture, les cellules devraient être confluentes, hexagonales, binucléées, pigmentées et polarisées (figure 1B), les nombres de cellules prévus étant d’environ 50 000 cellules par insert Transwell de 6,5 mm. Après deux semaines dans la culture, des monomères de RPE comprenant des cellules saines sont observés. Les cultures RPE présentent des microvilli apiques, des infoldings basaux et des jonctions serrées (Figure 1C).

6. Mesure TER

REMARQUE : Effectuer des mesures TER des cellules RPE après un minimum de 4 jours en culture afin d’assurer une bonne intégrité et une polarisation du monocouche RPE.

1. Nettoyez les électrodes du voltohmmètre avec 70% d’éthanol et séchez-les soigneusement.
2. Prenez les transwells de l’incubateur et effectuez la mesure TER dans les 3 minutes pour éviter les modifications dues aux fluctuations de température. Pour mesurer les TER, immerger l’électrode courte du voltohmmètre dans la chambre haute et la longue électrode dans la chambre inférieure de l’insert membrane. Évitez tout contact avec le monocouche RPE pour éviter le décollement cellulaire.
3. Pour calculer les TER, déduire de l’échantillon la valeur du blanc (insert membrane recouverte de laminine sans cellules). Ensuite, multipliez la valeur obtenue (en ohms) par la surface de l’insert membrane (0,33 cm² dans le cas d’un insert membranaire de 6,5 mm). Le produit doit être d’au moins 200 Ω x cm² après 72 h en culture. Les valeurs TER devraient mesurer au-dessus de 400 Ω x cm² après deux semaines. Rejetez les cultures RPE à faible valeur TER.

Résultats

Ce protocole a été utilisé pour isoler et culturer les cellules RPE des souris génétiquement modifiées¹. Aucune différence n’a été observée entre les souches de souris ou le sexe. Les résultats ont aidé à comprendre certains aspects importants du mécanisme sous-jacent aux maladies oculaires telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, qui est la cause la plus fréquente de perte de vision chez les^{personnes âgées 9}. Les cellules de RPE isol?...

Discussion

Alors que plusieurs méthodes d’isolement cellulaire et de culture de l’EPR de souris avaient été^{développées avant 1,13,20,22,26,27}, la méthode fernandez-Godino a d’abord utilisé des inserts membranaires permettant la croissance efficace des cellules RPE en culture pendant les semaines¹

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable	BD Biosciences	309604
15 ml centrifuge tube	VWR International	21008-103
50 ml centrifuge tube	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Angled micro forceps	WPI	501727
Bench-top centrifuge	any
CO2 incubator	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope	Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length	WPI	14101
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm	BD Biosciences	353001
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Laminar flow hood	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long	WPI	503216
Non-essential amino acids 100X	Gibco	11140050
N1 Supplement 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Tissue culture treated 12-well plates	Fisher-Scientific	08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell supports 6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size	Fisher-Scientific	6780-2504