Utilisation d’un modèle murin de stress psychosocial pendant la grossesse comme paradigme translationnellement pertinent pour les troubles psychiatriques chez les mères et les nourrissons

Résumé

Le paradigme du stress psychosocial chronique (SNC) utilise des facteurs de stress cliniquement pertinents pendant la grossesse chez la souris pour modéliser les troubles psychiatriques des mères et des nourrissons. Ici, nous fournissons une procédure étape par étape d’application du paradigme CGS et des évaluations en aval pour valider ce modèle.

Résumé

La période péripartum est considérée comme une période sensible où les expositions maternelles indésirables peuvent avoir des conséquences négatives à long terme pour la mère et la progéniture, y compris le développement de troubles neuropsychiatriques. Les facteurs de risque liés à l’émergence d’un dérèglement affectif chez la dyade mère-enfant ont été largement étudiés. L’exposition au stress psychosocial pendant la grossesse est toujours apparue comme l’un des prédicteurs les plus puissants. Plusieurs modèles de rongeurs ont été créés pour explorer cette association; cependant, ces modèles reposent sur l’utilisation de facteurs de stress physiques ou d’un nombre limité de facteurs de stress psychosociaux présentés de manière répétitive, qui ne saisissent pas avec précision le type, l’intensité et la fréquence des facteurs de stress vécus par les femmes. Pour surmonter ces limites, un paradigme de stress psychosocial chronique (SGS) a été généré qui utilise diverses insultes psychosociales d’intensité différente présentées de manière imprévisible. Le manuscrit décrit ce nouveau paradigme CGS où les souris femelles gravides, du jour gestationnel 6,5 à 17,5, sont exposées à divers facteurs de stress pendant la journée et la nuit. Les facteurs de stress quotidiens, deux par jour séparés par une pause de 2 heures, vont de l’exposition à des corps étrangers ou à une odeur de prédateur à des changements fréquents dans la litière, à l’enlèvement de la literie et à l’inclinaison de la cage. Les facteurs de stress pendant la nuit comprennent l’exposition continue à la lumière, le changement de compagnons de cage ou le mouillage de la literie. Nous avons déjà montré que l’exposition aux SNC entraîne le développement d’anomalies neuroendocrines et comportementales maternelles, y compris une réactivité accrue au stress, l’émergence de schémas de soins maternels fragmentés, l’anhédonie et les comportements liés à l’anxiété, caractéristiques essentielles des femmes souffrant de troubles de l’humeur et de l’anxiété périnatales. Ce modèle CGS devient donc un outil unique qui peut être utilisé pour élucider les défauts moléculaires sous-jacents à la dérégulation affective maternelle, ainsi que les mécanismes transcanentaires qui ont un impact sur le développement neurologique fœtal et entraînent des conséquences comportementales négatives à long terme chez la progéniture.

Introduction

Les mécanismes sous-jacents à une susceptibilité accrue aux troubles neuropsychiatriques chez les mères et les nourrissons à la suite d’expositions maternelles indésirables au cours de la période péripartum restent largement inconnus. Des altérations physiologiques maternelles substantielles se produisent pendant la grossesse et la transition vers la période post-partum, y compris plusieurs adaptations neuroendocriniennes qui sont supposées être essentielles non seulement pour le développement neurologique de la progéniture en bonne santé, mais aussi pour préserver la santé mentale maternelle^1,2. Au niveau de l’axe hypothalamique maternel hypophysaire surrénalien (HPA), des adaptations dans les niveaux circadiens et induits par le stress de libération de glucocorticoïdes sont observées, y compris un rythme plus aplati de l’activité diurne de l’axe HPA et une réponse atténuée de l’axe HPA aux facteurs de stress aigus^3,4,5. Étant donné que l’activité accrue de l’axe HPA est rapportée chez un sous-ensemble de femmes présentant un dérèglement affectif post-partum, y compris des niveaux accrus de glucocorticoïdes circulants et une rétroaction négative inhibée^6,7,8, l’exposition à des facteurs de stress qui entraînent une augmentation de la réactivité au stress post-partum et empêchent les adaptations de l’axe HPA maternel augmente la susceptibilité aux troubles neuropsychiatriques.

Pour élucider les effets du stress sur la dérégulation affective chez les mères et les nourrissons, plusieurs modèles de stress chez les rongeurs pendant la période péripartum ont été générés. La majorité de ces modèles sont caractérisés par l’application de facteurs de stress physiques qui entraînent des défis homéostatiques et des altérations de l’état physiologique de la mère⁹, tels que le stress de contention chronique¹⁰ et le stress de natation pendant la gestation¹¹, ou l’exposition au choc post-partum¹². Bien qu’il ait été démontré que ces paradigmes entraînent l’émergence de comportements dépressifs post-partum et des altérations des soins maternels^10,11,12, ils ont été limités par leur incapacité à capturer avec précision la nature psychosociale des facteurs de stress couramment vécus par les mères humaines. Cela devient particulièrement important lorsque l’on tente de révéler les conséquences neuroendocrines du stress chronique dans la période péripartum,^étantdonné que le traitement de différents types de facteurs de stress est censé être médié par divers réseaux neuronaux orchestrant l’activation de l’axe HPA 9 .

Afin de surmonter cette limitation, plusieurs groupes ont conçu des paradigmes de stress utilisant des insultes psychosociales ou une combinaison de facteurs de stress physiques et psychosociaux. Le modèle de séparation maternelle, où les mères sont séparées de ses petits pendant plusieurs heures par jour pendant la période post-partum^13,14, et le modèle de stress social chronique, où les mères sont exposées à un intrus mâle en présence de leurs portées 15^,16, ont pu reproduire l’émergence d’anomalies dans les soins maternels et de phénotypes dépressifs associés aux paradigmes de stress physique. Le paradigme du stress ultramilde chronique, où les souris femelles enceintes sont exposées à une variété d’insultes psychosociales, y compris l’inclinaison de la cage et l’éclairage pendant la nuit, ainsi que des insultes physiologiques substantielles, telles que le stress de contention et la restriction alimentaire, a en outre révélé que l’exposition à une nature mixte de facteurs de stress entraîne des anomalies dans le comportement maternel, y compris des déficiences dans l’agressivité maternelle, ainsi que la dérégulation de l’activité circadienne de l’axe HPA^17,18. Conformément à ces résultats, un modèle alterné de stress de contention et de surpeuplement pendant la gestation entraîne une élévation des taux de corticostérone circadienne maternelle post-partum ainsi que des altérations des soins maternels, bien qu’aucune différence ne soit observée dans la réactivité de l’axe HPA après une exposition post-partum à de nouvelles insultes aiguës¹.

Une expansion de ce travail, générant un paradigme de stress gestationnel qui utilise de multiples insultes psychosociales présentées de manière imprévisible et minimise l’utilisation de facteurs de stress physiologiques. Des études ont déjà montré que ce paradigme du stress psychosocial chronique (SGS) entraîne le développement d’un dysfonctionnement de l’axe hpA maternel, y compris une réactivité accrue au stress au début de la période post-partum^19. Ces changements sont associés à des anomalies du comportement maternel, y compris des altérations de la qualité des soins maternels reçus par les chiots, et l’émergence de comportements anhédoniques et anxieux¹⁹, caractéristiques compatibles avec les troubles périnatals de l’humeur et de l’anxiété^20,21. De plus, le gain de poids de la progéniture diminue pendant la période postnatale suivant une exposition in utero au CGS^19,ce qui suggère que le CGS pourrait avoir des effets de programmation négatifs persistants chez les générations futures.

L’objectif du développement du paradigme CGS était d’utiliser principalement des facteurs de stress cliniquement pertinents, qui capturent avec précision le type, l’intensité et la fréquence des insultes souvent associées à la dérégulation neuroendocrinienne et au développement de troubles périnatals de l’humeur et de l’anxiété. Ici, l’étude fournit un protocole détaillé sur la façon de soumettre des souris femelles gravides à CGS, ainsi que des évaluations en aval qui peuvent être utilisées pour tester la validité du modèle.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux du Cincinnati Children’s Medical Center et étaient conformes aux directives des National Institutes of Health. L’accès ad libitum au chow et à l’eau standard des rongeurs a été fourni en tout temps aux souris, y compris pendant le paradigme CGS. Les souris ont été logées sur un cycle lumière-obscurité de 14 h/10 h (lumières à 06 h 00, sauf indication contraire (c.-à-d. exposition aux lumières pendant la nuit).

1. Préparation aux accouplements chronométrés

1. Au moins 2 semaines avant la mise en place des accouplements chronométrés, hébergez les souris femelles adultes ensemble dans une cage de souris standard (18,4 cm x 29,2 cm x 12,7 cm), quatre souris par cage. Étiquetez chaque souris femelle avec un numéro d’identification spécifique via une étiquette d’oreille.
   REMARQUE: Des souris femelles C57BL6 sans grossesse antérieure et âgées de 3 à 6 mois ont été utilisées pour ce protocole.
2. Au moins 1 semaine avant la mise en place d’accouplements chronométrés, hébergez individuellement les souris mâles adultes à utiliser pour l’accouplement.

2. Mise en place d’accouplements chronométrés

1. Mettez en place les accouplements chronométrés à 18:00 h. Prenez deux souris femelles et placez-les dans une cage qui contient une souris mâle logée individuellement. Séparez les accouplements chronométrés le lendemain matin à 08:00 h.

3. Vérification du bouchon copulatoire, désigné comme jour gestationnel 0,5 (G0,5)

1. Immédiatement après avoir séparé les accouplements chronométrés, vérifiez la présence d’un bouchon copulatoire chez les souris femelles. La présence d’un bouchon copulatoire marquera G0.5. Laissez la souris tenir la grille métallique à l’intérieur de la cage et soulevez-la doucement par la queue pour visualiser l’ouverture vaginale.
   REMARQUE: La présence d’un bouchon copulatoire indique qu’une activité sexuelle s’est produite, mais ne garantit pas une grossesse. Lorsque vous essayez de calculer le nombre de souris expérimentales nécessaires, attendez-vous à ce que 50% des souris soient branchées à partir d’accouplements chronométrés et à ce qu’une grossesse se bouche à une incidence de 60% à 70%.
2. Utilisez un simple examen visuel pour identifier la présence d’un bouchon copulatoire (une masse opaque blanchâtre durcie à l’intérieur ou légèrement saillante de l’ouverture vaginale). Si le bouchon copulatoire n’est pas facilement identifiable par un simple examen visuel, insérez doucement une sonde d’extrémité émoussée dans l’ouverture vaginale. Identifiez les bouchons situés plus en arrière dans le vagin par la résistance de l’insertion de la sonde.
3. Séparez les souris femelles avec des bouchons copulatoires et regroupez-les dans des cages à souris standard, 3 à 4 souris par cage.

4. Préparation au paradigme CGS

1. Assignez au hasard des cages hébergeant des souris femelles avec des bouchons copulatoires en deux groupes sur G5.5: groupe témoin et groupe CGS. Essayez de randomiser les cages pour avoir un nombre approximativement égal de souris par groupe. Transférez les souris dans des cages de souris standard et étiquetez avec un signe « ne pas déranger ». Désignez ces cages comme des « cages domestiques » pour les souris afin de les placer à la fin de chaque facteur de stress.
2. Désignez une pièce séparée dans la fonction de souris pour exécuter le paradigme CGS. Concevoir un régime de stress de 11 jours, qui va de G6.5 à G17.5, pour utiliser chacun des facteurs de stress de 7 jours [exposition à des corps étrangers (billes ou legos), exposition aux odeurs de prédateurs (literie sale pour rats), cage inclinable à 30 °, changements fréquents de literie, retrait de la literie, mouvement sur le shaker] deux fois par jour, et utiliser chacun des 3 facteurs de stress nocturnes (lumières de nuit allumées, changement de compagnon de cage, exposition à la litière humide) pendant la nuit de manière aléatoire. Pour un exemple possible de calendrier et de schéma des expériences décrites ci-dessous, voir la figure 1.
   REMARQUE: Chaque facteur de stress quotidien doit se situer dans le cycle de lumière des souris (lumières sur 06:00 h-20:00 h), et durer 2 h, avec au moins une pause de 2 h entre les facteurs de stress. Chaque facteur de stress nocturne doit être mis en place au début du cycle d’obscurité (lumières éteintes 20:00 h) et séparé au début du cycle de lumière (lumières à 06:00 h).

5. Exécution du paradigme CGS

1. Installez des facteurs de stress spécifiques sur une cage statique standard avec dessus filtré et bouteille d’eau dans la pièce désignée pour le paradigme CGS. Préparez le nombre de cages statiques nécessaires à l’expérience en fonction du nombre de cages de souris désignées pour subir le CGS pendant la randomisation. Avant de commencer chaque facteur de stress, transférez les cages de souris du groupe CGS de la salle de logement à la salle CGS.
   REMARQUE: Effectuer la manipulation / transfert de souris de la cage domestique à la cage expérimentale et de retour dans des hottes à flux laminaire.
2. Appliquez les facteurs de stress suivants selon le schéma préconstité (voir l’étape 4.2).
   1. Exposition à des corps étrangers (billes ou legos): Placez six billes (14 mm de diamètre) ou six legos (de formes différentes, ne dépassant pas 4 cm de hauteur) répartis au hasard dans une cage statique propre avec litière de souris, sans inclure les oisillons de souris. Placez les souris avec leurs homologues de la cage domestique dans la cage statique avec des corps étrangers pendant 2 h. Retournez les souris dans leur cage d’origine avec les mêmes homologues à la fin du facteur de stress.
      REMARQUE: Nettoyez les corps étrangers après utilisation.
   2. Exposition aux odeurs de prédateurs (litière de rats sales) : Placez 1 cm de profondeur de litière de rats fraîchement sales de rats femelles dans une cage statique propre sans litière de souris, sans inclure les oisillons de souris. Placez les souris avec leurs homologues de la cage domestique dans la cage statique avec de la litière de rat sale pendant 2 h. Retournez les souris dans leur cage d’origine avec les mêmes homologues à la fin du facteur de stress.
   3. Inclinaison de la cage à 30 °: Placez les souris avec leurs homologues de la cage domestique dans une cage statique propre avec litière de souris, sans inclure les oisillons de souris. Inclinez la cage à 30° contre le mur pendant 2 h. Retournez les souris dans leur cage d’origine avec les mêmes homologues à la fin du facteur de stress.
   4. Changements fréquents de litière: Placez les souris avec leurs homologues de cage domestique dans une cage statique propre avec litière de souris, sans inclure les niches de souris. Remplacez la litière de la souris par une literie de souris propre toutes les 10 minutes pendant 2 h. Lors des changements de litière de la souris, placez doucement les souris dans une cage propre différente pour éviter tout contact direct avec les souris. Retournez les souris dans leur cage d’origine avec les mêmes homologues à la fin du facteur de stress.
   5. Enlèvement de la litière: Placez les souris avec leurs homologues de la cage domestique dans une cage statique propre et vide (sans litière de souris ni oisillons) pendant 2 h. Retournez les souris dans leur cage d’origine avec les mêmes homologues à la fin du facteur de stress.
   6. Mouvement sur le shaker: Placez les souris avec leurs homologues de la cage domestique dans une cage statique propre avec litière de souris, sans inclure les oisillons de souris. Placez la cage statique sur un agitateur de laboratoire réciproque réglé sur 140 coups par minute pendant 2 h. Retournez les souris dans leur cage d’origine avec les mêmes homologues à la fin du facteur de stress.
   7. Exposition nocturne aux lumières: Placez les souris avec leurs homologues de la cage domestique dans une cage statique propre avec litière de souris, sans inclure les oisillons de souris. Gardez les lumières allumées pendant la nuit (20:00 h-06:00 h) pour interférer avec le cycle sombre. Retournez les souris dans leur cage d’origine avec les mêmes homologues à la fin du facteur de stress.
   8. Changement de compagnon de cage: Transférez la souris dans une cage statique propre avec une litière de souris qui est logée par un groupe différent de deux souris femelles (femelles intactes ne faisant pas partie du traitement ou du groupe témoin). Gardez la souris dans la cage statique avec des compagnons de cage inconnus pendant la nuit. Retournez la souris dans sa cage d’origine avec ses homologues de cage d’accueil spécifiques à la fin du facteur de stress.
   9. Exposition à la litière humide : Remplissez la cage statique avec de la litière pour souris avec de l’eau propre maintenue à 24 °C jusqu’à ce que la litière soit saturée d’eau. Placez les souris avec leurs homologues de la cage domestique dans la cage statique avec une litière humide pendant la nuit. Retournez les souris dans leur cage d’origine avec les mêmes homologues à la fin du facteur de stress.
3. Pendant le paradigme CGS, gardez les souris témoins intactes dans leurs cages domestiques à l’intérieur de la pièce de logement.
4. Remplacez les cages domestiques usagées par de nouvelles cages domestiques sur G10.5. Sur G17.5, à la fin du facteur de stress de nuit, une seule fois toutes les souris expérimentales pour se préparer à la parturition et aux évaluations fonctionnelles en aval.

6. Surveillance des souris expérimentales pendant le paradigme CGS

1. Surveillez les souris toutes les 1 h pendant l’application du facteur de stress, sauf pendant les facteurs de stress pendant la nuit.
2. Exclure les souris présentant des signes de détresse, y compris des plaies, une léthargie ou toute anomalie physique de l’expérience. Communiquez avec le personnel vétérinaire au besoin.

7. Mesure du pourcentage de gain de poids corporel pendant la gestation chez les souris expérimentales (facultatif)

1. Sur G6.5, peser les souris individuellement avant l’exposition aux facteurs de stress. Sur G17.5, à la fin du facteur de stress pendant la nuit, peser les souris individuellement. Peser les souris témoins aux points de temps gestationnels équivalents.
2. Mesurez le pourcentage de gain de poids corporel pendant la gestation en fixant le poids du premier jour du paradigme CGS (G6.5) à 100%.

8. Mesure du poids relatif des glandes surrénales post-partum chez des souris expérimentales (facultatif)

1. Le jour 2 post-partum (PP2), pesez individuellement le contrôle et les barrages CGS. Euthanasier les barrages par inhalation de dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale dans une hotte aspirante.
2. Placez les souris sur une plaque de dissection, stérilisez la région abdominale avec 70% d’éthanol et ouvrez la cavité abdominale à l’aide de ciseaux pour faire une coupe verticale. Isoler les glandes surrénales situées à côté du pôle antérieur des reins avec une pince, bilatéralement. Disséquez soigneusement le tissu adipeux entourant les glandes surrénales sous un microscope à dissection.
3. Peser les glandes surrénales bilatérales individuellement. Calculer le poids relatif des glandes surrénales en milligrammes par gramme (poids total des glandes surrénales droite et gauche / poids corporel).

9. Mesure de l’activité de l’axe hypothalamique post-partum hypophysaire surrénalien (HPA) chez les souris expérimentales (facultatif)

1. En préparation des mesures de l’axe HPA, euthanasier les portées à 6 petits par portée le jour 0 post-partum (PP0). Utilisez l’inhalation de dioxyde de carbone, suivie d’une décapitation avec des ciseaux chirurgicaux comme méthode secondaire d’euthanasie.
2. Le jour 2 post-partum (PP2), retenez individuellement la commande et les barrages CGS à l’intérieur d’un tube conique en polypropylène de 50 mL bien ventilé pendant 20 minutes. Immédiatement après le stress de contention, retirez la souris du tube conique et retenez la souris avec la main non dominante en tenant la peau lâche sur les épaules et postérieurement aux oreilles pour que la peau sur la mandibule se tende.
3. Perforez la veine sous-maxillaire avec une lancette légèrement derrière la mandibule mais antérieure au conduit auditif. Prélever jusqu’à 100 μL de sang maternel dans un tube séparateur de sérum. Après le prélèvement de l’échantillon, appliquez une légère pression avec de la gaze sur le site de ponction pour arrêter le saignement. Retournez les barrages dans la cage de la maison une fois que le saignement s’arrête.
4. Centrifugez le tube séparateur de sérum à 21 130 x g pendant 6 min et retirez soigneusement le sérum. Conservez le sérum à -20 °C pour une utilisation ultérieure. Mesurer la concentration sérique de corticostérone à l’aune d’un kit ELISA en suivant le protocole du fabricant.

10. Mesure des changements de comportement post-partum chez les souris expérimentales (facultatif)

1. Pour se préparer à l’analyse comportementale, abattage des portées à 6 petits par portée sur PP0.
2. Effectuer une analyse de la fragmentation des soins maternels de PP2 à PP5. Chaque jour, pendant le cycle de lumière, exposez les barrages à la salle de test pendant une période d’accoutumant de 5 minutes avant de filmer le comportement maternel pendant une période de 30 minutes.
   1. Évaluer la fragmentation des soins maternels en mesurant la durée moyenne d’un combat individuel de léchage/toilettage et le nombre total d’épisodes effectués par les mères¹⁹.
      REMARQUE: Le comportement de léchage / toilettage est défini comme un comportement où la mère entre en contact avec le corps du chiot avec sa langue, ou le chiot est manipulé par la mère avec ses avant-deux. Un combat est défini comme une période ininterrompue où la mère est engagée dans le léchage / toilettage de ses chiots.
3. Effectuer une analyse de l’anhédonie via le test de préférence au saccharose (SPT) de PP0 à PP6. Exposez les barrages à une bouteille d’eau propre de 100 mL et à une bouteille de 100 ml de solution de saccharose à 4 % dans leur cage domestique. Mesurer la quantité d’eau et de saccharose consommée (en mL) quotidiennement. Échangez le placement de la bouteille dans la cage de la maison. Calculer la préférence saccharose en utilisant les moyennes des 4 derniers jours: préférence % = [(consommation de saccharose / saccharose + consommation d’eau) x 100].
4. Effectuer une analyse du comportement anxieux via un labyrinthe zéro élevé (EZM) sur PP8. Placez les barrages individuellement sur l’appareil EZM composé de deux quadrants fermés et de deux quadrants ouverts surélevés du sol. Laissez les barrages explorer le labyrinthe sans être dérangés pendant 5 min. Quantifiez le temps passé dans le quadrant ouvert et le nombre d’entrées dans les quadrants ouverts.

11. Mesure des changements de poids de la progéniture postnatale (facultatif)

1. Pour préparer l’analyse du poids de la progéniture, abattage des portées à 6 petits par portée le jour de la naissance (jour postnatal 0, PN0).
2. Enregistrez le poids des petits sur PN0 et à différents moments de la période postnatale (PN2, 7, 15, 21).

Résultats

L’exposition des souris femelles gravides au SNC entraîne des changements dans les paramètres liés au stress chronique, y compris une réduction du gain de poids corporel pendant la grossesse (Figure 2A) et une augmentation du poids des glandes surrénales au début de la période post-partum (Figure 2B)¹⁹. Il est important de savoir que l’exposition au SNC entraîne des anomalies post-partum de la fonction neuroendocrinienne mater...

Discussion

L’exposition des souris gravides au CGS perturbe la fonction neuroendocrinienne maternelle post-partum, y compris la réponse de l’axe HPA à de nouveaux facteurs de stress, et est associée à diverses anomalies comportementales pertinentes pour les troubles périnatals de l’humeur et de l’anxiété. Étant donné que le modèle utilise un facteur de risque environnemental, on s’attend à une variation phénotypique plus élevée que celle observée dans les modèles génétiques²². Né...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal lancet	Braintree Scientific Inc.	GR4MM
Blunt end probe	Fine Science Tools	10088-15	Used to check for copulatory plugs
Bottles for SPT	Braintree Scientific Inc.	WTRBTL S-BL	100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL.
Conical tubes (50 mL)	Corning Inc.	352098	Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation.
Legos	Amazon	-
Marbles	Amazon	-
Mouse Corticosterone ELISA kit	Biovendor	RTC002R
Mouse EZM	TSE Systems	-
Reciprocal laboratory shaker	Labnet international	S2030-RC-B
Serum separator tubes	Becton Dickinson	365967
Static cage- bottom	Alternative Design Manufacturing and Supply Inc.	RC71D-PC
Static cage - filtered ventilated tops	Alternative Design Manufacturing and Supply Inc.	FT71H-PC