温虚血/再灌流損傷のラット肺移植モデル:転帰を改善するための最適化

要約

ここでは、転帰の改善に役立つラット肺移植モデルの最適化を提示します。体重に基づくカフのサイズガイド、4^番目の 肋間腔を確認するための測定戦略、創傷閉鎖とBAL(気管支肺胞洗浄)液および組織の収集方法を提供します。

要約

ラット肺移植の経験から、改善すべきいくつかの領域が見つかりました。肺静脈(PV)、肺動脈(PA)、気管支(Br)の適切なカフサイズを選択する方法に関する既存の文献の情報はさまざまであるため、ラット肺移植中の適切なカフサイズの決定は試行錯誤の練習になります。血管や気管支のサイズに適した最小の効果的なカフを使用するようにカフ技術を標準化することにより、移植手順をより安全に、より速く、より成功させることができます。PV、PA、Brの直径はラットの体重に関連しているため、体重ベースのガイドを使用して適切なサイズを選択するための戦略を提示します。肺容量は体重にも関係しているため、温虚血中のドナー肺膨張の適切な空気量、および気管支肺胞洗浄(BAL)液採取中に点滴されるPBSの適切な量を選択する際にも、この関係を考慮することをお勧めします。また、4^番目の 肋間腔解離、創傷閉鎖、およびネイティブローブと移植ローブの両方からのサンプル収集の方法についても説明します。

概要

30年以上にわたり、研究者はラット肺移植モデルを修正および改善して、生成されたデータがより一貫性があり、実際の臨床状態をより反映するようにしてきました。このモデルを実行する私たちの研究室では、吻合のためのカフ技術、レシピエントの4^番目の 肋間腔の特定、レシピエントの手順中の肺の膨張と創傷閉鎖、および分析のためのサンプルの採取の4つの改善領域を決定しました。

吻合のためのカフ技術の修正は、ドナー肺1,2,3,4,5,6の取り扱い時間を短縮し、吻合手順をマイクロ外科医にとってより速く、技術的に容易にすることにより、移植手順全体を改善できます。移植された肺に必要な血液と気流を供給するために適切なサイズのカフを使用することが重要ですが、肺静脈(PV)、肺動脈(PA)、または気管支(Br)のカフのサイズを選択する方法に関するガイダンスは限られています5,7,8,9。PV、PA、およびBrの直径はドナーおよびレシピエントラットの体重に関連しているため、カフのサイズは体重に基づくことを提案します。このレポートは、移植された肺への血液と空気の供給を最適化するのに役立つラットの体重(180 gから270 g以上)に基づくカフのサイズガイドを提供します(表1)。

新しいマイクロ外科医は、ドナーの手順中にドナーの肺を正常に簡単に調達できますが、レシピエントの手順中に肺を移植することはより複雑であり、マイクロサージャスターの経験に依存します。レシピエントの左肺にアクセスするための4^番目の肋間腔を見つける試みは、ある程度の主観を保持し、手順時間を増加させる可能性のあるより困難なステップの1つです。そこで、胸部測定と心臓の動悸を用いて、^{4,5,6,10,11,12}を解剖する正しい胸壁領域を見つけることにより、^4番目の肋間腔の位置の特定を支援する簡単で客観的な方法を紹介します。

また、臓器の損傷の原因となる可能性のあるドナー肺の膨張の改善を提案します。ドナー肺は、再灌流が始まるまで収縮します。4^番目の肋間腔を縫合している間、ドナー肺は、PEEPを2cmH2Oから_6cmH2Oに増加させることによって一般的に膨張する。過膨張による肺損傷を最小限に抑えるために、単純な二重結び目で5^番目の肋骨よりも下の4^番目の肋骨の周りに3つの6-0ナイロン縫合糸を配置する技術を提案する。創傷閉鎖の時間になると、3つの縫合糸の端部を両手で止血剤で保持し、両側を引き上げて創傷を一度に閉じ、PEEPを直ちに_2cmH2Oに縮小する。このようにして、肺は可能な限り短い時間拡張することができます¹⁰。

実験の終わりに、研究者はしばしば各移植からの多くの種類の分析のために多くの種類のサンプルを収集したいと考えています。たとえば、スナップ凍結組織、ホルマリン固定組織、肺水腫を決定するための湿潤重量比に対する組織、および気管支肺ベラ洗浄(BAL)液はすべて、移植がどれだけうまくいったかを評価するために使用できます。BAL流体を収集する従来の方法では、レシピエントのネイティブローブとドナーの移植ローブの両方から混合プールサンプルが可能になります¹³、^14、15。これを克服するために、移植された肺とネイティブの肺の状態をより正確に把握できる肺門領域をクランプする方法を提示します。さらに、BAL液には濃度で測定されるサイトカインやケモカインなどの多数の可溶性因子が含まれているため、肺の両側からBAL液を収集するために使用されるPBSの量を考慮することが重要です。点滴された液体の量を肺活量の推定量に正規化すると、比較に役立ちます。右側に4つの葉があり、左側に1つの葉があり、ラットの5つの葉のそれぞれは、異なる体積と表面積^{を持っています16}。Backerらによる肺葉の体積測定に関する以前の研究によると、肺全体の総体積のうち、右葉の体積は63%(4400 mm³)であり、左葉は37%(2500 mm³)です。したがって、BAL液の収集に使用されるPBSの量は、一回換気量(7.2 mL / kg)の2倍に右肺で63%、左肺で37%を掛けて計算することをお勧めします。このアプローチを使用することにより、体重やタイミング^10,16などの変数をより適切に制御できます。

全体として、このレポートでは、ラット肺移植の標準実験モデルにいくつかの変更を加えて、手順をより効率的にし、各実験からより正確で豊富なデータを生成する能力を高めることを示します。

プロトコル

雄のSprague-Dawleyラット(体重180〜270 g)を商業的に購入し(例えば、Envigo)、オハイオ州立大学動物施設で病原体のない条件下で飼育した。すべての手順は、NIHおよび実験動物の人道的ケアと使用のための国立研究評議会のガイドに従って、オハイオ州立大学施設動物管理および使用委員会(IACUCプロトコル#2012A00000135-R2)の承認を得て人道的に実行されました。

1. 初期設定

1. 手術用デバイスをセットアップします。
   注:これは非生存手術です。生存手術を行う場合は、滅菌器具とバリア予防措置を講じる必要があります。
   1. 心拍数/酸素飽和度モニタリング装置と加温ボードの電源を入れて42°Cにします。
   2. 換気および麻酔器の電源を入れて、イソフルラン蒸発器を予熱します。
      注意: 7.2 mL / kgの潮汐体積(Td)、2 cmH₂Oの正端呼気圧(PEEP)、および80bpmの呼吸数を使用してください。
   3. 麻酔シリンジに10 mLの液体イソフルランを満たし、シリンジを換気および麻酔器に取り付けます。
   4. マイクロ外科医の好みに合わせて高さと焦点を調整した状態で、手術用顕微鏡の電源を入れます。
   5. 電気焼灼装置の電源を入れます。
2. 手術器具を準備してレイアウトします(図1)。
   注:すべての手術器具を121°Cで30分間オートクレーブ滅菌しました。
3. ドナーラットとレシピエントラットの体重を収集して記録します。
4. 表1とラットの体重を使用して、カフの作成に使用する血管カテーテルの正しいゲージ(20、18、16 14、または12 G)を決定します。
5. 体重に基づくサイズガイドを使用して、肺動脈(PA)、気管支(Br)、および肺静脈(PV)のカフを準備します(表1 および 図2)。
   1. サイズ20 G、18 G、16 G、14 G、または12 Gのサイズの血管カテーテル(図2A-E)を手術用顕微鏡下の滅菌面に置きます。
   2. 次に、リブバック手術用ブレード#11(図2F)を使用して血管カテーテルを90°の角度で切断し、カフ本体の上部に1 mm X 1 mmのタブ(幅x高さ)を備えた長さ2 mmのカフ本体を形成します(図2G)。
   3. 使用する準備ができるまで、カフを滅菌生理食塩水に保管してください。
6. ソリューションを準備します。
   1. 1 mLのキシラジン(100 mg / mL)を10 mLのケタミン(100 mg / mL)に加えて、滅菌注射バイアルでケタミンとキシラジンの混合物を調製します。.
      注意: このカクテルの有効期限は 、使用される成分の最も早い有効期限を使用して決定されます。
   2. ラットの適切な投与量を注射器に入れます(ラットの体重100 gあたり0.1 mLのケタミン/キシラジン混合物;たとえば、200 gのラットの場合、0.2 mLのケタミン/キシラジン混合物が送達されます)。.
      注:この投与量は、91 mg / kgのケタミンと9.1 mg / kgのキシラジンをラットに送達し、ラットを60〜80分間鎮静させておく必要があります。.
   3. 1,000 U / kgの用量で送達されるヘパリンを準備します。
   4. 生理食塩水、PBS、および保存液を氷上に保管します(材料表)。

2.ドナーラットの準備

1. ケタミンとキシラジンの混合物を腹腔内注射し、つま先のつまみに対する反応の欠如によって評価できる麻酔の手術面が発達するのを~10分待つことにより、ドナーラットに麻酔を誘発します。.
2. 電子バリカンを使用して切開部を剃ります。
3. ドナーラットを外科用加温ボード上の仰臥位に置き、ベタジンを染み込ませた滅菌ガーゼで切開部を拭きます。次に、70%イソプロピルアルコール綿棒でその領域を拭きます。3回繰り返します。
4. ハサミを使用して首の中央に3〜4 cmの正中線皮膚切開を行い、鉗子を使用して皮下組織と筋肉を注意深く解剖します(出血を避けるためにハサミの代わりに)。
5. 気管内挿管の場合は、気管の周りに4-0シルク縫合糸を通し、16 G血管カテーテルを気管に挿入します。気管の周りの縫合糸をダブルノットでしっかりと結び、次にシングルノットで仕上げて血管カテーテルを所定の位置に保持します。
6. 血管カテーテルを人工呼吸器に接続し、1〜2%のイソフルランでラットの麻酔の手術面を維持する。
7. ハサミを使用して正中切開と横切開を組み合わせた開腹胸骨術を行います。
8. 下大静脈(IVC)を介してインスリン注射器でヘパリン(1,000 U / kg)を注射し、全身循環のために10分待ちます。
   注:このヘパリンの投与は、ドナー肺の血栓を防ぎます。
9. 胸部アーチに沿って切断して横隔膜を慎重に解剖し、胸骨を首までたどって胸腔を露出させます。

3.ドナー肺温虚血と調達

1. IVCを切断してドナーラットを安楽死させる。
2. 肺がまだ換気されている間に、チューブに接続された重力によって28 cmH₂Oでぶら下がっているシリンジと肺動脈から直接導入される18G血管カテーテルで、マイクロ解剖スプリングハサミと重力フラッシュ肺で左右の耳介の両方を切り取ります。
3. 人工呼吸器を気管内チューブから外し、体重に基づいて適切な量の空気で満たされた5mLシリンジに接続します。
   注:肺を膨らませる空気の量は、一回換気量の2倍(Td = 7.2 mL / kg)と同様に計算できます、たとえば、200 gのラットのTdは1.44 mLで、それに2を掛けると、肺を膨らませるのに必要な空気の2.88 mLに相当します。
4. ドナーの肺を膨らませます。
5. 肺を膨らませるために気管にヤサルギルクランプを置き、肺と心臓を滅菌綿ガーゼで覆います。ガーゼを生理食塩水で保湿し、ドナーラットをアンダーパッドで包み、加温手術台の上に1時間放置して、肺に温かい虚血を誘発します(図3)。
6. 温かい虚血の1時間後、微小解剖スプリングハサミと鉗子で心肺ブロックを切除し、氷上の滅菌ペトリ皿の上に氷冷PBSで湿らせた滅菌ガーゼの上に置きます。
   注意: 次の手順はすべて、肺が氷上のペトリ皿にあるときに実行する必要があります。
7. 肺靭帯をマイクロ解剖スプリングハサミで慎重に切開し、左肺を食道および騎兵葉後葉から分離します。
8. バンナス-テュービンゲンスプリングシザーで左肺肺門領域を慎重にトリミングし、左PV、PA、およびBrを調達します。
9. PV、PA、またはBrにカフを配置します(図4A-C)。
   1. 蚊止血剤を使用してカフタブをつかみます。
   2. 細かい鉗子を使用して、PV、PA、またはBrの遠位端を適切なカフ本体からつかみ、カフの周りの余分な組織をエバートし、8-0を使用して固定しますナイロン縫合糸。Vannas-Tubingenスプリングはさみを使用して、余分な組織とカフ本体の周りのカフをトリミングします。
10. ドナーの肺をガーゼで覆い、氷上のペトリ皿に氷上のペトリ皿に載せて、レシピエントラットに移植する準備ができるまで保ちます(図4D)。
    注:平均寒冷虚血時間は84分±11分SDです。

4.レシピエントラットの準備

1. ケタミンとキシラジンの混合物(ラット100 gあたり0.1 mL)を腹腔内注射し、つま先のつまみに対する反応の欠如によって評価できる麻酔の手術面が発達するのを10分間待つことにより、ドナーラットと同じ方法でレシピエントラットに麻酔を誘発します。
2. 電子バリカンを使用して切開部を剃ります。
3. ドナーラットを仰臥位に置き、ベタジンを染み込ませた滅菌ガーゼで切開部を拭きます。次に、70%イソプロピルアルコール綿棒でその領域を拭きます。3回繰り返します。
4. ラットを換気装置に固定する前に、4^番目の 肋間腔を見つける準備としてラットの胸に線を引きます。
   1. 胸骨上ノッチから剣状突起までの胸部を測定し、線を引きます(図5A)。
   2. この線の中央に、胸骨上ノッチから剣状突起までの測定値の半分を測定する胸部の左側に沿って線を引きます(図5AおよびB)。
5. 気管内挿管キットからのLEDライトに接続された光ファイバーケーブルを使用した視覚化を介して、16G血管カテーテルを使用してレシピエントに挿管します。
6. 血管カテーテルを人工呼吸器に接続し、1〜2%イソフルランで麻酔の手術面を維持します。
7. 4^番目の 肋間腔を見つけるには、強い触知可能な心臓インパルスを感じることができる胸壁の領域を見つけます(図5C、赤い円)。
8. この場所で、はさみで皮膚を切開し、マイクロ解剖スプリングハサミで筋肉を切開し、開創器を使用して4^番目の肋間腔をできるだけ広く開きます(図5DおよびE)。
   注意: 筋肉解剖中の出血を回避または停止するために、電気焼灼を使用してください。
9. 肋間腔が大きく開いたら、Vannas-Tubingenスプリングハサミを使用してレシピエントの左肺の周りの靭帯を注意深く解剖し、滅菌綿棒と鉗子を使用して胸部から肺を引き抜きます。
10. 左肺の周りに滅菌ガーゼを置き、ディーフェンバッハブルドッグクランプでそれを保持します。
11. 左肺肺門領域にヤサルギルクランプをできるだけ近位に適用します。

5.吻合

1. 肺静脈(PV)吻合
   1. 受取人のPVの周りに7-0ナイロン縫合糸を置きます。
   2. Vannas-Tubingenスプリングハサミを使用して、上部と下部のセグメント静脈をできるだけ遠位に切断してレシピエントのPVを切開し、インスリン注射器を使用して0.2 mLのヘパリン化生理食塩水(1 U / mL)で血液を洗い流します。
   3. 氷のように冷たい湿った滅菌ガーゼで包んだままのドナー肺を胸腔に入れます。
   4. ドナーのカフ付きPVをレシピエントのPVに挿入し、事前に配置された7-0ナイロン縫合糸で固定します(図6)。
2. 気管支(Br)吻合
   1. レシピエントのBrの周りに7-0ナイロン縫合糸を配置します。
   2. Vannas-Tubingenスプリングはさみで上部と下部のセグメント気道をできるだけ遠位に切断することにより、レシピエントのBrを切開します。
   3. ドナーのカフ付きBrをレシピエントのBrに挿入し、事前に配置された7-0ナイロン縫合糸で固定します(図6)。
3. 肺動脈(PA)吻合:
   1. 受信者のPAの周りに7-0ナイロン縫合糸を配置します。
   2. レシピエントのPAを外膜シースから切開し、血管の周囲の半分をバンナス・テュービンゲンスプリングハサミで切開し、インスリン注射器を使用して0.2 mLのヘパリン化生理食塩水(1 U / mL)でPAの血液を洗い流します。
   3. ドナーのカフ付きPAをレシピエントのPAに挿入し、事前に配置された7-0ナイロン縫合糸で固定します(図6)。

6.再灌流

1. 移植されたドナー肺の再灌流と換気を可能にするために、肺門のヤサルギルクランプを取り外します(図7)。
2. マイクロ解剖スプリングハサミと鉗子を使用して、レシピエントのネイティブ左肺を解剖します。
3. 移植した左肺をレシピエントの胸部に慎重に再配置します。
4. 6-0ナイロン縫合糸を使用して開胸部切開を閉じます。
   1. 4^番目の 肋骨より上、5^番目の 肋骨より下の肋骨の周りに、単純な二重結び目を持つ3つの6-0ナイロン縫合糸を配置します(図8A)。
   2. 止血剤を使用して、3つの縫合糸を一緒に集めます(図8B)。
   3. 換気設定でPEEPを6 cmH₂Oに増やします。
   4. 傷を閉じるために引き離して、3つの結び目すべてを同時に結びます(図8C)。
   5. PEEPをすぐに2 cmH₂Oに減らします。
   6. 6-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。
      注:私たちの研究室は移植後の急性期を研究しているため、このモデルのレシピエントラットは、換気と麻酔下で移植後3時間生存し、その後サンプルを収集します。

7. 実験検体(血漿、肺組織)の採取

1. 対照サンプルの場合、3時間の再灌流期間が開始された後にドナーの右葉を収集します。
   1. タンパク質またはRNA発現分析のために上葉と後雌豚葉をスナップフリーズし、組織学のために中葉を保存し、湿潤重量比と乾燥重量比に下葉を使用します(図9A)。
2. 3時間の再灌流時間が終了する10分前に、インスリン注射器でヘパリン(1,000 U / kg)を頸静脈に注射することにより、レシピエントサンプルを採取する準備をします。
   注:このヘパリンの投与は、肺の血栓を防ぎ、調達時のより徹底的な紅潮を可能にします。
3. プラズマ収集
   1. 3時間の再灌流期間の終わりに、IVCを介して注射器で1mLの血液を採取します。
   2. 氷上に保管し、2,000 x gで10分間遠心分離して血漿を回収します。
4. 放血を可能にするためにIVCを切断することにより、レシピエントラットを安楽死させます。
5. 胸部アーチに沿って横隔膜を解剖し、胸郭を解剖して胸腔を露出させます。
6. 必要に応じて、ネイティブまたは移植された肺からBAL液を収集します(オプション)。
   注意: 肺で湿式と乾燥時の重量比または組織学が行われている場合は、結果に影響を与える可能性があるため、BAL液の採取は実行しないでください。
   1. 気管の周りに4-0シルク縫合糸を通し、気管と挿管チューブの周りにタイトな二重結び目を結び、液体の漏れを防ぎます。
   2. 右葉と左葉からBAL液採取用の氷冷PBSの量を計算します。
      注意: 右肺の体積比は63%で、左肺の体積比は37%^です16。したがって、両側に注入するPBSの量を決定するには、体積を一回換気量(Td = 7.2 mL / kg)の2倍に右肺で63%、左肺で37%を掛けて計算する必要があります。
   3. 左肺肺門部にヤサルギルクランプを配置し(図10A)、血管カテーテルに接続された注射器を使用して、計算された量の氷冷PBSを右肺(レシピエントのネイティブローブ)に注入し、シリンジプランジャーを静かに引き上げてBAL液を採取します。2回実行します。
      注:点滴された液体の70〜80%の回復を期待する必要があります。
   4. 左肺のヤサルギルクランプを取り外し、右肺肺門領域にクランプを配置します(図10B)。
   5. 右葉と同じ方法で移植された左葉からBAL液を採取し、右肺門部のクランプを取り外します。
7. チューブに取り付けられた18 G血管カテーテルと28 cmH₂Oにぶら下がっている20 mLのプレチルド保存液を含むシリンジを使用して、マイクロ解剖スプリングハサミで左右の耳介を切断し、PAを介して重力で肺をフラッシュします。
8. レシピエントの肺からサンプルを収集します。
   1. タンパク質またはRNA発現分析のために上葉と騎兵後葉をスナップフリーズし、組織学のために中葉を保存し、湿潤重量比と乾燥重量比に下葉を使用します)(図9A)。
   2. 左移植した左葉を3つの部分に分けます:スナップ凍結のために収集された上部領域、組織学のための中央領域、および湿潤対乾燥重量比のための下部領域(図9B)。

結果

肺水腫を測定するために、湿潤対乾燥重量比を計算した。ドナーの在来葉、移植葉、およびレシピエントの在来葉をプロトコルに記載されているように収集し、湿重量について直ちに秤量し、60°Cで48時間乾燥させた後、乾燥重量について再度秤量した。湿潤重量比と乾燥重量比の増加は、肺水腫を示しています。.私たちの結果は、移植された葉は、ドナーまたはレシピ...

ディスカッション

このレポートでは、手順を最適化するために、ラット肺移植プロトコルのいくつかの重要なステップに介入しました。ラット肺移植のための様々なカフ技術が報告されているが1、²、³、⁴、⁵、⁶、^7、8、⁹、¹⁵、このプロセスは...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Gauge angio-catheter	BD	382277
14 Gauge angio-catheter	B. Braun	4251717-02
16 Gauge angio-catheter	B. Braun	4252586-02
18 Gauge angio-catheter	B. Braun	4251679-02
20 Gauge angio-catheter	B. Braun	4252527-02
4-0 silk suture	Surgical Specialties Corp.	SP116
6-0 nylon suture	AD Surgical	S-N618R13
7-0 nylon suture	AD Surgical	S-N718SP13
8-0 nylon suture	AD Surgical	XXS-N807T6
Betadine Spray	Avrio Health L.P	UPC 367618160039
Clippers	VWR	MSPP-023326
Castroviejo micro dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument Co	RS-5668
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Electrocautery	Macan	MV-7A
Endotracheal intubation kit	Kent Scientific	ETI-MSE
Forceps	Fine Science Tools	11027-12
Halsted-mosquito hemostat	Roboz Surgical Instrument Co	RS-7112
Heparin	Fresnius Medical Care	C504701
Insulin syringe	Life Technologies	B328446
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Isopropyl Alcohol Swabs	BD	326895
Ketamine	Hikma Pharmaceuticals PLC	NDC 0413-9505-10
Dieffenbach Bulldog Clamp	World Precision Instruments	WPI14117
Needle holder/Forceps, Curved	Micrins	MI1542
Needle holder/Forceps, Straight	Micrins	MI1540
Perfadex Plus (Organ Preservation Solution)	XVIVO Perfusion AB	REF# 19950
PhysioSuite	Kent Scientific	PS-MSTAT-RT	Used to check SpO2 and heartbeat
Retractor	Roboz Surgical Instrument Co	RS-6560
Saline	PP Pharmaceuticals LLC	NDC 63323-186-10
Scissors	Fine Science Tools	14090-11
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System	Kent Scientific	SS-MVG-Module
Sterile  Cotton Gauze Pad	Fisherbrand	22-415-469
Surgical Microscope	Leica	M500-N w/ OHS
Syringe 5mL	BD	309646
Vannas-Tubingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15008-08
Xylazine	Korn Pharmaceuticals Corp	NDC 59399-110-20
Yasargil Clamp	Aesculap, Inc	FT351T	Used to clamp bronchus
Yasargil Clamp	Aesculap, Inc	FT261T	Used to clamp hilum
Yasargil Clamp Applicator	Aesculap, Inc	FT484T