Ein Ratten-Lungentransplantationsmodell für warme Ischämie/Reperfusionsschäden: Optimierungen zur Verbesserung der Ergebnisse

Zusammenfassung

Hier stellen wir Optimierungen an einem Rattenlungentransplantationsmodell vor, die dazu dienen, die Ergebnisse zu verbessern. Wir bieten eine Größentabelle für Manschetten basierend auf dem Körpergewicht, eine Messstrategie zur Bestimmung des 4. Interkostalraums sowie Methoden des Wundverschlusses und der BAL-Flüssigkeit (bronchoalveoläre Lavage) und Gewebeentnahme^.

Zusammenfassung

Aus unserer Erfahrung mit der Lungentransplantation von Ratten haben wir mehrere Bereiche mit Verbesserungspotenzial gefunden. Die Informationen in der vorhandenen Literatur über Methoden zur Auswahl geeigneter Manschettengrößen für die Pulmonalvene (PV), die Pulmonalarterie (PA) oder den Bronchus (Br) sind vielfältig, so dass die Bestimmung der richtigen Manschettengröße während der Rattenlungentransplantation eine Übung von Versuch und Irrtum ist. Durch die Standardisierung der Cuffing-Technik, um die kleinste effektive Manschette zu verwenden, die für die Größe des Gefäßes oder Bronchus geeignet ist, kann man das Transplantationsverfahren sicherer, schneller und erfolgreicher machen. Da die Durchmesser von PV, PA und Br mit dem Körpergewicht der Ratte zusammenhängen, stellen wir eine Strategie zur Auswahl einer geeigneten Größe unter Verwendung eines gewichtsbasierten Leitfadens vor. Da das Lungenvolumen auch mit dem Körpergewicht zusammenhängt, empfehlen wir, dass dieser Zusammenhang auch bei der Auswahl des richtigen Luftvolumens für das Aufblasen der Spenderlunge während einer warmen Ischämie sowie für das richtige PBS-Volumen, das während der Entnahme von bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BAL) instilliert werden soll, berücksichtigt werden sollte. Wir beschreiben auch Methoden für die 4. Interkostalraumdissektion, den Wundverschluss und die Probenentnahme sowohl aus dem nativen als auch aus dem transplantierten Lappen^.

Einleitung

Seit über drei Jahrzehnten modifizieren und verbessern Forscher Rattenlungentransplantationsmodelle, damit die generierten Daten konsistenter sind und den tatsächlichen klinischen Zustand besser widerspiegeln. In der Zeit, in der unser Labor dieses Modell durchführte, haben wir vier Bereiche mit Verbesserungspotenzial festgestellt: Cuffing-Techniken für Anastomosen, Identifizierung des 4. Interkostalraums des Empfängers, Aufblasen und Wundverschluss der Lunge während des Eingriffs des Empfängers sowie die Entnahme von Proben für die Analyse^.

Modifikationen der Cuffing-Technik für Anastomosen können den gesamten Transplantationsprozess verbessern, indem sie die Handhabungszeit der Spenderlunge^verkürzen 1,2,3,4,5,6 und das Anastomosenverfahren für den Mikrochirurgen schneller und technisch einfacher machen. Während es wichtig ist, Manschetten in der richtigen Größe zu verwenden, um die transplantierte Lunge mit dem notwendigen Blut und Luftstrom zu versorgen, gibt es nur begrenzte Richtlinien darüber, wie man die Größe der Manschetten für die Pulmonalvene (PV), die Pulmonalarterie (PA) oder den Bronchus (Br) auswählen sollte5,7,8,9. Da die Durchmesser von PV, PA und Br mit dem Körpergewicht der Spender- und Empfängerratten zusammenhängen, schlagen wir vor, dass die Manschettengröße auf dem Körpergewicht basiert. Dieser Bericht enthält eine Größentabelle für Manschetten basierend auf dem Körpergewicht einer Ratte (180 g bis über 270 g), die dazu dient, die Blut- und Luftversorgung der transplantierten Lunge zu optimieren (Tabelle 1).

Während ein neuerer Mikrochirurg während des Spenderverfahrens erfolgreich und einfach eine Spenderlunge beschaffen kann, ist die Transplantation der Lunge während des Eingriffs des Empfängers komplizierter und hängt von der Erfahrung des Mikrochirurgen ab. Der Versuch, den 4. Interkostalraum zu finden, um Zugang zur linken Lunge des Empfängers zu erhalten, ist einer der schwierigeren Schritte, der eine gewisse Subjektivität aufweist und die Eingriffszeit verlängern kann^. Daher stellen wir eine einfache und objektive Methode vor, um die Identifizierung der 4. Interkostalraumlokalisation zu unterstützen, indem wir Brustmessungen und das Herzklopfen verwenden, um den richtigen Bereich der Brustwand zu finden, um 4,5,6,10,11,12 zu präparieren^.

Wir schlagen auch eine Verbesserung der Vergrößerung der Spenderlunge vor, die eine potenzielle Ursache für die Schädigung des Organs darstellt. Die Spenderlunge wird entleert, bis die Reperfusion beginnt. Beim Nähen des 4. Zwischenrippenraums wird die Spenderlunge häufig durch Erhöhung des PEEP von 2 cmH2 O auf 6_cmH2O aufgebläht^. Um die Lungenschädigung durch Überpumpen zu minimieren, schlagen wir eine Technik vor, bei der drei 6-0-Nylonnähte mit einfachen Doppelknoten um die 4. Rippe unterhalb der 5^{. Rippe} gelegt werden^. Wenn es Zeit für den Wundverschluss ist, werden die Enden der drei Nähte mit Hämostaten in beiden Händen gehalten, die Wunde wird auf einmal geschlossen, indem auf jeder Seite nach oben gezogen wird, und der PEEP wird sofort auf 2_cmH2O reduziert. Auf diese Weise kann sich die Lunge so kurz wie möglich ausdehnen¹⁰.

Am Ende eines Experiments möchte der Forscher oft viele Arten von Proben für viele Arten von Analysen von jedem Transplantat sammeln. Zum Beispiel können eingefrorenes Gewebe, formalinfixiertes Gewebe, Gewebe für das Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis zur Bestimmung des Lungenödems und bronchoalvelolare Lavageflüssigkeit (BAL) verwendet werden, um zu beurteilen, wie gut das Transplantat verlaufen ist. Die traditionelle Methode der Entnahme von BAL-Flüssigkeit ermöglicht eine gemischte Probe sowohl aus den nativen Lappen des Empfängers als auch aus dem transplantierten Lappen des Spenders^13,14,15. Um dies zu überwinden, stellen wir eine Methode zur Klemmung der Hilarbereiche vor, die einen genaueren Einblick in den Zustand der transplantierten und nativen Lunge geben kann. Darüber hinaus ist es wichtig, das PBS-Volumen zu berücksichtigen, das zum Auffangen von BAL-Flüssigkeit auf jeder Seite der Lunge verwendet wird, da die BAL-Flüssigkeit zahlreiche lösliche Faktoren wie Zytokine und Chemokine enthält, die anhand der Konzentration gemessen werden. Die Normalisierung des Volumens der eingeträuselten Flüssigkeit auf das geschätzte Volumen der Lungenkapazität kann beim Vergleich helfen. Mit vier Lappen auf der rechten Seite und einem Lappen auf der linken Seite hat jeder der fünf Lappen der Ratte ein anderes Volumen und eine andere Oberfläche¹⁶. Nach einer früheren Studie zur Volumenmessung von Lungenlappen von Backer et al. beträgt das Volumen des rechten Lappens 63% (4400 mm 3) und des linken Lappens 37% (2500 mm³). Daher empfehlen wir, das PBS-Volumen, das zum Auffangen von BAL-Flüssigkeit verwendet wird, als das Doppelte des Tidalvolumens (7,2 ml/kg) multipliziert mit 63 % für die rechte Lunge und 37 % für die linke Lunge zu berechnen. Mit diesem Ansatz kann man Variablen wie Körpergewicht und Timing^{besser kontrollieren 10,16}.

Insgesamt werden wir in diesem Bericht einige Modifikationen des experimentellen Standardmodells der Rattenlungentransplantation demonstrieren, die das Verfahren effizienter machen und die Fähigkeit erhöhen können, genauere und reichhaltigere Daten aus jedem Experiment zu generieren.

Protokoll

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (180-270 g Körpergewicht) wurden kommerziell gekauft (z. B. Envigo) und unter pathogenfreien Bedingungen in der Ohio State University Animal Facility untergebracht. Alle Verfahren wurden gemäß dem NIH und dem National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals und mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University (IACUC-Protokoll # 2012A00000135-R2) human durchgeführt.

1. Ersteinrichtung

1. Richten Sie chirurgische Geräte ein.
   HINWEIS: Dies ist eine Operation, bei der es sich nicht um ein Überleben handelt. Wenn eine Überlebensoperation durchgeführt werden soll, müssten sterile Instrumente und Barrierevorkehrungen getroffen werden.
   1. Schalten Sie das Gerät zur Überwachung der Herzfrequenz/Sauerstoffsättigung und die Wärmetafel auf 42 °C ein.
   2. Schalten Sie das Beatmungs- und Anästhesiegerät ein, um den Isofluran-Verdampfer vorzuwärmen.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein Tidalvolumen (Td) von 7,2 ml/kg, einen exspiratorischen Druck (PEEP) von 2_cmH2Ound eine Atemfrequenz von 80 Schlägen pro Minute.
   3. Füllen Sie die Anästhesiespritze mit 10 ml flüssigem Isofluran und montieren Sie die Spritze auf dem Beatmungs- und Anästhesiegerät.
   4. Schalten Sie das Operationsmikroskop ein, wobei die Höhe und der Fokus an die Vorlieben des Mikrochirurgen angepasst sind.
   5. Schalten Sie das Elektrokautergerät ein.
2. Bereiten Sie chirurgische Instrumente vor und legen Sie sie aus (Abbildung 1).
   HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente wurden bei 121 °C für 30 min autoklaviert.
3. Sammeln und erfassen Sie das Körpergewicht von Spender- und Empfängerratten.
4. Verwenden Sie Tabelle 1 und das Körpergewicht der Ratte, um das richtige Angiokatheter-Messgerät (20, 18, 16, 14 oder 12 G) für die Herstellung von Manschetten zu bestimmen.
5. Bereiten Sie Manschetten für die Pulmonalarterie (PA), den Bronchus (Br) und die Pulmonalvene (PV) unter Verwendung der Größentabelle basierend auf dem Körpergewicht vor (Tabelle 1 und Abbildung 2).
   1. Legen Sie einen Angiokatheter der Größe 20 G, 18 G, 16 G, 14 G oder 12 G (Abbildung 2A-E) auf eine sterile Oberfläche unter dem Operationsmikroskop.
   2. Verwenden Sie dann eine chirurgische Klinge #11 mit Rippenrücken, um den Angiokatheter in einem 90°-Winkel zu durchtrennen, um einen 2 mm langen Manschettenkörper mit einer 1 mm x 1 mm großen Lasche (Breite x Höhe) an der Oberseite des Manschettenkörpers zu bilden (Abbildung 2G).
   3. Bewahren Sie die Manschetten bis zur Verwendung in steriler Kochsalzlösung auf.
6. Bereiten Sie Lösungen vor.
   1. Bereiten Sie eine Mischung aus Ketamin und Xylazin in einer sterilen Injektionsflasche vor, indem Sie 1 ml Xylazin (100 mg/ml) zu 10 ml Ketamin (100 mg/ml) hinzufügen.
      HINWEIS: Das Verfallsdatum für diesen Cocktail wird anhand des frühesten Verfallsdatums der verwendeten Komponenten bestimmt.
   2. Ziehen Sie die richtige Dosierung für die Ratten in Spritzen auf (0,1 ml des Ketamin/Xylazin-Gemischs pro 100 g Körpergewicht der Ratte; z. B. würden bei einer 200-g-Ratte 0,2 ml Ketamin/Xylazin-Gemisch abgegeben werden).
      HINWEIS: Diese Dosierung liefert der Ratte 91 mg/kg Ketamin und 9,1 mg/kg Xylazin und sollte eine Ratte 60-80 Minuten lang sediert halten.
   3. Bereiten Sie Heparin vor, das in einer Dosis von 1.000 E/kg verabreicht wird.
   4. Lagern Sie die Kochsalzlösung, PBS und die Konservierungslösung auf Eis (Materialtabelle).

2. Vorbereitung der Spenderratte

1. Induzieren Sie eine Anästhesie bei der Spenderratte, indem Sie das Ketamin-Xylazin-Gemisch intraperitoneal injizieren und ~10 Minuten warten, bis sich eine chirurgische Anästhesieebene entwickelt, die durch mangelnde Reaktion auf Zehenzwickungen beurteilt werden kann.
2. Rasieren Sie den Einschnitt mit einer elektronischen Haarschneidemaschine.
3. Legen Sie die Spenderratte in Rückenlage auf das chirurgische Wärmebrett und wischen Sie den Einschnitt mit einer sterilen, mit Betadine getränkten Gaze ab. Wischen Sie den Bereich dann mit einem 70%igen Isopropylalkohol-Tupfer ab. Wiederholen Sie dies 3 Mal.
4. Machen Sie mit einer Schere einen 3 bis 4 cm langen Hautschnitt in der Mitte des Halses und präparieren Sie vorsichtig das Unterhautgewebe und die Muskeln mit einer Pinzette (anstelle einer Schere, um Blutungen zu vermeiden).
5. Für die endotracheale Intubation fädeln Sie eine 4-0-Seidennaht um die Luftröhre und führen einen 16-G-Angiokatheter in die Luftröhre ein. Binden Sie die Naht mit einem Doppelknoten fest um die Luftröhre und schließen Sie dann mit einem einzigen Knoten ab, um den Angiokatheter an Ort und Stelle zu halten.
6. Schließen Sie den Angiokatheter an das Beatmungsgerät an und halten Sie eine chirurgische Anästhesieebene bei der Ratte mit 1-2% Isofluran aufrecht.
7. Führen Sie eine Laparo-Sternotomie als kombinierten Mittellinien- und Querschnitt mit einer Schere durch.
8. Injizieren Sie Heparin (1.000 E/kg) mit einer Insulinspritze über die untere Hohlvene (IVC) und lassen Sie 10 Minuten für die systemische Zirkulation einwirken.
   HINWEIS: Diese Verabreichung von Heparin verhindert Blutgerinnsel in der Spenderlunge.
9. Präparieren Sie das Zwerchfell sorgfältig, indem Sie entlang des Brustbogens schneiden, und legen Sie dann die Brusthöhle frei, indem Sie dem Brustbein bis zum Hals folgen.

3. Spender-Lungen-Wärme-Ischämie und -beschaffung

1. Euthanasieren Sie die Spenderratte, indem Sie den IVC durchschneiden.
2. Während die Lunge noch beatmet wird, schneiden Sie sowohl die rechte als auch die linke Ohrmuschel mit einer Mikropräparier-Federschere und spülen Sie die Lunge mit 20 ml Konservierungslösung in einer Spritze, die bei 28 cmH₂O durch Schwerkraft hängt und mit einem Schlauch und einem 18-G-Angiokatheter verbunden ist, der direkt durch die Lungenarterie eingeführt wird.
3. Trennen Sie das Beatmungsgerät vom Endotrachealtubus und schließen Sie es an eine 5-ml-Spritze an, die je nach Körpergewicht mit einem geeigneten Luftvolumen gefüllt ist.
   HINWEIS: Das Luftvolumen zum Aufblasen der Lunge kann wie folgt berechnet werden, als ob das Doppelte des Tidalvolumens (Td = 7,2 ml/kg) vorhanden wäre, z. B. hätte eine 200-g-Ratte einen Td von 1,44 ml, und multipliziert mit 2 würde dies 2,88 ml Luft ergeben, die zum Aufblasen der Lunge benötigt wird.
4. Die Lunge des Spenders aufblasen.
5. Setzen Sie eine Yasargil-Klemme auf die Luftröhre, um die Lunge aufgeblasen zu halten, und bedecken Sie die Lunge und das Herz mit steriler Baumwollgaze. Befeuchten Sie die Gaze mit Kochsalzlösung, wickeln Sie die Spenderratte mit einer Unterlage ein und lassen Sie sie 1 Stunde lang auf dem wärmenden Operationsbrett stehen, um eine warme Ischämie in der Lunge zu induzieren (Abbildung 3).
6. Nach 1 h warmer Ischämie wird der Herz-Lungen-Block mit einer Mikropräparier-Federschere und einer Pinzette herausgeschnitten und auf sterile, mit eiskaltem PBS angefeuchtete Gaze auf eine sterile Petrischale auf Eis gelegt.
   Anmerkungen: Alle folgenden Schritte sollten ausgeführt werden, während sich die Lunge auf der Petrischale auf Eis befindet.
7. Schneiden Sie die Lungenbänder vorsichtig mit einer Mikropräparier-Federschere ein, um die linke Lunge von der Speiseröhre und dem Postkavallappen zu trennen.
8. Schneiden Sie den linken Lungenflügelbereich vorsichtig mit einer Vannas-Tübinger Federschere ab und beschaffen Sie die linke PV, PA und Br.
9. Legen Sie die Manschetten auf PV, PA oder Br (Abbildung 4A-C).
   1. Verwenden Sie einen Moskito-Hämostaten, um die Manschettenlasche zu greifen.
   2. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das distale Ende des PV, PA oder Br durch den entsprechenden Manschettenkörper zu greifen, das überschüssige Gewebe um die Manschette zu wickeln und mit 8-0 zu sichern Nylon-Naht. Verwenden Sie eine Vannas-Tübingen-Federschere, um überschüssiges Gewebe und die Manschette um den Manschettenkörper herum abzuschneiden.
10. Bewahren Sie die Spenderlunge mit mit Kochsalzlösung befeuchteter Gaze auf der Petrischale auf Eis auf, bis sie bereit ist, in die Empfängerratte transplantiert zu werden (Abbildung 4D).
    HINWEIS: Die durchschnittliche Zeit der kalten Ischämie beträgt 84 Minuten ± 11 Minuten S.D.

4. Vorbereitung der Empfängerratte

1. Induzieren Sie eine Anästhesie bei der Empfängerratte auf die gleiche Weise wie bei der Spenderratte, indem Sie das Ketamin-Xylazin-Gemisch intraperitoneal injizieren (0,1 ml pro 100 g Ratte) und 10 Minuten warten, bis sich eine chirurgische Anästhesieebene entwickelt, die durch mangelndes Ansprechen auf Zehenkneifen beurteilt werden kann.
2. Rasieren Sie den Schnittbereich mit einer elektronischen Haarschneidemaschine.
3. Legen Sie die Spenderratte in Rückenlage und wischen Sie den Einschnitt mit einer sterilen, mit Betadin getränkten Gaze ab. Wischen Sie den Bereich dann mit einem 70%igen Isopropylalkohol-Tupfer ab. Wiederholen Sie dies 3 Mal.
4. Bevor die Ratte an der Beatmungsmaschine befestigt wird, zeichnen Sie Linien auf die Brust der Ratte, um sich darauf vorzubereiten, den 4^. Zwischenrippenraum zu finden.
   1. Messen Sie den Brustkorb von der suprasternalen Kerbe bis zum Processus xiphoideus und zeichnen Sie eine Linie (Abbildung 5A).
   2. Zeichnen Sie in der Mitte dieser Linie eine Linie entlang der linken Seite des Brustkorbs, die die Hälfte des Maßes von der suprasternalen Kerbe bis zum Processus xiphoideus misst (Abbildung 5A und B).
5. Intubieren Sie den Empfänger mit einem 16-G-Angiokatheter durch Visualisierung mit dem Glasfaserkabel, das mit einer LED-Leuchte aus dem endotrachealen Intubationskit verbunden ist.
6. Schließen Sie den Angiokatheter an das Beatmungsgerät an und halten Sie eine chirurgische Anästhesieebene mit 1-2% Isofluran aufrecht.
7. Um den 4^. Zwischenrippenraum zu finden, suchen Sie den Bereich der Brustwand, in dem ein starker tastbarer Herzimpuls zu spüren ist (Abbildung 5C, roter Kreis).
8. Schneiden Sie an dieser Stelle die Haut mit einer Schere und den Muskel mit einer Mikropräparierfederschere ein und öffnen Sie mit dem Retraktor den 4^. Zwischenrippenraum so weit wie möglich (Abbildung 5D und E).
   Anmerkungen: Verwenden Sie eine elektrische Kauterisation, um Blutungen während der Muskeldissektion zu vermeiden oder zu stoppen.
9. Sobald der Zwischenrippenraum weit geöffnet ist, präparieren Sie vorsichtig die Bänder um die linke Lunge des Empfängers mit einer Vannas-Tübingen-Federschere und ziehen Sie die Lunge mit sterilen Wattestäbchen und Pinzetten aus dem Brustbereich.
10. Sterile Gaze um die linke Lunge legen und mit einer Dieffenbach Bulldoggenklemme festhalten.
11. Setzen Sie eine Yasargil-Klemme so proximal wie möglich auf den linken Lungenhilabereich auf.

5. Anastomosen

1. Lungenvenenanastomose (PV)
   1. Legen Sie 7-0 Nylonnaht um den PV des Empfängers.
   2. Schneiden Sie den PV des Empfängers mit der Vannas-Tübingen-Federschere ein, indem Sie die oberen und unteren Segmentvenen so distal wie möglich quer durchtrennen und das Blut mit 0,2 ml heparinisierter Kochsalzlösung (1 U/ml) mit einer Insulinspritze ausspülen.
   3. Legen Sie die Spenderlunge, die noch mit eiskalter, nasser, steriler Gaze umwickelt ist, in die Brusthöhle.
   4. Führen Sie den PV mit Manschetten des Spenders in den PV des Empfängers ein und befestigen Sie ihn dann mit dem vorpositionierten 7-0-Nylonnaht (Abbildung 6).
2. Bronchiale (Br) Anastomose
   1. Legen Sie 7-0 Nylonnaht um die Br.
   2. Schneiden Sie das Br des Empfängers ein, indem Sie die oberen und unteren segmentalen Atemwege mit einer Vannas-Tübingen-Federschere so distal wie möglich quer durchtrennen.
   3. Führen Sie das Br mit Manschetten des Spenders in das Br des Empfängers ein und sichern Sie es mit dem vorpositionierten 7-0-Nylonnaht (Abbildung 6).
3. Anastomose der Pulmonalarterie (PA):
   1. Legen Sie 7-0 Nylonnaht um die PA des Empfängers.
   2. Schneiden Sie die PA des Empfängers aus der Adventitialhülle, schneiden Sie die Hälfte des Gefäßumfangs mit einer Vannas-Tübingen-Federschere ein und spülen Sie dann das Blut in der PA mit 0,2 ml heparinisierter Kochsalzlösung (1 U/ml) mit einer Insulinspritze aus.
   3. Führen Sie die PA mit Manschetten des Spenders in die PA des Empfängers ein und sichern Sie sie mit der vorpositionierten 7-0-Nylonnaht (Abbildung 6).

6. Reperfusion

1. Entfernen Sie die Yasargil-Klemme am Hilum, um eine Reperfusion und Belüftung der transplantierten Spenderlunge zu ermöglichen (Abbildung 7).
2. Präparieren Sie die native linke Lunge des Empfängers mit einer Mikropräparierfederschere und einer Pinzette.
3. Positionieren Sie die transplantierte linke Lunge vorsichtig wieder in den Brustkorb des Empfängers.
4. Schließen Sie den Thorakotomie-Schnitt mit einer 6-0-Nylonnaht.
   1. Legen Sie drei 6-0-Nylonnähte mit einfachen Doppelknoten um die Rippen oberhalb der 4. Rippe und unterhalb der 5^{. Rippe} (Abbildung 8A).
   2. Verwenden Sie Hämostate, um die drei Nähte zusammenzufassen (Abbildung 8B).
   3. Erhöhen Sie den PEEP in den Lüftungseinstellungen auf 6_cmH2O.
   4. Binden Sie alle drei Knoten gleichzeitig zusammen, indem Sie sie wegziehen, um die Wunde zu schließen (Abbildung 8C).
   5. PEEP sofort auf 2_cmH2O verringern.
   6. Schließen Sie die Haut mit einer 6-0 Nylonnaht.
      HINWEIS: Unser Labor untersucht die akute Phase nach der Transplantation, so dass die Empfängerratte in diesem Modell 3 Stunden nach der Transplantation unter Beatmung und Anästhesie überlebt wird und dann Proben entnommen werden.

7. Sammlung von Versuchspräparaten (Plasma, Lungengewebe)

1. Bei Kontrollproben werden die rechten Lappen des Spenders nach Beginn der 3-stündigen Reperfusionszeit entnommen.
   1. Schnappen Sie den oberen Lappen und den Postkavallappen für Protein- oder RNA-Expressionsanalysen, bewahren Sie den Mittellappen für die Histologie auf und verwenden Sie den unteren Lappen für das Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis (Abbildung 9A).
2. Bereiten Sie 10 Minuten vor Ablauf der 3-stündigen Reperfusionszeit die Entnahme der Empfängerproben vor, indem Sie Heparin (1.000 E/kg) mit einer Insulinspritze in die Halsvene injizieren.
   HINWEIS: Diese Verabreichung von Heparin verhindert Blutgerinnsel in der Lunge und ermöglicht eine gründlichere Spülung zum Zeitpunkt der Beschaffung.
3. Plasma-Sammlung
   1. Am Ende der 3-stündigen Reperfusionszeit werden 1 ml Blut mit einer Spritze über den IVC entnommen.
   2. Auf Eis lagern und dann 10 Minuten lang bei 2.000 x g zentrifugieren, um Plasma zu gewinnen.
4. Schläfern Sie die Empfängerratte ein, indem Sie den IVC durchschneiden, um eine Ausblutung zu ermöglichen.
5. Präparieren Sie das Zwerchfell entlang des Brustbogens und legen Sie die Brusthöhle frei, indem Sie den Brustkorb herauspräparieren.
6. Sammeln Sie BAL-Flüssigkeit aus der nativen oder transplantierten Lunge, falls gewünscht (optional).
   HINWEIS: Wenn ein Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis oder eine Histologie an der Lunge durchgeführt wird, sollte keine BAL-Flüssigkeitsentnahme durchgeführt werden, da dies die Ergebnisse beeinflussen kann.
   1. Fädeln Sie 4-0 Seidennaht um die Luftröhre und binden Sie einen festen Doppelknoten um die Luftröhre und den Intubationsschlauch, um ein Austreten von Flüssigkeit zu verhindern.
   2. Berechnen Sie die Menge an eiskaltem PBS für die Sammlung von BAL-Flüssigkeit aus dem rechten Lappen und dem linken Lappen.
      HINWEIS: Das Volumenverhältnis für die rechte Lunge beträgt 63 %, während das Volumenverhältnis für die linke Lunge 37 % ^beträgt16. Um die Menge an PBS zu bestimmen, die in jede Seite eingeträufelt werden soll, sollte das Volumen daher als das Doppelte des Tidalvolumens (Td = 7,2 ml/kg) multipliziert mit 63 % für die rechte Lunge und 37 % für die linke Lunge berechnet werden.
   3. Setzen Sie eine Yasargil-Klemme auf den linken Lungenbereich (Abbildung 10A) und träufeln Sie mit einer Spritze, die an den Angiokatheter angeschlossen ist, die berechnete Menge eiskaltes PBS in die rechte Lunge (die nativen Lappen des Empfängers) und sammeln Sie die BAL-Flüssigkeit, indem Sie vorsichtig am Spritzenkolben nach oben ziehen. Zweimal ausführen.
      HINWEIS: Man sollte mit einer Rückgewinnung von 70-80% der eingeträufelten Flüssigkeit rechnen.
   4. Entfernen Sie die Yasargil-Klemme an der linken Lunge und platzieren Sie die Klemme im rechten Lungenhilabereich (Abbildung 10B).
   5. Sammeln Sie BAL-Flüssigkeit aus dem transplantierten linken Lappen auf die gleiche Weise, wie sie für den rechten Lappen gesammelt wurde, und entfernen Sie dann die Klemme im Bereich des rechten Lungenhilars.
7. Schneiden Sie die rechte und linke Ohrmuschel mit einer Mikropräparier-Federschere und spülen Sie die Lunge durch Schwerkraft durch die PA mit einem 18-G-Angiokatheter, der an einem Schlauch befestigt ist, und einer Spritze mit 20 ml vorgekühlter Konservierungslösung, die bei 28_cmH2O hängt.
8. Entnahme von Proben aus der Lunge des Empfängers.
   1. Frieren Sie den oberen Lappen und den Postkavallappen für Protein- oder RNA-Expressionsanalysen ein, bewahren Sie den Mittellappen für die Histologie auf und verwenden Sie den unteren Lappen für das Verhältnis von Nass- zu Trockengewicht) (Abbildung 9A).
   2. Teilen Sie den linken transplantierten linken Lappen in drei Teile: den oberen Bereich, der für das Schockfrosten gesammelt wurde, den mittleren Bereich für die Histologie und den unteren Bereich für das Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis (Abbildung 9B).

Ergebnisse

Um das Lungenödem zu messen, wurde das Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis berechnet. Der native Lappen des Spenders, der transplantierte Lappen und der native Lappen des Empfängers wurden wie im Protokoll beschrieben entnommen und sofort auf das Nassgewicht gewogen, 48 h lang bei 60 °C getrocknet und dann erneut für das Trockengewicht gewogen. Ein erhöhtes Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis würde auf ein Lungenödem hindeuten. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass der transplantierte La...

Diskussion

In diesem Bericht haben wir an mehreren kritischen Schritten eines Rattenlungentransplantationsprotokolls interveniert, um das Verfahren zu optimieren. Obwohl über verschiedene Cuffing-Techniken für die Lungentransplantation von Ratten berichtet wurde 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Gauge angio-catheter	BD	382277
14 Gauge angio-catheter	B. Braun	4251717-02
16 Gauge angio-catheter	B. Braun	4252586-02
18 Gauge angio-catheter	B. Braun	4251679-02
20 Gauge angio-catheter	B. Braun	4252527-02
4-0 silk suture	Surgical Specialties Corp.	SP116
6-0 nylon suture	AD Surgical	S-N618R13
7-0 nylon suture	AD Surgical	S-N718SP13
8-0 nylon suture	AD Surgical	XXS-N807T6
Betadine Spray	Avrio Health L.P	UPC 367618160039
Clippers	VWR	MSPP-023326
Castroviejo micro dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument Co	RS-5668
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Electrocautery	Macan	MV-7A
Endotracheal intubation kit	Kent Scientific	ETI-MSE
Forceps	Fine Science Tools	11027-12
Halsted-mosquito hemostat	Roboz Surgical Instrument Co	RS-7112
Heparin	Fresnius Medical Care	C504701
Insulin syringe	Life Technologies	B328446
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Isopropyl Alcohol Swabs	BD	326895
Ketamine	Hikma Pharmaceuticals PLC	NDC 0413-9505-10
Dieffenbach Bulldog Clamp	World Precision Instruments	WPI14117
Needle holder/Forceps, Curved	Micrins	MI1542
Needle holder/Forceps, Straight	Micrins	MI1540
Perfadex Plus (Organ Preservation Solution)	XVIVO Perfusion AB	REF# 19950
PhysioSuite	Kent Scientific	PS-MSTAT-RT	Used to check SpO2 and heartbeat
Retractor	Roboz Surgical Instrument Co	RS-6560
Saline	PP Pharmaceuticals LLC	NDC 63323-186-10
Scissors	Fine Science Tools	14090-11
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System	Kent Scientific	SS-MVG-Module
Sterile  Cotton Gauze Pad	Fisherbrand	22-415-469
Surgical Microscope	Leica	M500-N w/ OHS
Syringe 5mL	BD	309646
Vannas-Tubingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15008-08
Xylazine	Korn Pharmaceuticals Corp	NDC 59399-110-20
Yasargil Clamp	Aesculap, Inc	FT351T	Used to clamp bronchus
Yasargil Clamp	Aesculap, Inc	FT261T	Used to clamp hilum
Yasargil Clamp Applicator	Aesculap, Inc	FT484T