Usando um modelo murino de estresse psicossocial na gravidez como um paradigma transcanalmente relevante para transtornos psiquiátricos em mães e bebês

Resumo

O paradigma do estresse psicossocial crônico (CGS) emprega estressores clinicamente relevantes durante a gravidez em camundongos para modelar transtornos psiquiátricos de mães e bebês. Aqui, fornecemos um procedimento passo-a-passo de aplicação do paradigma CGS e avaliações a jusante para validar esse modelo.

Resumo

O período peripartum é considerado um período sensível onde exposições maternas adversas podem resultar em consequências negativas a longo prazo tanto para a mãe quanto para os filhos, incluindo o desenvolvimento de distúrbios neuropsiquiátricos. Fatores de risco ligados ao surgimento da desregulação afetiva no díade materno-infantil têm sido extensivamente estudados. A exposição ao estresse psicossocial durante a gravidez tem emergido consistentemente como um dos preditores mais fortes. Vários modelos de roedores foram criados para explorar essa associação; no entanto, esses modelos dependem do uso de estressores físicos ou de um número limitado de estressores psicossociais apresentados de forma repetitiva, que não captam com precisão o tipo, intensidade e frequência de estressores experimentados pelas mulheres. Para superar essas limitações, foi gerado um paradigma de estresse psicossocial crônico (CGS) que emprega diversos insultos psicossociais de diferentes intensidades apresentados de forma imprevisível. O manuscrito descreve este novo paradigma CGS onde camundongos gestantes, do dia gestacional 6,5 a 17,5, são expostos a vários estressores durante o dia e durante a noite. Estressores diurnos, dois por dia separados por uma quebra de 2h, variam de exposição a objetos estranhos ou odor predador a mudanças frequentes na roupa de cama, remoção de roupa de cama e inclinação da gaiola. Os estressores durante a noite incluem exposição contínua à luz, troca de companheiros de gaiola ou roupas de cama molhadas. Já mostramos anteriormente que a exposição ao CGS resulta no desenvolvimento de anormalidades neuroendócrinas e comportamentais maternas, incluindo aumento da reatividade do estresse, o surgimento de padrões de cuidados maternos fragmentados, anedonia e comportamentos relacionados à ansiedade, características fundamentais de mulheres que sofrem de humor perinatal e transtornos de ansiedade. Este modelo CGS, portanto, torna-se uma ferramenta única que pode ser usada para elucidar defeitos moleculares subjacentes à desregulação afetiva materna, bem como mecanismos trans-placentários que impactam o neurodesenvolvimento fetal e resultam em consequências comportamentais negativas a longo prazo na prole.

Introdução

Os mecanismos subjacentes ao aumento da suscetibilidade a distúrbios neuropsiquiátricos em mães e bebês após exposições maternas adversas no período peripartum permanecem amplamente desconhecidos. Alterações fisiológicas maternas substanciais ocorrem durante a gravidez e a transição para o período pós-parto, incluindo várias adaptações neuroendócrinas que são hipóteses de serem críticas não apenas para o neurodesenvolvimento saudável da prole, mas também para a preservação da saúde mental materna^1,2. Ao nível do eixo adrenal hipotalâmico materno (HPA), observam-se adaptações nos níveis circadianos e induzidos pelo estresse da liberação glicocorticoide, incluindo um ritmo mais achatado da atividade do eixo HPA diurno e a resposta do eixo HPA amortecida aos estressores agudos^3,4,5. Dado que a atividade aprimorada do eixo HPA é relatada em um subconjunto de mulheres com desregulação afetiva pós-parto, incluindo aumento dos níveis de glicocorticoides circulantes e feedback negativo inibido^6,7,8, exposição a estressores que resultam em aumento da reatividade do estresse pós-parto e prevenção de adaptações maternas do eixo HPA são pensadas para aumentar a suscetibilidade a distúrbios neuropsiquiátricos.

Para elucidar os efeitos do estresse na desregulação afetiva em mães e bebês, vários modelos de rodent de estresse no período peripartum foram gerados. A maioria desses modelos é caracterizada pela aplicação de estressores físicos que resultam em desafios homeostáticos e alterações no estado fisiológico da barragem⁹, como estresse de contenção crônica¹⁰ e estresse na natação durante a gestação¹¹, ou exposição ao choque pós-parto¹². Embora esses paradigmas tenham sido demonstrados para resultar no surgimento de comportamentos depressivos pós-parto e alterações no cuidado materno^10,11,12, eles têm sido limitados por sua incapacidade de capturar com precisão a natureza psicossocial dos estressores comumente vivenciados pelas mães humanas. Isso se torna particularmente importante ao tentar revelar as consequências neuroendócrinas do estresse crônico no período peripartum, uma vez que o processamento de diferentes tipos de estressores é pensado para ser mediado por diferentes redes neurais orquestrando a ativação do eixo HPA⁹.

Para superar essa limitação, diversos grupos têm desenhado paradigmas de estresse empregando insultos psicossociais ou uma combinação de estressores físicos e psicossociais. O modelo de separação materna, onde as barragens são separadas de seus filhotes por várias horas por dia durante o período pós-parto^13,14, e o modelo crônico de estresse social, onde as barragens são expostas a um intruso masculino na presença de suas ninhadas^15,16, têm sido capazes de reproduzir o surgimento de anormalidades no cuidado materno e fenótipos depressivos associados a paradigmas de estresse físico. O paradigma crônico de estresse ultramamsário, onde camundongos gestantes são expostos a uma variedade de insultos psicossociais, incluindo inclinação de gaiola e iluminação noturna, bem como insultos fisiológicos substanciais, como estresse de contenção e restrição alimentar, revelou ainda mais exposição a uma natureza mista de estressores resulta em anormalidades no comportamento materno, incluindo prejuízos na agressão materna, bem como a desregulamentação na atividade circadiana do eixo HPA^17,18. Consistente com esses resultados, um modelo alternado de restrição e superlotação durante a gestação resulta em elevações nos níveis de corticosterona circadiana materna pós-parto, bem como alterações no cuidado materno, embora não sejam observadas diferenças na re-atividade do eixo HPA após a exposição pós-parto a novos insultos agudos¹.

Uma expansão desse trabalho, gerando um paradigma de estresse gestacional que emprega múltiplos insultos psicossociais apresentados de forma imprevisível e minimiza o uso de estressores fisiológicos. Estudos já mostraram anteriormente que esse paradigma de estresse psicossocial crônico (CGS) resulta no desenvolvimento da disfunção do eixo HPA materno, incluindo maior reatividade do estresse no início do pós-parto¹⁹. Essas alterações estão associadas a anormalidades no comportamento materno, incluindo alterações na qualidade da assistência materna recebida pelos filhotes, e o surgimento de comportamentos anedônicos e parecidos com ansiedade¹⁹, características consistentes com o humor perinatal e transtornos de ansiedade^20,21. Além disso, o ganho de peso dos filhos reduz durante o período pós-natal após a exposição no útero ao CGS^19,sugerindo que o CGS pode ter efeitos de programação negativa persistentes nas gerações futuras.

O objetivo no desenvolvimento do paradigma CGS foi utilizar principalmente estressores clinicamente relevantes, que capturam com precisão o tipo, intensidade e frequência de insultos frequentemente associados à disregulação neuroendócrina e ao desenvolvimento de transtornos de humor perinatal e ansiedade. Aqui, o estudo fornece um protocolo detalhado de como submeter camundongos gestantes ao CGS, bem como avaliações a jusante que podem ser usadas para testar a validade do modelo.

Protocolo

Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico Infantil de Cincinnati e estavam de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde. O acesso ad libitum à comida de roedor padrão e água era fornecido o tempo todo aos ratos, inclusive durante o paradigma CGS. Os ratos estavam alojados em um ciclo claro-escuro de 14 h/10 h (luzes em 06:00 h) a menos que especificado de outra forma (ou seja, exposição a luzes durante a noite).

1. Preparação para acasalamento cronometrado

1. Pelo menos 2 semanas antes de configurar acasalamentos cronometrados, abrigam os camundongos adultos juntos em uma gaiola padrão de rato (18,4 cm x 29,2 cm x 12,7 cm), quatro ratos por gaiola. Rotule cada rato feminino com um número de identificação específico através de uma tag de ouvido.
   NOTA: Foram utilizados para este protocolo camundongos fêmeas C57BL6 sem gravidez prévia e entre 3 a 6 meses de idade.
2. Pelo menos uma semana antes de configurar acasalamentos cronometrados, abriga individualmente os ratos machos adultos para serem usados para acasalamento.

2. Configuração de acasalamentos cronometrado

1. Configure os acasalamentos cronometrado às 18:00 h. Pegue duas fêmeas e coloque-as dentro de uma gaiola que segura um rato macho alojado individualmente. Separe os acasalamentos cronometrados na manhã seguinte às 08:00 h.

3. Verificando o plugue copulatório, designado como dia gestacional 0.5 (G0.5)

1. Imediatamente após a separação de acasalamento cronometrado, verifique a presença de um plugue copulatório nos camundongos fêmeas. A presença de um plugue copulatório marcará G0.5. Deixe o mouse segurar a grade de arame dentro da gaiola e levante-a suavemente pela cauda para visualizar a abertura vaginal.
   NOTA: A presença de um plugue copulatório indica que a atividade sexual ocorreu, mas não garante uma gravidez. Ao tentar calcular o número de camundongos experimentais necessários, espere que 50% dos camundongos sejam plugados a partir de acasalamentos cronometrados e uma gravidez para cobrir a incidência de 60%-70%.
2. Use um exame visual simples para identificar a presença de um plugue copulatório (uma massa esbranquiçada opaca dentro ou ligeiramente salientes da abertura vaginal). Se o plugue copulatório não for facilmente identificado por um simples exame visual, insira suavemente uma sonda final cega na abertura vaginal. Identifique os plugues localizados mais atrás na vagina pela resistência da inserção da sonda.
3. Separe os camundongos fêmeas com plugues copulatórios e casa de grupo em gaiolas de rato padrão, 3 a 4 ratos por gaiola.

4. Preparação para o paradigma CGS

1. Atribua aleatoriamente gaiolas que abrigam camundongos fêmeas com plugues copulatórios em dois grupos no G5.5: Control e CGS group. Tente randomizar gaiolas para ter um número aproximadamente igual de ratos por grupo. Transfira os ratos para limpar gaiolas padrão do mouse e rotule com um sinal de "não perturbe". Designar essas gaiolas como "gaiolas domésticas" para os ratos colocá-las no final de cada estressor.
2. Designe uma sala separada na instalação do mouse para executar o paradigma CGS. Projete um regime de estressor de 11 dias, que vai de G6.5 a G17.5, para utilizar cada um dos estressores de 7 dias [exposição a objetos estranhos (mármores ou legos), exposição ao odor predador (roupa de rato suja), inclinação de gaiola de 30°, mudanças frequentes de roupa de cama, remoção de roupa de cama, movimento no shaker] duas vezes por dia, e para utilizar cada um dos 3 estressores noturnos (luzes noturnas acesas, mudança companheiro gaiola, exposição à roupa de cama molhada) durante a noite de uma forma aleatória. Para obter um possível cronograma amostral e um esquema de experimentos descritos abaixo, consulte a Figura 1.
   NOTA: Cada dia o estressor deve cair dentro do ciclo de luz dos ratos (luzes em 06:00 h-20:00 h), e durar 2 horas, com pelo menos uma pausa de 2 horas entre os estressores. Cada estressor noturno deve ser configurado no início do ciclo escuro (luzes apagadas 20:00 h) e separado no início do ciclo de luz (luzes acesas às 06:00 h).

5. Executando o paradigma CGS

1. Configure estressores específicos em uma gaiola estática padrão com parte superior filtrada e garrafa de água na sala designada para o paradigma CGS. Prepare o número de gaiolas estáticas necessárias para o experimento, dependendo do número de gaiolas de rato designadas para serem submetidas a CGS durante a randomização. Antes de iniciar cada estressor, transfira as gaiolas do mouse do grupo CGS da sala de alojamento para a sala CGS.
   NOTA: Realize o manuseio/transferência de ratos da gaiola doméstica para gaiola experimental e de volta em capô de fluxo laminar.
2. Aplique os seguintes estressores de acordo com o regime pré-projetado (consulte a etapa 4.2).
   1. Exposição a objetos estranhos (mármores ou legos): Coloque seis bolinhas de gude (14 mm de diâmetro) ou seis legos (diferentes formas, não excedendo 4 cm de altura) distribuídos aleatoriamente em uma gaiola estática limpa com roupa de cama de rato, sem incluir os filhotes de rato. Coloque os ratos junto com suas contrapartes da gaiola doméstica na gaiola estática com objetos estranhos por 2 h. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
      NOTA: Limpe os objetos estranhos após o uso.
   2. Exposição ao odor predador (roupa suja de rato): Coloque 1 cm em profundidade de cama de rato sujo fresco de ratos fêmeas em uma gaiola estática limpa sem cama de rato, sem incluir os filhotes de rato. Coloque os ratos junto com suas contrapartes da gaiola doméstica na gaiola estática com roupa de cama suja de rato por 2h. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
   3. Inclinação da gaiola de 30°: Coloque os ratos com suas contrapartes da gaiola em casa em uma gaiola estática limpa com roupa de cama do mouse, sem incluir os filhotes de rato. Incline a gaiola a 30° contra a parede por 2h. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
   4. Mudanças frequentes de roupa de cama: Coloque os ratos com suas contrapartes da gaiola doméstica em uma gaiola estática limpa com roupa de cama de rato, sem incluir os filhotes de rato. Substitua a cama do rato por roupa de cama de rato limpo a cada 10 minutos por 2 h. Durante as trocas de cama do mouse, coloque delicadamente os ratos em uma gaiola limpa diferente para evitar contato direto com os ratos. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
   5. Remoção de roupa de cama: Coloque os ratos junto com seus homólogos da gaiola doméstica em uma gaiola estática limpa vazia (sem cama de rato ou nestlets) por 2h. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
   6. Movimento no shaker: Coloque os ratos com suas contrapartes da gaiola em casa em uma gaiola estática limpa com roupa de cama do mouse, sem incluir os filhotes de rato. Coloque a gaiola estática em cima de um agitador de laboratório recíproco definido para 140 tacadas por minuto por 2 h. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
   7. Exposição noturna às luzes: Coloque os ratos com suas contrapartes da gaiola em casa em uma gaiola estática limpa com roupa de cama do rato, sem incluir os filhotes de rato. Mantenha as luzes acesas durante a noite (20:00 h-06:00 h) para interferir com o ciclo escuro. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
   8. Mudança do companheiro de gaiola: Transfira o rato para uma gaiola estática limpa com roupa de cama de rato que está sendo alojada por um grupo diferente de duas fêmeas (fêmeas intactas que não fazem parte do tratamento ou grupo controle). Mantenha o rato na gaiola estática com companheiros de gaiola desconhecidos durante a noite. Devolva o mouse para sua gaiola doméstica com suas contrapartes específicas da gaiola doméstica na conclusão do estressor.
   9. Exposição à roupa de cama molhada: Encha a gaiola estática com cama de rato com água limpa mantida a 24 °C até que a cama esteja saturada de água. Coloque os ratos junto com suas contrapartes da gaiola doméstica na gaiola estática com roupas de cama molhadas durante a noite. Devolva os ratos para sua gaiola com as mesmas contrapartes na conclusão do estressor.
3. Durante o paradigma CGS, mantenha os ratos de controle imperturbáveis em suas gaiolas dentro da sala de alojamento.
4. Substitua as gaiolas domésticas usadas por novas gaiolas domésticas no G10.5. No G17.5, ao final do estressor noturno, abrigam todos os ratos experimentais para se prepararem para a parturição e avaliações funcionais a jusante.

6. Monitoramento dos camundongos experimentais durante o paradigma CGS

1. Monitore os camundongos a cada 1h durante a aplicação do estressor, exceto durante a noite.
2. Exclua os camundongos que exibem sinais de socorro, incluindo feridas, letargia ou qualquer anormalidade física do experimento. Entre em contato com a equipe veterinária conforme necessário.

7. Medir o ganho percentual de peso corporal durante a gestação nos camundongos experimentais (opcional)

1. No G6.5, pese os camundongos individualmente antes da exposição aos estressores. No G17.5, ao final do estressor noturno, pesam os ratos individualmente. Pesar os camundongos de controle nos pontos de tempo gestacionais equivalentes.
2. Meça o ganho percentual de peso corporal durante a gestação, definindo o peso do primeiro dia do paradigma CGS (G6.5) em 100%.

8. Medir os pesos da glândula suprarrenal relativa pós-parto em camundongos experimentais (opcional)

1. No pós-parto dia 2 (PP2), pese o controle e as barragens cgs individualmente. Eutanize as barragens por inalação de dióxido de carbono seguida de deslocamento cervical em um capô de fumaça.
2. Coloque os camundongos em uma placa de dissecção, esterilize a área abdominal com 70% de etanol e abra a cavidade abdominal usando uma tesoura para fazer um corte vertical. Isole as glândulas suprarrenais localizadas adjacentes ao polo anterior dos rins com fórceps, bilateralmente. Dissecar cuidadosamente o tecido adiposo ao redor das glândulas suprarrenais sob um microscópio dissecando.
3. Pesar as glândulas suprarrenais bilaterais individualmente. Calcule os pesos relativos da glândula suprarrenal em miligramas por grama (peso total das glândulas suprarrenais direitas e esquerdas/peso corporal).

9. Medir a atividade do eixo adrenal hipotálamo hipotálamo pós-parto (HPA) nos camundongos experimentais (opcional)

1. Em preparação para as medições do eixo HPA, eutanize ninhadas a 6 filhotes por ninhada no pós-parto dia 0 (PP0). Use inalação de dióxido de carbono, seguida de decapitação com tesoura cirúrgica como método secundário de eutanásia.
2. No pós-parto dia 2 (PP2), contenha individualmente o controle e as barragens CGS dentro de um tubo cônico de polipropileno bem ventilado de 50 mL por 20 minutos. Imediatamente após o estresse de contenção, remova o rato do tubo cônico e contenha o rato com a mão não dominante segurando a pele solta sobre os ombros e posterior para as orelhas para ter a pele sobre a mandíbula esticada.
3. Puna a veia submandibular com uma lanceta ligeiramente atrás da mandíbula, mas anterior ao canal auditivo. Coletar até 100 μL de sangue materno em um tubo separador de soro. Após a coleta da amostra, aplique pressão suave com gaze no local da punção para parar o sangramento. Devolva as barragens para a gaiola quando o sangramento parar.
4. Centrifugar o tubo separador de soro a 21.130 x g por 6 min e remover cuidadosamente o soro. Armazene o soro a -20 °C para uso posterior. Meça a concentração de corticosterona sérico por um kit ELISA seguindo o protocolo do fabricante.

10. Medir as mudanças comportamentais pós-parto nos camundongos experimentais (opcional)

1. Para se preparar para a análise comportamental, o abate de ninhadas para 6 filhotes por ninhada em PP0.
2. Realizar a análise da fragmentação do cuidado materno do PP2 ao PP5. Em cada dia, durante o ciclo de luz, expõe as barragens à sala de testes por um período de 5 minutos de habituação antes de filmar o comportamento materno por um período de 30 minutos.
   1. Avalie a fragmentação do cuidado materno medindo o comprimento médio de uma luta individual de lambida/preparação e o número total de ataques realizados pelas barragens¹⁹.
      NOTA: O comportamento de lambida/limpeza é definido como um comportamento onde a represa está fazendo contato com o corpo do filhote com a língua, ou o filhote está sendo manuseado pela represa com suas patas dianteiras. Um ataque é definido como um período ininterrupto de tempo onde a represa está engajada na lambida/preparação de seus filhotes.
3. Realizar análise de anedonia via teste de preferência de sacarose (SPT) do PP0 ao PP6. Exponha as barragens a uma garrafa de 100 mL de água limpa e uma garrafa de 100 mL de solução de sacarose de 4% em sua gaiola doméstica. Meça a quantidade de água e sacarose consumidas (em mL) diariamente. Intercambie a colocação da garrafa na gaiola. Calcule a preferência de sacarose utilizando as médias dos últimos 4 dias: preferência % = [(consumo de sacarose / sacarose + consumo de água) x 100].
4. Realize a análise do comportamento semelhante à ansiedade através de um labirinto zero elevado (EZM) em PP8. Coloque as barragens individualmente no aparelho EZM composto por dois quadrantes fechados e dois quadrantes abertos elevados do chão. Permita que as barragens explorem o labirinto sem ser incomodado por 5 minutos. Quantifique o tempo gasto no quadrante aberto e o número de entradas nos quadrantes abertos.

11. Medir as alterações do peso da prole pós-natal (opcional)

1. Para se preparar para a análise do peso da prole, o abate de ninhadas para 6 filhotes por ninhada no dia do nascimento (pós-natal dia 0, PN0).
2. Registo o peso dos filhotes em PN0 e em diferentes pontos de tempo durante o pós-natal (PN2, 7, 15, 21).

Resultados

Expor os camundongos gestantes ao CGS resulta em alterações nos parâmetros crônicos de estresse relevantes, incluindo a redução do ganho de peso corporal durante a gravidez (Figura 2A) e o aumento dos pesos da glândula suprarrenal no período pós-parto(Figura 2B)¹⁹. É importante ressaltar que a exposição ao CGS resulta em anormalidades pós-parto na função neuroendócrina materna. As barragens CGS exibem um eixo HPA hiperativ...

Discussão

Expor os camundongos gestantes à CGS perturba a função neuroendócrina materna pós-parto, incluindo a resposta do eixo HPA a novos estressores, e está associada a várias anormalidades comportamentais relevantes para o humor perinatal e transtornos de ansiedade. Dado que o modelo emprega a utilização de um fator de risco ambiental, espera-se maior variação fenotípica do que observada de outra forma nos modelos genéticos²². No entanto, os resultados obtidos a partir da aplicação do par...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal lancet	Braintree Scientific Inc.	GR4MM
Blunt end probe	Fine Science Tools	10088-15	Used to check for copulatory plugs
Bottles for SPT	Braintree Scientific Inc.	WTRBTL S-BL	100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL.
Conical tubes (50 mL)	Corning Inc.	352098	Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation.
Legos	Amazon	-
Marbles	Amazon	-
Mouse Corticosterone ELISA kit	Biovendor	RTC002R
Mouse EZM	TSE Systems	-
Reciprocal laboratory shaker	Labnet international	S2030-RC-B
Serum separator tubes	Becton Dickinson	365967
Static cage- bottom	Alternative Design Manufacturing and Supply Inc.	RC71D-PC
Static cage - filtered ventilated tops	Alternative Design Manufacturing and Supply Inc.	FT71H-PC