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本文内容

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  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
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  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里,我们提出了对大鼠肺移植模型的优化,以改善结果。我们提供基于体重的袖带尺寸指南、确定第 4 肋 间隙的测量策略以及伤口闭合和 BAL(支气管肺泡灌洗)液体和组织收集的方法。

摘要

根据我们在大鼠肺移植方面的经验,我们发现有几个需要改进的领域。现有文献中关于为肺静脉 (PV)、肺动脉 (PA) 或支气管 (Br) 选择合适的袖带尺寸的方法的信息各不相同,因此在大鼠肺移植期间确定适当的袖带尺寸是一项反复试验。通过标准化袖带技术以使用适合血管或支气管大小的最小有效袖带,可以使移植过程更安全、更快、更成功。由于PV,PA和Br的直径与大鼠的体重有关,因此我们提出了一种使用基于重量的指南选择合适的尺寸的策略。由于肺容量也与体重有关,我们建议在为温暖缺血期间供体肺充气选择合适的空气量以及在支气管肺泡灌洗(BAL)液体收集期间滴注适当体积的PBS时,也应考虑这种关系。我们还描述了第 4 间隙解剖、伤口闭合以及从天然和移植叶收集样本的方法。

引言

三十多年来,研究人员一直在修改和改进大鼠肺移植模型,以使生成的数据更加一致,更能反映实际临床状况。在我们实验室执行该模型的过程中,我们确定了四个改进领域:吻合的袖带技术,识别受体的第4肋间隙, 接受者手术过程中的肺充气和伤口闭合,以及收集样本进行分析。

吻合口的袖带技术修改可以通过缩短供体肺123456的处理时间并使显微外科医生的吻合手术更快技术上更容易来改善整个移植过程。虽然使用适当尺寸的袖带为移植肺提供必要的血液和气流至关重要,但关于如何为肺静脉 (PV)、肺动脉 (PA) 或支气管 (Br) 选择袖带尺寸的指导有限5,789由于PV,PA和Br的直径与供体和受体大鼠的体重有关,我们建议袖带尺寸基于体重。该报告根据大鼠的体重(180克至270克以上)提供了袖带的尺寸指南,用于优化移植肺的血液和空气供应(表1)。

虽然较新的显微外科医生可以在供体手术期间成功且轻松地获得供体肺,但在接受者的手术过程中移植肺更为复杂,并且取决于显微外科医生的经验。尝试找到第 4 个肋间隙以进入接受者的左肺是更困难的步骤之一,具有一定的主观性并可能增加手术时间。因此,我们介绍了一种简单客观的方法,通过胸部测量和心脏的心悸来辅助识别4肋间隙位置,以找到正确的胸壁区域来解剖45,6101112

我们还建议改善供体肺充气,这是器官损伤的潜在来源。供体肺放气,直到再灌注开始。在缝合第 4 个肋间隙时,供体肺通常通过将 PEEP 从 2 cmH 2 O 增加到 6 cmH2O 来充气。为了尽量减少过度充气造成的肺损伤,我们提出了一种技术,即在低于5肋的第4肋周围放置三个6-0尼龙缝合线,并带有简单的双结。当需要缝合伤口时,双手用止血器握住三条缝合线的末端,通过向两侧拉动伤口一次闭合,PEEP立即降低至2cmH2O。通过这种方式,允许肺在尽可能短的时间内扩张10

在实验结束时,研究人员通常希望从每次移植中收集多种类型的样本以进行多种类型的分析。例如,快速冷冻组织、福尔马林固定组织、用于确定肺水肿的干湿重量比的组织以及支气管软体灌洗液 (BAL) 都可用于评估移植进展。收集BAL液体的传统方法允许从受体的原生叶和供体的移植叶131415混合混合样本。为了克服这个问题,我们提出了一种夹住肺门区域的方法,该方法可以更精确地了解移植和天然肺的状况。此外,用于从肺部两侧收集BAL液的PBS体积很重要,因为BAL液含有许多可溶性因子,例如通过浓度测量的细胞因子和趋化因子。将输注的液体量与估计的肺活量恢复正常化有助于比较。右侧有四个裂片,左侧有一个裂片,大鼠的五个裂片中的每一个都有不同的体积和表面积16。根据Backer等人之前对肺叶体积测量的研究,在整个肺的总体积中,右叶的体积为63%(4400mm 3),左叶的体积为37%(2500mm3)。因此,我们建议用于收集BAL液体的PBS体积应计算为右肺潮气量(7.2mL/kg)乘以63%和左肺37%的两倍。通过使用这种方法,可以更好地控制体重和时间1016 等变量。

总之,在本报告中,我们将展示对大鼠肺移植标准实验模型的一些修改,这些修改可以使程序更有效,并提高从每个实验中生成更准确和更丰富的数据的能力。

研究方案

雄性Sprague-Dawley大鼠(体重180-270克)被商业购买(例如,Envigo),并在俄亥俄州立大学动物设施的无病原体条件下饲养。所有程序均根据NIH和国家研究委员会的实验动物人道护理和使用指南进行人道执行,并经俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会(IACUC协议#2012A00000135-R2)批准。

1. 初始设置

  1. 设置手术设备。
    注意:这是一项非生存性手术。如果要进行生存手术,则需要使用无菌器械和屏障预防措施。
    1. 打开心率/血氧饱和度监测设备和加热板至42°C。
    2. 打开通气麻醉机预热异氟醚蒸发器。
      注意:潮气量 (Td) 为 7.2 mL/kg,呼气末正压 (PEEP) 为 2 cmH2O,呼吸频率为 80 次/分。
    3. 用10mL液体异氟醚填充麻醉注射器,并将注射器安装到通气和麻醉机上。
    4. 打开手术显微镜,根据显微外科医生的喜好调整高度和焦点。
    5. 打开电烙设备。
  2. 准备并布置手术工具(图1)。
    注意:所有手术工具在121°C高压灭菌30分钟。
  3. 收集和记录供体和受体大鼠的体重。
  4. 使用 表1 和大鼠的体重来确定用于制作袖带的正确规格的血管导管(20,18,16 14或12G)。
  5. 使用基于体重的尺寸指南为肺动脉(PA),支气管(Br)和肺静脉(PV)准备袖带(表1图2)。
    1. 将尺寸为20 G,18 G,16 G,14 G或12 G的血管导管放在手术显微镜下的无菌表面上。
    2. 然后使用肋背手术刀片#11(图2F)以90°角切割血管导管,形成一个2毫米长的袖带主体,袖带主体顶部有一个1毫米X 1毫米的卡舌(宽x高)(图2G)。
    3. 将袖带存放在无菌盐水中,直到准备使用。
  6. 准备解决方案。
    1. 在无菌注射瓶中加入 1 mL 甲苯噻嗪 (100 mg/mL) 到 10 mL 氯胺酮 (100 mg/mL) 中制备氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物。
      注意:此鸡尾酒的有效期 是使用所用成分的最早到期日期确定的
    2. 将大鼠的适当剂量吸入注射器中(每100克大鼠体重0.1mL氯胺酮/甲苯噻嗪混合物;例如,对于200g大鼠,将输送0.2mL氯胺酮/甲苯噻嗪混合物)。
      注意:该剂量将向大鼠提供91mg / kg氯胺酮和9.1mg / kg甲苯噻嗪,并应使大鼠保持镇静60-80分钟。
    3. 准备肝素,将以 1,000 U/kg 的剂量给药。
    4. 将盐水,PBS和保存溶液储存在冰上(材料表)。

2.供体大鼠制备

  1. 通过腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪混合物并等待~10分钟以形成可以通过对脚趾捏缺乏反应来评估的麻醉手术平面,从而诱导供体大鼠的麻醉。
  2. 使用电子剪刀剃除切口区域。
  3. 将供体大鼠置于手术加热板上的仰卧位置,并用浸有βdine的无菌纱布擦拭切口区域。然后用70%异丙醇棉签擦拭该区域。重复3次。
  4. 用剪刀在颈部中部做一个3至4厘米的中线皮肤切口,并用镊子(而不是剪刀)小心地解剖皮下组织和肌肉,以避免出血。
  5. 对于气管插管,在气管周围穿 4-0 丝缝线,并将 16 G 血管导管插入气管。用双结将缝合线紧紧地绑在气管周围,然后用一个单结结束,以将血管导管固定到位。
  6. 将血管导管连接到呼吸机,并用1-2%的异氟醚在大鼠中维持手术平面的麻醉。
  7. 使用剪刀将腹腔胸骨切开术作为中线和横向切口的组合。
  8. 通过下腔静脉(IVC)用胰岛素注射器注射肝素(1,000U / kg),并允许10分钟进行体循环。
    注意:这种肝素的给药可防止供体肺中的血栓。
  9. 沿着胸弓切开,仔细解剖横膈膜,然后沿着胸骨到颈部暴露胸腔。

三、供体肺暖缺血及采购

  1. 通过切割IVC对供体大鼠实施安乐死。
  2. 当肺仍在通气时,用微型解剖弹簧剪刀切割左右耳廓,并在悬挂在28 cmH2O的注射器中重力冲洗肺,通过重力连接到管道和直接通过肺动脉引入的18 G血管导管。
  3. 断开呼吸机与气管插管的连接,并将其连接到 5 mL 注射器,根据体重填充适量的空气。
    注意:充气肺部的空气体积可以计算为潮气量的两倍(Td = 7.2 mL / kg),例如,一只200克的大鼠的Td为1.44毫升,乘以2等于充气肺所需的2.88毫升空气。
  4. 给捐赠者的肺部充气。
  5. 在气管上放一个Yasargil夹子以保持肺部充气,并用无菌棉纱布覆盖肺部和心脏。用盐水润湿纱布,用垫子包裹供体大鼠,并在加热的手术板上放置1小时以诱导肺部温暖缺血(图3)。
  6. 温暖缺血1小时后,用微型解剖弹簧剪刀和镊子切除心肺阻滞,并放在用冰冷的PBS蘸有冰冷PBS的无菌纱布上,放在冰上的无菌培养皿上。
    注意:当肺部在冰上的培养皿上时,应进行以下所有步骤。
  7. 用微型解剖弹簧剪刀小心切开肺韧带,将左肺与食道和腔后叶分开。
  8. 用Vannas-Tubingen弹簧剪刀小心修剪左肺门区域,并采购左PV,PA和Br。
  9. 将袖带放在 PV、PA 或 Br 上(图 4A-C)。
    1. 使用蚊子止血器抓住袖带标签。
    2. 使用细镊子通过适当的袖带体抓住PV,PA或Br的远端,清除袖带周围的额外组织,并使用8-0固定尼龙缝合线。使用Vannas-Tubingen弹簧剪刀修剪袖口周围的额外组织和袖带。
  10. 在冰上的培养皿上用盐水蘸有纱布覆盖供体肺,直到准备好移植到受体大鼠中(图4D)。
    注意:平均冷缺血时间为 84 分钟± 11 分钟 S.D。

4.受体大鼠准备

  1. 通过腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪混合物(每100g大鼠0.1mL)并等待10分钟以与供体大鼠相同的方式诱导受体大鼠的麻醉,可以通过对脚趾捏缺乏反应来评估。
  2. 使用电子剪刀剃除切口区域。
  3. 将供体大鼠置于仰卧位,并用浸有倍他定的无菌纱布擦拭切口区域。然后用70%异丙醇棉签擦拭该区域。重复3次。
  4. 在将大鼠固定在通风机上之前,在大鼠的胸部画线,以准备找到第 4 个 肋间隙。
    1. 测量从胸骨上切口到剑突的胸部并画一条线(图5A)。
    2. 在这条线的中间,沿着胸部左侧画一条线,测量从胸骨上切口到剑突的一半测量值(图5A和B)。
  5. 使用连接到气管插管套件的 LED 灯的光纤电缆,通过可视化使用 16 G 血管导管对受体进行插管。
  6. 将血管导管连接到呼吸机,并用1-2%异氟醚维持手术平面麻醉。
  7. 要找到第 4 个 肋间隙,请找到可以感觉到强烈可触及心搏的胸壁区域(图 5C,红色圆圈)。
  8. 在这个位置,用剪刀切开皮肤,用微型解剖弹簧剪刀切开肌肉,并使用牵开器尽可能宽地打开第 4 个 肋间隙(图 5D 和 E)。
    注意:在肌肉解剖过程中使用电烧灼以避免或止血。
  9. 一旦肋间隙被大开,使用Vannas-Tubingen弹簧剪刀仔细解剖受者左肺周围的韧带,并使用无菌棉签和镊子将肺从胸部区域拉出。
  10. 将无菌纱布放在左肺周围,并用迪芬巴赫斗牛犬夹住它。
  11. 在左肺门区域尽可能近端应用Yasargil钳。

5. 吻合术

  1. 肺静脉 (PV) 吻合术
    1. 将 7-0 尼龙缝合线放在接受者的 PV 周围。
    2. 使用Vannas-Tubingen弹簧剪刀切开受体的PV,方法是尽可能远端横向切割上节段静脉和下段静脉,并使用胰岛素注射器用0.2mL肝素化盐水(1U / mL)冲洗血液。
    3. 将仍然用冰冷的湿无菌纱布包裹的供体肺放入胸腔中。
    4. 将捐赠者的袖带PV插入接受者的PV,然后用预先定位的7-0尼龙缝合线固定(图6)。
  2. 支气管 (Br) 吻合术
    1. 将 7-0 尼龙缝合线放在接受者的 Br 周围。
    2. 通过用Vannas-Tubingen弹簧剪刀尽可能远距离横向切割上段和下段气道来切开受者的Br。
    3. 将捐赠者的袖带Br插入受体的Br中,并用预先定位的7-0尼龙缝合线固定(图6)。
  3. 肺动脉 (PA) 吻合术:
    1. 将 7-0 尼龙缝合线放在接受者的 PA 周围。
    2. 从不定鞘切开受者的 PA,用 Vannas-Tubingen 弹簧剪刀切开血管周长的一半,然后使用胰岛素注射器用 0.2 mL 肝素化盐水 (1 U/mL) 冲洗出 PA 中的血液。
    3. 将供体的袖带 PA 插入接受者的 PA 中,并用预先定位的 7-0 尼龙缝合线固定(图 6)。

6. 再灌注

  1. 取下肺门上的Yasargil夹,以便对移植的供体肺进行再灌注和通气(图7)。
  2. 使用微型解剖弹簧剪刀和镊子解剖接受者的原生左肺。
  3. 小心地将移植的左肺重新定位到受者的胸部。
  4. 使用6-0尼龙缝合线关闭开胸切口。
    1. 在肋骨周围放置三个6-0尼龙缝合线,在肋骨上方为第4根,低于5肋骨图8A)。
    2. 使用止血器将三条缝合线聚集在一起(图8B)。
    3. 在通风设置中将PEEP增加到6 cmH2O。
    4. 通过拉开以闭合伤口,同时将所有三个结绑在一起(图8C)。
    5. 立即将 PEEP 降低至 2 cmH2O。
    6. 用6-0尼龙缝合线关闭皮肤。
      注意:我们的实验室研究移植后的急性期,因此该模型中的受体大鼠在通气和麻醉下在移植后存活3小时,然后收集样本。

7. 实验标本(血浆、肺组织)的采集

  1. 对于对照样品,在开始3小时再灌注期后收集供体的右叶。
    1. 快速冷冻上叶和腔后叶进行蛋白质或RNA表达分析,保留中叶进行组织学,并使用下叶进行干湿重量比(图9A)。
  2. 在3h再灌注时间结束前10分钟,准备通过将肝素(1,000U / kg)与胰岛素注射器注射到颈静脉中来收获受体样品。
    注意:这种肝素的给药可防止肺部血栓,并允许在采购时更彻底地冲洗。
  3. 血浆采集
    1. 在3小时再灌注期结束时,通过IVC用注射器收集1mL血液。
    2. 储存在冰上,然后以2,000×g离心10分钟以收获血浆。
  4. 通过切割IVC对受体大鼠实施安乐死,以允许放血。
  5. 沿胸弓解剖横膈膜,并通过解剖肋骨暴露胸腔。
  6. 如果需要,从天然或移植的肺中收集BAL液(可选)。
    注意:如果正在对肺进行干湿重量比或组织学检查,则不应进行BAL液体收集,因为它会影响结果。
    1. 将4-0丝线缝合在气管周围,并在气管和插管周围打一个紧密的双结,以防止液体泄漏。
    2. 计算从右叶和左叶收集BAL流体的冰冷PBS量。
      注意:右肺的体积比为63%,而左肺的体积比为37%16。因此,为了确定滴注到每侧的PBS量,应将容积计算为右肺潮气量(Td = 7.2 mL/kg)乘以63%和左肺37%的两倍。
    3. 将Yasargil夹在左肺门区域(图10A),并使用连接到血管导管的注射器,将计算量的冰冷PBS滴入右肺(受体的天然叶),并通过轻轻拉起注射器柱塞来收集BAL液。执行两次。
      注意:滴注液体的回收率为70-80%。
    4. 取下左肺上的Yasargil夹具,并将夹子放在右肺门区域(图10B)。
    5. 以与从右肺叶收集相同的方式从移植的左叶收集BAL液,然后取下右肺门区域的夹子。
  7. 用微型解剖弹簧剪刀切割左右耳廓,并使用连接到管路的 18 G 血管导管和带有 20 mL 预冷保存溶液的注射器在 28 cmH2O 下通过重力冲洗肺部。
  8. 从接受者的肺部收集样本。
    1. 快速冷冻上叶和腔后叶进行蛋白质或RNA表达分析,保留中叶进行组织学,并使用下叶进行干湿重量比)(图9A)。
    2. 将左移植的左叶分成三部分:收集的上部区域用于快速冷冻,中间区域用于组织学,下部区域用于干湿重量比(图9B)。

结果

为了测量肺水肿,计算湿与干重比。按照协议中的描述收集供体的原生叶,移植的叶和受体的天然叶,并立即称量湿重,在60°C干燥48小时,然后再次称量干重。湿重比增加提示肺水肿。我们的结果表明,与供体或受体的原生叶相比,移植叶的干湿重量比确实显着增加(p = 0.0050,n = 6 /组; 图 11)。

讨论

在本报告中,我们在大鼠肺移植方案中的几个关键步骤进行了干预,以优化程序。虽然已经报道了用于大鼠肺移植的各种袖带技术12345678915,但该过程仍然是主观的...

披露声明

BAW,YGL和JLK通过美国国立卫生研究院(NIH)拨款R01HL143000提供支持。BAW通过国防部(DOD)拨款W81XWH1810787提供支持。SMB通过NIH拨款R01DK123475提供支持。JM通过NIH拨款AR061385,AR070752,DK106394和AG056919以及国防部拨款W81XWH-18-1-0787提供支持。

致谢

没有。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
12 Gauge angio-catheterBD382277
14 Gauge angio-catheterB. Braun4251717-02
16 Gauge angio-catheterB. Braun4252586-02
18 Gauge angio-catheterB. Braun4251679-02
20 Gauge angio-catheterB. Braun4252527-02
4-0 silk sutureSurgical Specialties Corp.SP116
6-0 nylon sutureAD SurgicalS-N618R13
7-0 nylon sutureAD SurgicalS-N718SP13
8-0 nylon sutureAD SurgicalXXS-N807T6
Betadine SprayAvrio Health L.PUPC 367618160039
ClippersVWRMSPP-023326
Castroviejo micro dissecting spring scissorsRoboz Surgical Instrument CoRS-5668
Dumont #5 - Fine ForcepsFine Science Tools11254-20
ElectrocauteryMacanMV-7A
Endotracheal intubation kitKent ScientificETI-MSE
ForcepsFine Science Tools11027-12
Halsted-mosquito hemostatRoboz Surgical Instrument CoRS-7112
HeparinFresnius Medical CareC504701
Insulin syringeLife TechnologiesB328446
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-25
Isopropyl Alcohol SwabsBD326895
KetamineHikma Pharmaceuticals PLCNDC 0413-9505-10
Dieffenbach Bulldog ClampWorld Precision InstrumentsWPI14117
Needle holder/Forceps, CurvedMicrinsMI1542
Needle holder/Forceps, StraightMicrinsMI1540
Perfadex Plus (Organ Preservation Solution)XVIVO Perfusion ABREF# 19950
PhysioSuiteKent ScientificPS-MSTAT-RTUsed to check SpO2 and heartbeat
RetractorRoboz Surgical Instrument CoRS-6560
SalinePP Pharmaceuticals LLCNDC 63323-186-10
ScissorsFine Science Tools14090-11
SomnoSuite Small Animal Anesthesia SystemKent ScientificSS-MVG-Module
Sterile  Cotton Gauze PadFisherbrand22-415-469
Surgical MicroscopeLeicaM500-N w/ OHS
Syringe 5mLBD309646
Vannas-Tubingen Spring ScissorsFine Science Tools15008-08
XylazineKorn Pharmaceuticals CorpNDC 59399-110-20
Yasargil ClampAesculap, IncFT351TUsed to clamp bronchus
Yasargil ClampAesculap, IncFT261TUsed to clamp hilum
Yasargil Clamp ApplicatorAesculap, IncFT484T

参考文献

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