母親と乳児の精神疾患に対する翻訳的に関連するパラダイムとしての妊娠における心理社会的ストレスのマウスモデルの使用

要約

慢性心理社会的ストレス(CGS)パラダイムは、母親と乳児の精神疾患をモデル化するために、マウスで妊娠中に臨床的に関連するストレータを採用しています。ここでは、このモデルを検証するためにCGSパラダイムとダウンストリーム評価を適用するステップバイステップの手順を提供します。

要約

分娩期は、母親の暴露が神経精神疾患の発症を含む母親と子孫の両方に長期的な悪影響を及ぼす可能性のある敏感な期間と考えられている。母子ダイアドにおける情動性調節不整合の出現に関連する危険因子が広範囲に研究されている。妊娠中の心理社会的ストレスへの暴露は、一貫して最も強い予測変数の一つとして浮上している。この関連付けを探索するために、いくつかのげっ歯類モデルが作成されました。しかし、これらのモデルは、女性が経験するストレッサーの種類、強度、頻度を正確に捉えていない、繰り返しの方法で提示される物理的ストレッサーまたは限られた数の心理社会的ストレッサーの使用に依存しています。これらの限界を克服するために、予測不可能な方法で提示された異なる強度の様々な心理社会的侮辱を採用する慢性心理社会的ストレス(CGS)パラダイムが生成されました。この原稿は、妊娠6.5日目から17.5日目までの妊娠中の雌マウスが日中および一晩で様々なストレッサーにさらされるこの新しいCGSパラダイムを記述しています。日のストレッサーは、2時間の休憩で区切られた1日あたり2つ、異物や捕食者の臭いへの暴露から寝具の頻繁な変化、寝具の除去、およびケージの傾きまで多岐にわたります。夜間ストリッサーには、連続光暴露、ケージメイトの変化、または濡れた寝具が含まれます。我々は以前、CGSへの暴露は、ストレス反応性の増加、断片化した母親のケアパターンの出現、アンヘドニア、および不安関連行動、周産期気分および不安障害に苦しむ女性のコア機能を含む母親の神経内分泌および行動異常の発症を引き起こすことを示した。したがって、このCGSモデルは、母体の情動調節不整合の根底にある分子欠陥を解明するユニークなツールとなり、胎児の神経発達に影響を与え、子孫に長期的な行動に悪影響をもたらす胎盤間メカニズムを解明することができます。

概要

分娩期の母親の悪影響を受けた母親および乳児の神経精神疾患に対する感受性の増加の根底にあるメカニズムはほとんど知られていない。実質的な母親の生理学的変化は、妊娠中および産後期への移行中に起こり、健康な子孫の神経発達のためだけでなく、母親の精神的健康を維持するためにも重要であると仮定されるいくつかの神経内分泌適応を含^む1、2。母体視床下部下垂体副腎(HPA)軸のレベルでは、日周HPA軸活性のより平坦なリズムおよび急性ストレッサー^3、4、5に対するHPA軸応答を減衰させることを含む、グルココルチコイド放出の概日およびストレス誘発レベルの両方での適応が観察される。HPA軸活性の増強は、循環性グルココルチコイドのレベルの増加を含む、産後の摂動性調節不変性の女性のサブセットで報告され、負のフィードバックを阻害した^6、7、8を考えると、産後ストレス反応性の増加をもたらし、母親のHPA軸適応を防ぐストレッサーへの暴露は、神経精神障害に対する感受性を高めると考えられている。

母親および乳児の情動調節不整合に対するストレスの影響を解明するために、分隔期のストレスの幾つかのげっ歯類モデルが生成された。これらのモデルの大部分は、ダム生理学的状態⁹における恒常的な課題および変化をもたらす物理的ストレッサーの適用によって特徴付けられるが、例えば、妊娠^11、または産後ショック暴露¹²の間に慢性的な拘束ストレス¹⁰および水泳ストレスのような。これらのパラダイムは、母体ケア^10、11、12における産後うつ病のような行動や変化の出現をもたらすことが示されているが^、人間の母親が一般的に経験するストリスターの心理社会的性質を正確に捉えることができないという制限がある。これは、経期における慢性ストレスの神経内分泌の結果を明らかにしようとする際に特に重要となり、異なるタイプのストレッサーの処理がHPA軸活性化9を調整するニューラルネットワークの変化によって媒介されると考えられることを考えると^。

この制限を克服するために、いくつかのグループは、心理社会的侮辱または身体的および心理社会的ストリッサーの組み合わせを採用したストレスパラダイムを設計している。産後^13日、14日に1日に数時間ダムが子犬から分離される母親分離モデルと^、15,16のごみの存在下でダムが男性の侵入者にさらされる慢性社会的ストレスモデルは、身体的ストレスの妄想に関連する母親のケアとうつ病のような表現型の異常の出現を再現することができました。妊娠中の雌マウスがケージチルトや夜間照明を含む様々な心理社会的侮辱にさらされる慢性超軽度ストレスパラダイム、拘束ストレスや食物制限などの実質的な生理学的侮辱は、母親の攻撃性の障害を含む母親の行動の異常をもたらすストレッサーの混合性質への暴露をさらに明らかにしました。 HPA軸^17,18の概日活動における調節不整レーションと同様に。これらの結果と一致して、妊娠中の交互拘束応力および過密モデルは、産後母体概日コルチコステロンレベルの上昇および母親のケアにおける変化をもたらすが、新しい急性侮辱への産後暴露後のHPA軸再活動では違いは認^{められない。}

この研究の拡大は、予測不可能な方法で提示された複数の心理社会的侮辱を採用し、生理学的ストレッサーの使用を最小限に抑える妊娠ストレスパラダイムを生成する。研究は、以前にこの慢性心理社会的ストレスパラダイム(CGS)が母体HPA軸機能障害の発症をもたらし、産後初期期¹⁹におけるストレス反応性の亢進を含む結果を示している。これらの変化は、子犬が受ける母親のケアの質の変化、およびアンヘドニックおよび不安様行動¹⁹の出現を含む母親の行動における異常と関連しており、周産期気分および不安障害^20,21と一致する特徴である。さらに、子孫の体重増加は、CGS¹⁹への子宮内暴露後の出生後の期間に減少し、CGSが将来の世代で持続的な陰性プログラミング効果を有する可能性があることを示唆している。

CGSパラダイムの開発における目標は、主に臨床的に関連するストレッサーを利用し、神経内分泌調節障害および周産期気分および不安障害の発症にしばしば関連する侮辱の種類、強度、頻度を正確に捉えるものであった。ここでは、この研究は、妊娠中の雌マウスをCGSに服従させる方法の詳細なプロトコルと、モデルの有効性をテストするために使用できる下流評価を提供する。

プロトコル

記載されているすべての動物実験は、シンシナティ小児医療センターの動物ケアと使用委員会によって承認され、国立衛生研究所のガイドラインに従っていました。標準的なげっ歯類のチョウと水への アドリビタム アクセスは、CGSパラダイム中を含むマウスに常に提供された。マウスは、特に指定されていない限り、14時間/10時間の明暗サイクル(06:00時間のライト)で収容された(すなわち、夜間の光への暴露)。

1. 時取り合いの準備

1. タイミング付き交配を設定する少なくとも2週間前に、成人雌マウスを標準的なマウスケージ(18.4cm x 29.2 cm x 12.7 cm)に一緒に収容し、ケージあたり4匹のマウスを収容する。各メスのマウスに、イヤータグを使用して特定のID番号を付けます。
   注:C57BL6雌マウスは妊娠前おらず、3〜6ヶ月の間にこのプロトコルに使用されました。
2. タイミング付き交配を設定する少なくとも1週間前に、交配に使用する成人雄マウスを個別に収容する。

2. 時間指定の交配を設定する

1. 時間指定の交配を 18:00 時間に設定します。2匹の雌マウスを取り、個別に収容された雄のマウスを保持するケージの中に置きます。翌朝の08:00までに時間の交配を分けます。

3. 妊娠日 0.5 (G0.5) として指定された交付プラグを確認します。

1. 時差交配を分離した直後に、雌マウスに交尾プラグが存在することを確認します。交付プラグの存在はG0.5をマークします。マウスがケージの内側にワイヤーグリッドを保持し、尾部でそっと持ち上げて膣の開口部を視覚化します。
   注:交付プラグの存在は、性行為が起こったことを示しますが、妊娠を保証するものではありません。必要な実験マウスの数を計算しようとすると、マウスの50%が時間の交配から差し込まれ、妊娠が60%-70%の発生率を差し込むことが期待されます。
2. 簡単な目視検査を使用して、交点プラグ(膣開口部の内側またはわずかに突き出た不透明な白っぽい硬化塊)の存在を特定します。簡単な目視検査で交付プラグが容易に識別されない場合は、膣の開口部に鈍い端プローブをそっと挿入します。プローブ挿入の抵抗によって膣内にさらに戻って配置されたプラグを識別します。
3. 標準的なマウスケージで、交付プラグとグループハウスで雌のマウスを分離します, ケージあたり3〜4マウス.

4. CGS パラダイムの準備

1. G5.5の制御およびCGSグループの2つのグループに、交付プラグを備えた雌マウスを収容するケージをランダムに割り当てる。ケージをランダム化して、グループごとにほぼ同じ数のマウスを持つことを試みます。マウスを移動して標準的なマウスケージをきれいにし、「邪魔しない」サインでラベルを付けます。これらのケージを、各ストレッサーの最後にマウスを配置するための「ホームケージ」として指定します。
2. CGS パラダイムを実行するために、マウス機能内の別の部屋を指定します。G6.5からG17.5まで続く11日間のストレッサーレジメンを設計し、7日間のストレッサー(異物(大理石またはレゴへの暴露)、捕食者の臭い暴露(汚れたラット寝具)、30°ケージチルト、頻繁な寝具の変更、寝具の除去、3つの夜のストレッサーの動きを1日2回利用し、3つの夜のストレスを利用します(一晩で消灯します)。 ケージメイトの変更、濡れた寝具への暴露)ランダムな方法で一晩。以下に説明するサンプルスケジュールと実験の概略については、 図1を参照してください。
   注:毎日ストレッサーは、マウスの光サイクル(06:00 h-20:00 hのライト)内に入り、最後の2時間、ストレッサーの間に少なくとも2時間の休憩を取る必要があります。毎晩のストレッサーは、暗いサイクルの開始時(20:00のライトオフ)に設定し、ライトサイクルの開始時(06:00のライト)で分離する必要があります。

5. CGS パラダイムの実行

1. CGSパラダイム用に指定された部屋に、フィルターされたトップと水筒を備えた標準的な静的ケージに特定のストレータを設定します。ランダム化中に CGS を受けるマウスケージの数に応じて、実験に必要な静的ケージの数を準備します。各ストレータを開始する前に、ハウジングルームからCGS室にCGSグループのマウスケージを移します。
   注:マウスのハンドリング/移し、ホームケージから実験ケージに、そしてラミナーフローフードに戻ります。
2. あらかじめ設計されたレジメンに従って以下のストレッサーを適用します(ステップ4.2を参照)。
   1. 異物(大理石またはレゴ)への暴露:マウスの巣を含めずに、マウスの寝具できれいな静的ケージにランダムに分散された6つの大理石(直径14mm)または6つのレゴ(高さ4cmを超えないように)をランダムに配置します。マウスをホームケージの対応するマウスと一緒に、異物と一緒に静的ケージに2時間置きます。ストレータの終わりに同じ相手と自宅のケージにマウスを返します。
      メモ:使用後に異物を清掃してください。
   2. 捕食者の臭い暴露(汚れたラットの寝具):マウスの巣を含まずに、マウスの寝具のないきれいな静的なケージに雌のラットからの新鮮な汚れたラットの寝具の深さで1cmを置きます。マウスを自宅のケージの対応するマウスと一緒に、2時間汚れたラット寝具で静的ケージに入れます。ストレータの終わりに同じ相手と自宅のケージにマウスを返します。
   3. 30°ケージチルト:マウスの巣を含めずに、ホームケージの対応するマウスを、マウスの寝具付きのきれいな静電気ケージに入れます。ケージを壁に対して30°で2時間傾けます。ストレータの終わりに同じ相手と自宅のケージにマウスを返します。
   4. 寝具の頻繁な変更:マウスの巣を含めずに、ホームケージの対応するマウスを、マウスの寝具付きのきれいな静的ケージに入れます。マウス寝具を10分ごとに清潔なマウス寝具で2時間置き換えてください。マウス寝具の変更時には、マウスを別のクリーンケージにそっと置き、マウスとの直接接触を避けます。ストレータの終わりに同じ相手と自宅のケージにマウスを返します。
   5. 寝具の取り外し:マウスを自宅のケージの対応するマウスと一緒に、空のきれいな静的ケージ(マウス寝具やネストレットなし)に2時間置きます。ストレータの終わりに同じ相手と自宅のケージにマウスを返します。
   6. シェーカー上の動き:マウスの巣を含めずに、ホームケージの対応するマウスを、マウスの寝具付きのきれいな静的ケージに入れます。静的ケージを、2時間分あたり140ストロークに設定した往復ラボシェーカーの上に置きます。ストレータの終わりに同じ相手と自宅のケージにマウスを返します。
   7. ライトへの一晩の露出:マウスの巣を含めずに、ホームケージの対応するマウスを、マウスの寝具付きのきれいな静的ケージに入れます。暗いサイクルを妨げるために、一晩(20:00 h-06:00 h)のライトをオンに保ちます。ストレータの終わりに同じ相手と自宅のケージにマウスを返します。
   8. ケージメイトの変更:2匹の雌マウス(無傷の雌は治療または対照群の一部ではない)によって収容されているマウス寝具できれいな静的ケージにマウスを移す。一晩で見慣れないケージの仲間と静的なケージにマウスを保ちます。ストレータの終わりに、特定のホームケージの対応するホームケージにマウスを戻します。
   9. ぬれた寝具への露出:寝具が水で飽和するまで24°Cで保たれたきれいな水で、静的なケージをマウスの寝具で満たします。一晩濡れた寝具で静的なケージに彼らのホームケージの対応と一緒にマウスを置きます。ストレータの終わりに同じ相手と自宅のケージにマウスを返します。
3. CGSパラダイムの間、コントロールマウスをハウジングルーム内の自宅のケージに邪魔さないようにしてください。
4. 使用済みホームケージをG10.5の新しいホームケージに交換します。G17.5では、一晩のストルメンサの終わりに、全ての実験マウスを単一ハウスで、分娩および下流機能評価の準備をする。

6. CGSパラダイム中の実験マウスのモニタリング

1. 一晩のストレッサーの間を除いて、ストレッサー塗布中に1時間ごとにマウスを監視する。
2. 創傷、無気力、または任意の物理的な異常を含む苦痛の徴候を示すマウスを実験から除外する。必要に応じて、獣医のスタッフに連絡してください。

7. 実験マウスにおける妊娠中の体重増加率の測定(オプション)

1. G6.5では、ストレータに曝される前にマウスの重さを個別に測定します。G17.5では、一晩のストレータの終わりに、マウスを個別に計量する。同等の妊娠時にコントロールマウスの重量を量る。
2. CGSパラダイム(G6.5)の初日の体重を100%に設定して、妊娠中の体重増加率を測定します。

8. 実験マウスにおける産後相対副腎重量の測定(任意)

1. 産後2日目(PP2)では、制御とCGSダムを個別に計量します。二酸化炭素吸入によってダムを安楽死させ、続いてヒュームフードに子宮頸部脱臼を行う。
2. マウスを解剖プレートに置き、70%エタノールで腹部を殺菌し、ハサミを使って腹腔を開いて垂直カットを行います。腎臓の前極に隣接する副腎を鉗子で両側に分離する。慎重に解剖顕微鏡の下に副腎を囲む脂肪組織を解剖.
3. 両側副腎を個別に秤量する。グラムあたりのミリグラムで相対的な副腎の重量を計算します (右と左副腎/体重の総重量).

9. 実験マウスにおける分娩後視床下部下垂体副腎(HPA)軸活性の測定(任意)

1. HPA軸測定に備えて、分娩後0日目(PP0)にごみを1リットル当たり6匹の子犬に安楽死させます。二酸化炭素吸入を使用し、続いて安楽死の二次的な方法として外科用ハサミで切断する。
2. 産後2日目(PP2)では、換気の良い50 mLポリプロピレンコンピカルチューブ内の制御とCGSダムを20分間個別に抑制します。拘束応力の直後に、円錐管からマウスを取り出し、肩の上に緩い皮膚を保持し、耳の後部を保持して下顎の緊張の上に皮膚を持たせます。
3. 下顎静脈を下顎骨の少し後ろにランセットで穿刺するが、外耳道の前部。血清分離器チューブに最大100μLの母体血液を採取します。サンプル採取後、ガーゼで穏やかな圧力を穿刺部位に加えて出血を止める。出血が止まったら、ダムをホームケージに戻します。
4. 21,130 x g で血清分離器チューブを6分間遠心し、慎重に血清を取り除きます。血清は-20°Cで保存し、後で使用してください。メーカーのプロトコルに従ってELISAキットで血清コルチコステロン濃度を測定します。

実験マウスの産後行動変化の測定(オプション)

1. 行動分析の準備として、PP0上のごみ1匹につき6匹の子犬にごみをカリングする。
2. PP2からPP5までの母体ケア断片化の分析を行う。毎日、光サイクル中に、30分間の母親の行動をビデオ撮影する前に、5分間の習慣化期間のためにダムを試験室に公開します。
   1. 個々の舐め/グルーミングバウトの平均長さとダム¹⁹によって行われたバウトの総数を測定することによって、母親のケアの断片化を評価します。
      注:舐め/グルーミングの動作は、ダムが彼女の舌で子犬の体と接触しているか、子犬が彼女の前足でダムによって処理されている動作として定義されます。バウトは、ダムが彼女の子犬の舐め/グルーミングに従事している中断のない期間として定義されます。
3. PP0からPP6までのスクロース選好性試験(SPT)を介してアンヘドニアの分析を行う。ダムを100mLのきれいな水のボトル1本と、ホームケージ内の4%スクロース溶液の1本の100 mLボトルに浸します。毎日の水量とスクロースの消費量(mL)を測定します。ホームケージのボトル配置を交換します。過去4日間の平均を使用してスクロースの好みを計算する:好み%=[スクロース消費量/スクロース+水消費量)x 100]。
4. PP8上で上昇ゼロ迷路(EZM)を介して不安のような行動の分析を行います。2つの閉じた象限と床から高い2つの開いた象限からなるEZM装置にダムを個別に置きます。ダムが5分間邪魔されずに迷路を探索できるようにします。開いている象限で費やした時間と、開いている象限へのエントリ数を定量化します。

11. 出生後の子孫体重変化の測定(オプション)

1. 子孫の体重分析の準備として、出生日(出生後0日目、PN0)にごみ1匹あたり6匹の子犬にゴミをカリングします。
2. PN0上の子犬の体重と出生後の期間(PN2、7、15、21)の異なる時点での体重を記録します。

結果

妊娠した雌マウスをCGSに曝露すると、妊娠期の体重増加の減少(図2A)および産後初期における副腎体重の増加を含む慢性ストレス関連パラメータの変化をもたらす(図2B)19。重要なことに、CGSへの暴露は、母親の神経内分泌機能における産後異常をもたらす。CGSダムは、新規急性侮辱の適用に続く血清コルチコステロンレベルの上昇...

ディスカッション

妊娠中のマウスを新しいストレッサーに対するHPA軸応答を含む産後の母親の神経内分泌機能をCGS摂動に曝露し、周産期気分および不安障害に関連する様々な行動異常に関連している。このモデルが環境危険因子の利用を採用していることを考えると、遺伝モデル²²で他の方法で観察されるよりも高い形素変異が予想される。しかし、結果を混乱させる可能性のある変数を最?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal lancet	Braintree Scientific Inc.	GR4MM
Blunt end probe	Fine Science Tools	10088-15	Used to check for copulatory plugs
Bottles for SPT	Braintree Scientific Inc.	WTRBTL S-BL	100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL.
Conical tubes (50 mL)	Corning Inc.	352098	Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation.
Legos	Amazon	-
Marbles	Amazon	-
Mouse Corticosterone ELISA kit	Biovendor	RTC002R
Mouse EZM	TSE Systems	-
Reciprocal laboratory shaker	Labnet international	S2030-RC-B
Serum separator tubes	Becton Dickinson	365967
Static cage- bottom	Alternative Design Manufacturing and Supply Inc.	RC71D-PC
Static cage - filtered ventilated tops	Alternative Design Manufacturing and Supply Inc.	FT71H-PC