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要約

非ヒト霊長類(NHP)は、解剖学的および遺伝的類似性によるヒトの細胞疾患治療を研究するための理想的なモデルである。本稿では、NHP眼における網膜色素上皮細胞の脳下移植法と、黄斑操作に伴う術中合併症を予防するための戦略を記載する。

要約

網膜色素上皮(RPE)移植は、遺伝性および取得した網膜変性疾患の治療に大きな約束を果たす。これらの条件には、網膜色素変性症(RP)および地理的萎縮(GA)などの加齢黄斑変性症(AMD)の高度な形態が含まれる。一緒に、これらの障害は、世界的に現在治療不可能な失明のかなりの割合を表しています。これらの満たされていない医療ニーズは、RPE交換の方法を開発する上で学術的関心を高めています。治療の前臨床試験のために一般的に利用される動物モデルの中で、非ヒト霊長類(NHP)は黄斑を有する唯一の動物モデルである。この解剖学的類似性を人間の目と共有するので、NHPアイはRPE細胞療法などの高度な治療薬用製品(ATMPs)の開発のための重要かつ適切な前臨床動物モデルです。

本稿は、ポリエチレンテレフタレート(PET)細胞担体上で培養された、免疫抑制されたNHPで外科的に作成されたRPE創傷に対する、単層RPEの過角移植法を説明する。黄斑の中央血管部分の窩は、移植中の機械的弱さの部位である。最初の皮下液注入が、レティナに過剰な力を発生させると、前頭外傷が起こる。したがって、過フルオロカーボン液体(PFCL)の下での遅い注入は、低眼圧(IOP)設定で二重ボアの亜レチナル注入カニューレで、レチナルブレブを作成することが推奨される。

パラフォベアルRPE-光受容体癒着を放出するビトリアルプラスミノーゲン注射による前処理も推奨される。これらの組み合わせ戦略は、従来の技術と比較して、頭葉涙の可能性を減らすことができます。NHPはRPE細胞療法の前臨床段階の主要な動物モデルである。このプロトコルは、NHPの眼でのRPE細胞療法の提供に関連する技術的な課題に対処します。

概要

RPE移植は、遺伝性および取得したレチナル変性疾患の治療に大きな約束を果たす。これらの状態は、網膜色素変性症(RP、ロッドコーンジストロフィー)およびGAのようなAMDの高度な形態を含むが、これらの障害は、世界的に現在治療不可能な失明の有意な割合を表す1,2。AMDの高度な段階は、新血管AMD(nAMD)およびGAに分類される。抗血管内皮増殖因子(抗VEGF)注射などのnAMDには有効な治療選択肢があるが、GA患者は治療選択肢が限られている。RPは、進行性のレチン性光受容体変性を特徴とする遺伝性のレチン性疾患の非常に不均一なグループである。一部の患者では、原因となる遺伝的欠陥は、光受容体ではなくRPE内に位置しています。したがって、RPE補充療法は、遺伝子治療が実現不可能な場合の代替戦略である可能性があります。

これらの条件に対する効果的な治療法の開発には大きな関心があります。特に、RPE移植は、治療アプローチの可能性3,4,5,6,7,8として牽引力を得ています。RPE移植に関する最初の報告が1980s9に登場して以来、この分野は様々なRPE細胞源、送達戦略、および疾患および移植の実験モデル10、11、12、13、14を含むように拡大しました。様々な動物モデルの中で、NHPだけが人間と共有するレチナの後極で解剖学的専門である「窩中枢」を持つ「黄斑ルテア」を持っています。この窩は、高解像中心視器15を可能にする非常に高密度の錐体光受容体を含む。NHPはまた、人間と比較して同様のゲノムおよびプロテオミクスメイクアップ16を有する。これらの類似性は、ヒトretina17,18に影響を与える眼疾患の研究のための重要かつ適切な動物モデルにします。

本稿は、免疫抑制されたNHPにおけるPET細胞担体によって支持されるRPE異種移植片の下角移植法を記載する。ウサギにおける腎皮下RPE移植のための経ビトリアルな技術が、前の原稿19に記載されている。しかし、NHPでは、病巣の存在は、術中操作20中に特定のケアを必要とする。特に、retina20に過剰な力を発生させる亜レチン流体注入法の場合、頭葉涙のリスクが高い。したがって、この原稿の焦点は、NHPにおける不注意な頭気の外傷のリスクを減らすための戦略です。

これらには、卵胞解剖学のリアルタイム可視化のためのパラFOVE膜接着および手術用顕微鏡統合光学コヒーレンス断層撮影(miOCT)の放出のための術前体内プラスミノーゲン注射の使用が含まれる。低いIOP設定の下で眼内PFCLタンポネードを用いるカスタムメイドの25/41 Gデュアルボア網膜カニューレは、より制御された眼窩剥離のプロセスを可能にするために提案される。さらに、移植されたRPE細胞と宿主感光体との間のより良い統合を可能にするために、移植前にネイティブRPEの外科的除去が推奨される。最後に、NHPモデルの周回および術後の全身免疫抑制プロトコルが、RPE異種移植後の生存率を向上させると記載されている11,21。

プロトコル

注:すべての動物実験は、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚・眼科研究協会(ARVO)に従って行われました。シンガポールのSingHealthの施設動物管理使用委員会から倫理の承認を得ました。動物は、実験動物ケアの評価と認定協会(AAALAC)によって承認されたSingHealth実験医学センターに収容されました。この承認は、すべての動物実験がシンガポールのアグリ食品獣医局が定めた国立実験動物研究諮問委員会のガイドラインの基準に準拠していることを強調しています。以下の実験プロトコルは、6 マカカのファシキュラリス (4雄と2人の女性、4〜6歳、2.8〜4.0キロ)の6目で行われた実験に基づいて確立された 。

1. NHPモデルにおける免疫抑制の実現

  1. 手術の7日前に免疫抑制を開始し、フォローアップ期間を通して免疫抑制を継続します。
  2. 正確な投薬量を確保するために、全身性免疫抑制の投与前にNHPを比較検討してください。動物はベースラインで重量を量り、その後毎週体重を量る。
  3. 全身性免疫抑制を達成するために経口シロリムス、ドキシサイクリン、およびミノサイクリンを使用してください。
    1. 1 mg の毎日の維持投与に続いて経口シロリムスの 2 mg の負荷量を投与します。.投与前にベースライン血液シロリムスレベルを取得し、フォローアップ期間を通じてこれを監視します。適切な免疫抑制のために、少なくとも5μg/Lの濃度を確保してください。
      注:シロリムス用量は体重適応ではありません。
    2. 1日あたり7.5mg/kgの経口ドキシサイクリンを1日2回投与する。
    3. 1日あたり7.5mg/kgの経口ミノサイクリンを投与し、1日に2回投与する。
  4. 免疫抑制の間、すべてのNHPに有害な全身効果を監視します。体重の大幅な減少(>10%)、食欲と水の消費量の減少、手入れの行きのない脱毛、攻撃性や無気力などの異常な行動を探してください。評価は3日目、14日、1ヶ月に行われ、その後毎月の評価が行われます。

2. 器械の殺菌

  1. 蒸留水を使用して手術器具をすすいでください。
  2. 500 mLの蒸留水と2 mLの器械消毒剤で満たされた超音波浴に器械を置く。超音波浴のスイープ機能を使用して15分間、器具を清掃してください。
  3. 超音波浴から器具を取り外します。蒸留水を2回徹底して、各洗い流しを5分間洗い流します。すすがりの後に器具を空気乾燥させます。
  4. 計器を計器ボックスに入れます。ユニバーサルプログラム設定(134°Cで50分間の器具の滅菌:オートクレーブ用30分、乾燥用20分)を使用して箱をオートクレーブします。

3. 防腐剤フリートリアムシノロン(40mg/mL)の調製

  1. 1 mL シリンジを使用して、トリアムシノロン溶液 (10 mg/mL) の 1 mL を引き出します。それを15 mLの円錐形の管に移し、4 mLの無菌バランス塩溶液(BSS)と混ぜます。
  2. 120× g で5分間遠心します。すべてのトリアムシノロン粒子が円錐管の底にあることを確認してください。円錐管から上清(BSS)を捨てます。
  3. トリアムシノロン粒子を5 mLの無菌BSSを円錐管に再懸濁させる。120× g で5分間の溶液を遠心分離します。上清をもう一度捨てます。
  4. ステップ 3.3 を繰り返して、トリアムシノロン粒子の BSS (3x) の洗浄を完了します。
  5. トリアムシノロン粒子を0.25 mLの無菌BSSで再懸濁し、40mg/mLの濃度を達成する。
  6. 再懸濁したトリアムシノロン(40mg/mL)を新しい1 mLシリンジで吸引する。25Gの鈍い先端のフルート針を取り付け、トリアムシノロン溶液で注射器を術中使用の準備を整えます。

4. 硝子体内プラスミノーゲン(0.25 μL)によるNHP眼前処理

  1. 手術の1週間前に、サルプラスミノーゲン(0.25 μg/μL)のビトリアルインジェクション(20 μL)を投与します。
  2. ケタミンの筋肉内注射(10-20 mg/kg BW)およびアトロピン(0.05 mg/kg BW)の皮下注射で処置の前にNHPを鎮静する。局所麻酔用テトラカイン点眼薬を投与する。
  3. ビトリアル注射の前に、10%ポビドネヨウ素で眼窩周囲領域を消毒する。NHPの結膜に5%ポビドネヨウ素を投与することにより眼を消毒する。溶液が滅菌BSSで十分に洗い出す前に、少なくとも1分間フォルニスに留まるようにしてください。
  4. 250 μL のシリンジを使用して、あらかじめ希釈されたサルプラスミノーゲン(0.25 μg/μL)をバイアルから吸引します。注射器に30G針を取り付け、サルのプラスミノーゲンをビジトリアル投与の準備を整える。
  5. 目の注射部位を識別するためにキャリパーのペアを使用します。四肢から3mm離れたところに対するビトリアル内注射を投与する。
  6. 針を地球の中心に向けて注射を進めます。針を地球から取り出す際には、綿アプリケータースティックを使用して注入部位をタンポネードし、眼内内容物の逆流を防ぎます。
  7. 潤滑剤ゲルまたは軟膏を投与して、術後眼表面刺激を即座に軽減します。

5. 手術台と機器のセットアップ

  1. 滅菌場を確立します。無菌の分野では、外科用スクラブ、マスク、ヘアカバーを常に着用してください。
  2. 防腐剤を含まないトリアムシノロン(40mg/mL)を準備し、口腔内のビリゾアの可視化を行います(セクション3参照)。5 mL シリンジで 10 mL の注射器と潤滑剤に無菌 BSS を準備します。ドレープの上に置きます。
  3. 3-0シルク、7-0のvicryl縫合糸、綿アプリケータスティック、創傷閉鎖ストリップ、シャンデリア内照明繊維ワイヤーなど、ドレープに他の機器を用意してください。
  4. 高速ビトレクター、ベンチュリカセット、25Gシャンデリアエンドイルルミネターを含む、生殖器技術を使用して、vitttomyのセットを、ヴィトレクトミのマシンに接続します。
  5. 500 mLの眼科グレードのBSSボトルを開き、メーカーの指示に従ってベンチュリカセットに接続します。システムのプライミングを続行します。
  6. miOCT/手術用顕微鏡のスイッチを入れます。後部区分の外科および照明のための外科顕微鏡の事前設定された構成を選びなさい。ID、性別、動物の目の横性、手順の名前など、手順の詳細を入力します。
  7. 非接触、広角、128度の眼深度レンズを取り付けます。
  8. 手術用顕微鏡/miOCTに無菌使い捨てハンドピースカバーを取り付けます。フットペダルを使用して、顕微鏡の位置とフォーカスを調整します。手術を進める。

6. 動物の麻酔と位置の調製 (好ましくは獣医チームによって行われる)

  1. 逆流や嘔吐を防ぐために、麻酔の誘導前にNHPが少なくとも8時間断食されていることを確認してください。麻酔の誘導前にNHPを鎮静する(鎮静指示のステップ4.2を参照)。
  2. 1%の熱帯アミドと2.5%フェニレフリン点眼薬を5分間隔で少なくとも3倍塗布し、瞳孔拡張を達成する。
  3. 鎮痛を達成するために手術前にブプレノルフィン(0.005-0.03 mg/kg BW)の30分の筋肉内注射を投与する。
  4. 気管チューブ(通常3~5mm)でNHPを挿管します。挿管を試みる場合は、複数のサイズが使用可能であることを確認します。外傷を引き起こすことなく喉頭を通過できる最大のサイズを使用してください。末端の潮汐CO2を測定して、気管内チューブの適切な配置を確保します。
  5. 気管チューブを介して2%のイソフルオランガスを送達し、全身麻酔を誘発する。音やタッチを含む周囲の刺激に対するNHPの反応を評価することによって、全身麻酔の状態(触覚に対する応答の欠如)を確認します。全身麻酔の状態を維持するために0.5〜2%のイソフルオランガスを使用してください。
  6. 手術中のNHP心電図、呼吸数、血圧、酸素飽和度を継続的に監視します。
  7. 眼が外科用顕微鏡に対して垂直になるように、手術台の上にNHPを置く。麻酔中の眼表面刺激を軽減するために手術されていない潤滑剤ゲルまたは軟膏を眼に投与する。
  8. はさみを使ってまつげを切って感染の可能性を減らします。
  9. 10%ポビドネヨウ素で眼窩周囲領域を消毒する。NHPの結膜に5%ポビドネヨウ素を投与することにより眼を消毒する。溶液が滅菌BSSで十分に洗い出す前に、少なくとも1分間フォルニスに留まるようにしてください。
  10. 前カット開口部が手術を受けるために目の上に中央に置くように、無菌ドレープを配置します。粘着性外科切開ドレープで目を覆います。
  11. 眼の上で横管間間術術を行い、手術を受ける。
  12. リーバーマン鏡を挿入して、眼の可視化のためにまぶたを十分に開きます。

7. ヴィトレミトミー

注:PET-足場RPE移植片の送達のための副レチナル空間にアクセスするために、このプロトコルは、標準的なビトレチナル外科セットアップと非接触、広角、128°ファンダスレンズを使用して実行される4ポート(バルブ)25 Gビトレクトミーを推奨しています。このプロトコルはまた、窩の剥離の誘導、RPE移植片の移植、および網膜下液排液を含むいくつかの重要な外科的ステップを導くためにmiOCTを装備した外科顕微鏡の使用を推奨する。

  1. バンナハサミを使用して、手足の近くの結膜を切開することによって360°結膜周囲を行います。鈍い解剖を行うことによって、腹間術を拡大する。
  2. 25Gマイクロビトレオレティナルブレードを使用して、右目の場合は8時、左目では4時に硬化切開術を行います。眼の手足から3mmの硬化を行います。
  3. 7-0ビクリル縫合糸を使用して25Gカスタム側ポート注入カニューレを挿入および縫合する。ビトリアル内の位置を確認した後、BSS注入を開始し、20mmHgのIOPを維持するようにシステムを設定します。
  4. 25 G の平らなヘッド トロチャーを使用して、右目の場合は 2 時、左目は 10 時に、手順 7.2 のように硬化を行います。
  5. 25Gシャンデリアライトをフラットヘッドトロチャーに挿入し、粘着テープで固定します。光源を約60%に調整します。
  6. 右目の場合は10時、左目では2時に、ステップ7.2と同様に別の強膜切断術を行います。結び目を結ぶことなく、硬化性の周りにU字型のvicryl 7-0縫合糸を配置します。この強膜切開術を通して、ビトレクトミーカッターチップを挿入します。
  7. エントリーポートの周囲でvit>tmymyを開始し、続いて短いコアのvit>tmymymyを次の設定で開始します:最大5000カット/分、最大吸引回数は400 mmHgです。
  8. 20~50 μL のトリアムシノロン(40 mg/mL)を注入して、より良いビリゾアブルを実現します。
  9. 網膜から亜大体を分離することによって後部膜外剥離(PVD)を誘導する。
    1. PVDの穏やかな誘導を可能にするために、光ディスクの上にビトレクターを置きます。切断を伴わずに、最大400 mmHgの吸引でのみヴィトレターを維持します。
    2. 必要に応じて、25 Gの眼内鉗子を使用して、ディスクマージンで腹膜を操作し、膜皮質に裂傷を作り出し、剥離を容易にします。
      注:PVDは、トリアムシノロン結晶が、反射面に妨げられずに滑空した場合に成功したと考えられます。
  10. カッターで後舌膜を開き、取り外した膜状のスカートを、(網膜赤道)まで取り外します。残りのトリアムシノロンを残り、残りは、残り、残りは、その表面に吸引する。

8. miOCT誘導子葉剥離

  1. PFCLの1-2 mLを注入して、後部ポールを前部、中周性のレチナまで覆います。
  2. 眼下注射カニューレで眼を入る。Vit>ttmyマシンでIOPを0-4 mmHgに設定します(完全に水密なシステムを確保し、必要に応じてポートの周りに縫合を結びます)。
  3. 250 μL シリンジに接続された 25/41 G カスタマイズされたデュアルボア副レチナル注射カニューレまたは 25/38 G サブレチナル注射カニューレを使用して、BSS の副レチナル注射を穏やかに行い、局所的な網膜剥離を誘発します。ブレブが窩を横切ったら、注射を止める。別の方向から 2 番目のブレブを作成します。両方のブレブをマージして、フォビアを完全に取り外します。
  4. miOCT 関数を有効にして、ブレブ形成を視覚化します。ラインスキャンとキューブスキャンが、フォビアで画像を取得するための設定(512 x 128ピクセル、幅4mm)でHDモードになっていることを確認します。miOCT画像を観察して、窩のRPE層から神経網膜を完全に剥離します。
  5. 移植のための副腎皮領域へのアクセスを可能にするために垂直25 Gのビトレオレチナルはさみで1.5mmにレチノミ術を拡大する。

9. ネイティブ RPE の除去

  1. Vit>t2 マシンで IOP を 50 mmHg に設定します。
  2. ブラシをかけたシリコーンチップカニューレを使用して、アクティブな押し出しでPFCLを取り外します。
  3. 1.4mmの切開ナイフで硬化切開を延長し、20Gの楽器の入り口を可能にします。
  4. カスタム 20 G 拡張可能ループインストゥルメントを使用して、取り外しのために、macular ホスト RPE をスクレイピングします。少なくとも2 x 3 mm の面積を削ります。

10. RPE細胞単層移植の送達のための射手のロード

  1. PET細胞キャリア上のRPE培養物から切り取られた弾丸状の移植片のローディングに関する一般的な指示については、前の出版物22を参照してください。

11. miOCT誘導移植と位置調整

  1. シューティングデバイスの先端を20mmHgのIOPで硬化切れに挿入します。レティナル表面から作成されたレティノミ術の縁を介して、眼下腔に向かってインプラントを注入する。
  2. ブルッフの膜に面した細胞キャリア側と、感光体に面したRPE異種移植片側にインプラントを注入します。
  3. miOCT機能を有効にして、インプラントの位置を視覚化します。インプラントが下レチナル空間のブルッフの膜に平らに置かれていることを確認し、無傷で上に残るレチナを持っていることを確認してください。作成されたレティノトミーから離れた合理的な距離にあり、レティノミサイトに影響を与えないようにしてください。
  4. 受胎前注射カニューレまたは25G湾曲した眼内はさみでインプラント位置を調整し、黄斑の下に十分に配置されるようにします。

12. miOCT誘導下流域液の排水

  1. ブラシをかけたシリコーンチップカニューレを使用して、流体空気交換と慎重な亜レチナル液の排水を行います。ブレブ網膜剥離および網膜切除エッジアポジメントから穏やかな網膜下流体吸引を試みる。
  2. インプラント上にレティナが再び付着するまで、適切な副レチン流体排液のリアルタイム可視化のためのmiOCT機能を有効にします。

13. 操作の終了

  1. 7-0のvicryl縫合を使用して、作業用ポートの硬化性を閉じます。25Gシャンデリアと25G注入カニューレを取り外します。7-0のvicryl縫合糸でこれらの強結膜を閉じます。
  2. 8時の硬化切開術で、0.05mlの0.05mlの細胞内防腐剤フリートリアムシノロン(40mg/ml)を縫合する前に投与する。
  3. IOPが許容範囲内であることを確認するために、目を触視します。必要に応じて、30G針を介してフィルタされた空気(またはBSS)を注入します。
  4. 結膜を7-0の近傍縫合糸で縫合し、5-0プロレンでカントートミー(10-14日後に除去する)。

14. 術後動物のケア

  1. NHPの顔を下に1時間の手術後に置きます。意識が取り戻されるまで、動物を放置しないでください。術後のプロセス中に獣医師および動物ケア技術者が観察とサポートを受けられるようにします。
  2. 局所抗生物質(トブラマイシン)、ステロイド(デキサメタゾン)軟膏、およびホマトロピン点眼薬を1日2回、術後5日間塗布する。
  3. 十分な疼痛制御のために手術後に別の皮下ブプレノルフィン(0.005-0.03 mg/kg BW)注射6時間を投与する。
  4. NHPを他の動物の会社に戻すのは、意識が完全に回復した場合のみ。
  5. 手順の後、3日目、14日、1ヶ月にマルチモーダルイメージングフォローアップを行い、その後毎月の検診を行います。手順の後毎月ERGを実行します。14日目のカントートミーの5-0プロレン縫合糸を、マルチモーダルイメージングに使用される沈め周期と同時に取り除きます。残りの縫合糸は、除去を必要としない7-0のvicryl縫合糸を再ソーブルです。

15. マルチモーダルイメージングの術後モニタリング方法

  1. NHPを一晩で速くします。画像処理の直前にNHPを鎮静する(鎮静のための薬物および濃度についてはステップ4.2を参照)。眼の動きを止めるには十分な場合は、全身麻酔の使用を検討してください。
  2. 1%のトロピックアミドと2.5%フェニレフリン点眼薬を適用して、イメージング前に瞳孔拡張を達成する(ステップ6.2参照)。
  3. 55°フィールドレンズと30°フィールドレンズを備えた高解像度OCTマシンを使用して、自己蛍光(AF)、眼炎蛍光血管造影(FFA)、光コヘレンストモグラフィー(OCT)を実行します。
    1. 静脈内10%フルオレセイン(0.1 mL/kg BW)をFFAに投与する。初期段階の画像を取得するには、射出の 30 s 以内の画像をキャプチャします。遅相画像の場合は、射出後5~10分の画像をキャプチャします。
  4. FFAの初期段階と後期の間にファンダスカメラを使用して眼科写真を実行します。

16. 全界電解電解(ERG)研究のための術後モニタリング法

  1. NHP を一晩で高速にします。ERG研究の前にNHPを鎮静する(鎮静のための薬物および濃度についてはステップ4.2を参照)。ERGの記録全体を通して、適切な場合にセデレーションを再投与する。
  2. マルチモーダルイメージングとERG記録を、少なくとも2〜3日間の間隔で分離します。
  3. 鎮静したら、ErG記録の前にNHPが30分間暗く適応していることを確認してください。
  4. ステンレス鋼下皮下針電極を左右横カンティ(参照電極)とNHP本体の背面(接地電極)に配置します。ERGコンタクトレンズ電極を、接触と接着を助けるためにビジシックゲルを使用してNHP角膜に置きます。
  5. すべてのERG試験は、国際臨床電気生理学会(ISCEV)14が推奨するヒトプロトコルに基づいています。発色状態でERG記録を開始し、調光器の点滅から開始します。推奨される刺激間隔に関する ISCEV 勧告に従ってください。
  6. NHPが光のテストの前に10分間光に適応していることを確認し、バックグラウンド強度のための標準的なISCEVの推奨事項を使用して再び。

17. 安楽死

  1. 核分のためにNHPを安楽死させるために、米国獣医医師会の安楽死に関するパネルによって推奨されるように、ペントバルビタール(75mg/kg)静脈内ナトリウムを投与する。

結果

マルチモーダルイメージングモダリティ(眼管写真、眼管自己蛍光イメージング(FAF)、眼管蛍光血管造影(FFA)初期および後期、および光コヘレンス断層撮影(OCT))は、正常な眼下RPE移植移植の特徴を強調しています(図1)。眼深膜写真は、時間の経過とともに移動することなく、窩におけるRPE移植移植の位置を示す。FAFイメージングは、RPE移植片と重なり合う超自己蛍光(白、高輝度領域によって示される)の最小限の変化を示す。初期および後期のFFAはRPEの接木を取り囲む明白な漏出(時間とともに拡大する白い、高輝度の領域によって示される)を示さない。3日目の初期画像は、移植移植前のネイティブRPEの除去による窓の欠陥を示す。黄斑OCT画像は、時間が経過するにつれてRPE移植片上の外側のレチナル層(特に、感光体層)の保存を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、マイクロステアの証拠のない無傷の残膜層を示す。移植片の周囲の上の核層の保存は、RPE細胞が感光体の健康を維持する生理機能を果たしていることを示唆している。

25/41 Gデュアルボアカニューレの眼内および外部図は、眼下注射中にIOPが制御されるメカニズムを強調しています(図2)。BSSは、中央長いカニューレを介して副レチンス液注入中に、皮下空間に入る。眼圧の有意な増加は、硝子体腔内のBSSがカニューレのより大きな金属ボアを介して眼を出る原因となる。その後、BSSはカニューレに沿って移動し、最終的にカニューレハブ近くの出口ポートから排出されます。カニューレが期待どおりに動作しているかどうかを評価するには、カニューレ ハブの近くの出力ポートから流体が流れるようにします。

miOCTは、卵胞剥離中に出血寸法と潜在的な卵胞涙を作動不能に可視化することを可能にする(図3)。図3A1-A3は、眼窩裂を有するブレブの場合を強調する。図3A1では、下のブレブが手術用顕微鏡下で見える一方で、涙の視覚化が困難である。図3A2は、涙のないブレブの縦断面を示す。図3A3は、ブレブの垂直断面を評価する場合の下頭涙を示す。図3B1-B3は、涙が出ることなく正常に作成されたブレを示しています。

ERG波形の著しい劣化の欠如は、ロッドと錐錐体の両方の光受容体のグローバル機能が、レチナル下RPE異種移植片で維持されることを示唆している(図4)。ERG波形は、retinaの全体的な機能を示しています。特に、光受容体機能の損失を判断するためにA波に注意を払う必要があります。

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図1:マルチモーダルイメージングによる術後 インビボ 解析 (A) 左眼下RPE移植移植(眼底写真の黄色)の 生体内 画像化(左から右の列:眼底写真、自己蛍光、眼管蛍光血管造影初期段階、眼管フルオレセイン血管造影後期、眼球透視後期、光コメレンストモグラフィー)月1、3)。眼科写真のアスタリスクは、眼科の部位を示す;白い破線の矢印は、ラインスキャンの方向を示します。眼深部の自己蛍光イメージング上の黄色の描かれた形状は、移植の位置を強調する。OCT 画像上の白い三角形は、グラフトのそれぞれの横端を示します(色の眼科画像のラインスキャンに従って)。(B)ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、アトロピエント・フォベア下での移植の染色(術中涙による)を標識した層を有する。スケールバー= A (自己蛍光およびFA画像)で1mm、 A (OCT画像)で200μm、 Bで100μm。略語: FA = 眼深血管造影;OCT = 光コヘレンス断層撮影;RGC = 神経節細胞層のレチン状;INL = 内部核層;ONL = 外側核層;RPE = 網膜色素上皮. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2471
図2:25/41Gデュアルボアカニューレの眼内および外部図(A)、25/41Gデュアルボアカニューレの眼内図白い矢印は、副レチンの注射のために長い中央カニューレを指しています。破線の矢印は、BSSが通過して目を出る出口カニューレの開口部を指します。(B) 25/41 Gデュアルボアカニューレの外部図。アスタリスクは、眼内 BSS が排出されるカニューラ ハブ付近の出力ポートを示します。略語: BSS = バランスの取れた塩溶液。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3043
図3:眼窩裂によって複雑化した眼窩下出血の眼窩下像像とmiOCT画像(A1)頭蓋涙を伴うブレブ内の縦方向(青)および横方向(赤)の位置を示す術中顕微鏡画像。(A2)長手方向miOCTスキャンは、窩領域(黄色の矢印)における眼下出血を示す。(A3)横miOCTスキャンは、眼窩裂(白い矢印頭)とレティノトミー(アスタリスクと副レチンジナルブレブ(黄色の矢印)をキャプチャします。(B1)正常に形成されたブレブにおける縦方向(青)および横方向(赤)スキャンの位置を示す術中顕微鏡画像。(B2)長手方向miOCTスキャンは、窩領域(黄色の矢印)における眼下出血を示す。(B3)横断miOCTスキャンは、優れたインタクトフォベア(ホワイトダイヤモンド)を有する正常に作成された副レチン小出血を示すスキャン。略語: miOCT = 顕微鏡統合光学コヘレンス断層撮影この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:RPE異種移植眼のERG。 レティナの機能評価では、ベースライン(上段)および移植後3ヶ月(下段)で行われたRPE異種移植眼の全視野ERG評価は、暗く適応または明ずに適応した条件下での応答振幅、タイミング、または波形に対するRPE異種移植の有意な効果を示さない。略称: RPE = 網膜色素上皮;ERG = 電気レジノグラム;DA = 暗く適応;LA = 光適合。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

半角RPE移植、RPE懸濁液の注射、単層RPE移植片移植の2つの主要なアプローチが評価されている。2つの方法の詳細な比較は、この原稿の範囲を超えています。しかし、単層RPE移植片の移植は、RPE細胞が懸濁液よりも単層に組織化されるように有利であり得る。移植片内のRPE細胞は、生理学的RPE細胞層の組織に似たコンフルエント単層に組織され、移植されたRPE細胞が生理機能を実行することを可能にする。これにより、規制作業や産業規模に非常に関連するセルサスペンションと比較して、より正確なドージングパラメータが可能になります。

RPEパッチ移植片を皮下腔に送り込むには、黄斑の慎重な操作と、皮下腔内への移植片の正確な挿入が必要です。miOCTなどのマイクロサージャリーの技術進歩と、術中の眼内の眼圧組織力学の理解が向上し、この手順の学習曲線が低下しました。この議論では、以下の側面の根拠について説明する: i) 術前プラスミノーゲン注射;ii) 術中miOCTの使用;iii)カスタム41Gデュアルボアカニューレ、低IOP設定、および下レチナルブレブ作成のためのPFCLの使用。iv) 移植前のネイティブ RPE 細胞層の掻き取り;v)シロリムス、トリアムシノロン、ドキシサイクリン、およびミノサイクリンを使用して、免疫原性移植片拒絶反応を低減する。

術前プラスミノーゲン注射は、パラフォベアルの陰性癒着を放出する
最初の実験では、単一の流体波で窩を取り外すのが難しかった。miOCTによる評価では、画像は、陰部外傷の証拠と共にネイティブRPEへのパラフォベアル外陰性癒着の存在を明らかにした。これらの癒着は、眼下の流体波が眼窩の輪郭全体に広がり、その結果、頭頂部の外傷を引き起こし、ブレブの垂直膨張をもたらした可能性がある。プラスミノーゲンは、フィブロネクチンおよびラミニンを標的とするプロテアーゼであるプラスミンの不活性前駆体である。Ocriplasminは、付随する黄斑穴の有無にかかわらず、症候性ビトレオマクラー牽引の治療のために食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁(EMA)によって承認されたヒトプラスミンのバイオエンジニアリングされた変異体です。しかし、オリプラスミン注射後の膀胱状黄斑浮腫の後の報告は、retina23に対する酵素のより広範な効果を示唆している。

正確なメカニズムは特定されていないが、プラスミンは光受容体-RPE付着を担う光受容体間マトリックス要素の分解を通じて、レチナリシーア接着を弱めることができることが示唆された。このプロトコルでは、NHP眼は、手術の1週間前に、パラフォベの外側の陰部癒着を放出するビ硝細胞内プラスミノーゲンで治療された。感光体-RPEの接着力が弱まっているという仮定の下で、通常は網膜下流体波20に抵抗する遠位パラフォブリングを含む神経感覚網膜を剥離するために低い力が必要である。したがって、網膜ブレブ剥離中に投与される力は、網膜をタンタンジェントに伸ばすのではなく、網膜輪郭を横切ってブレブの膨張をもたらす。これは、頭葉の涙のリスクを軽減します。しかし、このプロトコルでは、長期移植片生存に対するプラスミノーゲンの効果は検討されなかったことに留意すべきである。今後の研究では、この効果を決定しようとする必要があります。

miOCTは、下レチン小出血の作成、移植片の移植、および副レチン流体の排水を導くために解剖学的フィードバックを提供します
手術中、黄斑の外傷性操作は、良好な移植結果を達成するための鍵です。しかし、操作に関連する黄斑の微細構造変化は、常に操作顕微鏡で明らかであるとは限らない。このような手順では、miOCTは、黄斑構造のリアルタイム、3次元、術中フィードバックを提供する重要なツールです。miOCTは、特に、流体空気交換を使用した下流液の下流液の離脱、移植片、および排出のステップ中に有用である。眼窩剥離中、miOCTは、ブリードの垂直および水平寸法を決定することができます。手術用顕微鏡上では明確に可視化されない可能性のある窩胞マイクロティテは、miOCT(図3)によって確認することができる。移植片移植中、miOCT画像は、移植片の位置または窩への近接性を、しばしば透明でない剥離網膜を通して示すことによって導く。miOCTはまた、困難な移植プロセス25の間に、レチナル接着の可能な領域を強調することができます。最後に、下レチン流体の排水プロセスでは、miOCTは完全なレティナルRPE移植片接触が達成されるまで確実に下レチン液の排水を導くことができます。

二重ボアカニューレ、低IOP設定、PFCL硝地タンポナードの相乗的な組み合わせは、皮下出血の発生時に黄斑外傷を相乗的に減少させる
正接網膜ストレッチと流体乱流は、望ましくない窩の涙につながる前頭剥離のための網膜下BSS注入中に起こり得る。これらの現象を打ち消すために、注入が開始される窩の中心からの相対位置と距離、注入量と速度、ビトレウスタンポネード、副レチナル計装の選択、IOPなどの要因はすべて関連することが示されている20,26,27。眼窩剥離のための副網膜のブレブは、網膜ストレッチがブレブ開始部位27で最も高い可能性があるため、窩から十分に離れた場所に位置するべきである。IOPはまた、副レチナルブレブの作成を通じて低く保たれるべきである。眼のIOPが高いと、眼の輪郭に沿って膨張するのではなく、ブレブサイズの垂直増加が高くなるのに対し、低圧20ではブレブが浅い。さらに、50 μLのビトリアルインジェクションは、NHPの目の長さが短いことを考えると、ヒト28ではIOPを効果的に2倍にしますが、受け目の下注射時のIOP上昇は、おそらくヒトよりも高く、より速くなります。ほとんどのvit>tmymyはIOP変動に応じて調整されますが、調整は同時ではなく、副レチナル注入が進むにつれて起こる反応性プロセスです。したがって、IOPが高いほど、眼の伸び過ぎおよび結果として生じる窩の外傷のリスクが高くなります。したがって、低レチナル注射中は安定的に低いIOPを維持することが不可欠である。

市販の20/41 G(DORC)またはカスタムメイドの25/41 Gデュアルボア下トレティナルカニューレは、皮下注射に推奨されます。カニューレは、流体が下レチン空間に注入されたBSSと引き換えに硝硝体空洞を出ることを可能にする。これにより、副レチナル注射中のIOPの「同時」調節が保証されます。二重ボアカニューレの模式図を図2に示します。最後に、PFCLは、20,26,27の下流涙のリスクを低減するために利用される。例えば、八方のようなPFCは比重が高いため、卵胞剥離29中に網膜に下方力を発揮する。これにより、さらに、眼窩剥離ブレブ作成プロセスを安定化させ、網膜輪郭に沿ったブレブの拡張を強化します。この技術は、nAMD30による巨大な眼下出血の設定におけるrtPAの皮下注射にうまく使用されている。

ネイティブRPEの移植前除去により、RPE-感光体複合体の修復が可能
移植移植前に宿主RPEを除去する必要があります。これはRPE-光受容体複合体の修復がRPE移植を可能にして、感光体21を支持するその生理機能を果たす必要があるためである。ホスト RPE は、除去されない場合、機械的バリアとしてポーズをとることがあり、この複合体の復元を防ぐことができます。RPE毒性化学物質の投与または物理的な除去手段を使用して除去することができます。化学的除去方法としては、ヨウ素date31,32ナトリウムの全身投与または副レチナル投与が挙げられる。ヨウ素酸ナトリウムは、投与時に光受容体、RPE細胞、および絨毛キャピラリの広範な変性を引き起こすので、その無菌および全身毒性は、ヒト試験への使用を妨げる32,33。したがって、物理的な術中の技術が好ましい。様々な物理メソッドが概念化されています。物理的な方法を利用する場合、ブルッフの膜が損傷を受けていないことが重要です。多くのインビトロ研究は、無傷のブルッフの膜34,35,36にRPE移植片生存の依存性を実証している。

水圧デブリドメントでの試みは、ブルッフの膜の破断、エピレチナル膜の発達率の増加、および増殖性硝子体網膜症に関連し、牽引性網膜剥離37をもたらした。RPEデブリドメントのために提案されたダイヤモンドをまぶしたへらも、ブルッフの膜の破断をもたらし、その結果、脈絡膜から下レチナル空間38への細胞増殖が生じた。興味深いことに、カスタムメイドの拡張可能なループ楽器は、ウサギと豚の目にブルッフの膜を保存して上にあるRPEを取り除くことができました11,39。基礎 RPE の除去は、AMD の高度な萎縮形態と同様に、RPE および外側網膜萎縮を有する動物モデルを確立するのにも有用である。RPEの焦点領域が黄斑から取り除かれると、残りのRPE細胞の肥大を介してRPE創傷が閉じる。しかし、この創傷治癒応答は、核層40の外核の萎縮と関連している。動物モデルの作成はこの原稿の範囲を超えていますが、同様の手順は、RPE由来細胞治療薬のテストのための高度な萎縮性AMD表現型の動物モデルを作成することができます。

シロリムス、トリアムシノロン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンを使用して免疫原性移植片拒絶反応を軽減
皮下腔は免疫特権部位であると考えられ、無傷の血液副腎バリアおよび他の要因41によって維持される。無傷の血液-レチナルバリアを有する幹細胞誘導体の皮下移植を含む多くの研究において、免疫抑制薬は、移植片survival42において無視できる役割を果たす。外側の血液-retinalバリアは、ネイティブRPE層とRPE細胞間の緊密な接合によって形成されると考えられている。ネイティブRPE除去は、移植されたRPEと宿主感光受容体のより良い統合を可能にするが、血液-腎障害は、免疫拒絶反応の可能性を増加させる、プロセス中に破壊される。古典的には、T細胞は腎臓およびliver43のような他の器官の移植拒絶反応のプロセスの中心である。したがって、レチン組織移植のための初期免疫抑制レジメンは、これらの適応免疫応答を低減することを目的としていた。

シロリムスは、ラパマイシン阻害剤の機械化標的であり、カルシニューリン阻害剤であるタクロリムスは、適応免疫応答を標的とする免疫抑制薬の例である。しかし、十分なT細胞抑制にもかかわらず、移植片生存率は低いままである。また、RPE細胞は、阻害因子の放出を通じてT細胞活性化を抑制し、制御性T細胞44の生成を促進することが知られている。したがって、適応免疫が移植片拒絶反応42の唯一の寄与者ではない可能性があることがますます明らかになっている。細胞製品の副レチナル移植は、microglia45の蓄積および活性化をもたらす可能性がある。

ミクログリアは、レチナのマクロファージです。それらは2つの主な集団から成っている:1)内口脈管系の血管内微小グリアと2)、内の組織のパレンチマ内のミクログリア。ミクログリアは、自然免疫応答の一部であるように、トリアムシノロンなどのビトリアルグルココルチコイドは、サイトカイン媒介増殖を抑制することができる46。ドキシサイクリンおよびミノサイクリンはまた、微小グリア活性化を抑制することができ、考慮されるべきである47,48。最後に、RPE同種移植片と異種移植片の免疫拒絶反応の違いは不完全に理解される49。例えば、誘導多能性幹細胞由来RPE細胞に対する同種抗体は、生体内免疫拒絶モデルの血清中に報告されている。しかしながら、これらの抗体の役割と移植片生存における抗体媒介性拒絶反応の重要性は不明である50。そこで、自然免疫抑制のための適応免疫の抑制とトリアムシノロン、ドキシサイクリン、およびミノサイクリンの組み合わせに対してシロリムスを利用した多剤レジメンが提案されている。このレジメンは、良好な移植片生存結果と最小限の全身効果を有するウサギで正常に使用されています11.

この外科技術の限界
本論文は、NHPの下皮腔内にRPE移植シートを送達する可能な外科的方法を説明する。ただし、これは最適化された唯一の方法であるとは限りません。異なるビトレオ-レチン外科医は、計器と技術のための他の好みを持つことができます。例えば、この移植装置の設計は堅い細胞キャリアで支えられる平らなインプラントしか提供できないので、比較的柔軟な(または圧延された)インプラントには適さないかもしれない。RPE懸濁液移植は、この技術の多くを省略することができます。したがって、外科的詳細は、各配信戦略に基づいて修正する必要があります。

変性性レチンタル疾患の治療に対する細胞治療への関心が高まり続ける中、NHP動物モデルはRPE移植片の生存に影響を与える因子を研究するための前臨床試験に不可欠です。本稿では、NHP眼での単層下層RPE移植片の円滑な送達を可能にする戦略が提案されている。術中合併症のより良い視覚化のための方法も推奨されます。細胞治療薬の使用が拡大するにつれて、これらの方法は改善し続けると予想されます。今後の方法論文は、移植片の様々な構造的および機能的側面を評価するための包括的な調査リストを提案することも検討すべきである。

開示事項

ボリス・スタンツェルは、この研究で使用される機器(RPEスクレーパー)に関する米国特許9980851を保有しています。C・ツァイス・メディテックとグーダーからボリス・スタンゼルまで講演者の名誉。他の著者は、宣言する利益相反はありません。

謝辞

この研究は、IAF-PP(HMBSドメイン)(ORBID):OculaRビオマテリアルとデバイス、A*STAR、 シンガポール(H17/01/a0/013)、NUSスタートアップ助成金NUHSRO/2016/100/SU/01、NUHS臨床科学者プログラム(NCSP)補助金および国立研究財団競争研究プログラム、シンガポール(NRF-CRP21-2018-0008)からX.S.、レオン・ホング・エントワッド・ファンド・ファンドからG.B.へトランスレーショナル前臨床モデルプラットフォーム(シンガポール眼科研究所、シンガポール)の獣医チームが、NHP手術準備と動物のフォローアップを支援することを認めたい。C.ツァイス・メディテック・シンガポールのジル・テオ氏らの皆様に対し、OPMI-Lumera 700(統合型術中OCT装置)の技術サポートに感謝申し上げます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Mydriacyl (Tropicamide 1.0%) Sterile Ophthalmic preparationAlconSIN 4715PSurgical procedure
10% Neutral buffered formalinLeica3800598Histology procedure
2.5% Mydfrin (Phenylephrine hydrochloride) Ophthalmic solutionAlconNo. 01785Surgical procedure
25 G AWH Vivid ChandelierSynergetics56.54.25PSurgical procedure
25 Ga Bi-Blade Vitreous Cutter Combined Wide-Field Stellaris Elite PackBausch & LombSE5525WVBSurgical procedure
AMO ENDOSOL Balanced Salt Solution for ophthalmic irrigationAbbott Medical Optics15020Surgical procedure
Apo-minocyclineApotex Inc2084104Immunosuppression
AUROVISC - Hypromellose Ophthalmic Solution USP 2% w/vAurolabTN 00002387Surgical procedure
Autoclave MELAG, VacuklavMELAG1131-B2300Surgical procedure
Autostainer XL (ST5010)Leica2433Histology procedure
Balanced Saline SolutionBeaver Visitec581732Surgical procedure
Cotton BudWINNER MEDICAL1NA6-100Surgical procedure
Diagnosys Espion E3 ConsoleDiagnosys272Ophthamic imaging
DoxycyclineYung ShinMAL 19950403AEZImmunosuppression
Eosin YMerck Millipore1.15935.0100Histology procedure
ERG-Jet contact lens electrodesFabrinalF-06Ophthamic imaging
Extendable PolyTip Cannula 25 G/38 GMedOne3247Surgical procedure
FlexTip Brush (25 g) 1.5 mmMedOne3222Surgical procedure
Fluoresceine 10% FaureCuratis AG5030376Ophthamic imaging
Gauze SwabWINNER MEDICAL1NP3275Surgical procedure
Hamilton gas tight syringe 250 µLHamilton81101Surgical procedure
Heidelberg Spectralis HRA + OCT Computer SystemHeidelberg EngineeringN.A.Ophthamic imaging
Hematoxylin Gill IIMerck Millipore3801520Histology procedure
Inverted microscope eclipse Ti-E main body (100-240V)Nikon33131Histology procedure
Ketamin injectionCeva37711/58317Surgical procedure
Lithium carbonateMerck Millipore1.05680.0250Histology procedure
Monkey plasminogenMolecular InnovationsSKU-CYPLGSurgical procedure
Non-contact wide angled 128 degree fundus lensC. Zeiss MedtechResight 700Surgical procedure
Non-woven Ophthalmic DrapeAlcon8065103120Surgical procedure
Ophthalmic Corneal/Scleral V-Lance Knife 20 GAlcon8065912001Surgical procedure
Paraffin Embedding StationLeicaEG1150 HHistology procedure
Paraplast High Melt ParaffinLeica39601095Histology procedure
Phloxin BMerck Millipore1.15935.0025Histology procedure
Prepowdered Surgical GlovesMAXITEX85-173-2/85-173-3/85-173-4Surgical procedure
PRODINE Povidone-Iodine Solution BPICM PHARMAPMLBLP20-01Surgical procedure
Righton Slit Lamp Model MW50D (RAA133CB)Righton-Oph5200162Ophthamic imaging
Rotary microtomeLeicaRM2255Histology procedure
Safil Polyglycolic acid, braided, coated, absorbable surgical suture 7/0B.BraunG1048711Surgical procedure
SHINCORT I.M. INJ. Triamcinolone Acetonide 40 mg/mLYung ShinSHI40 SGP-2610015-001Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 21 GB.Braun4657527Surgical procedure
Single-Use Hypodermic Needle 23 GB.Braun4657667Surgical procedure
SirolimusPfizerSIN12034PImmunosuppression
Stainless steel subdermal needle electrodeOcuScienceF-E2Ophthamic imaging
Stellaris Elite vision enhancement systemBausch & LombBL15455Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 27 G 12 mmB.Braun4665406Surgical procedure
Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 30 G 12 mmB.Braun4656300Surgical procedure
Surgical gown + 2 Hand TowelsSTERILAPP10 00 01Surgical procedure
Tegaderm Film3M1626WSurgical procedure
TERUMO Syringe 1 cc/mL Luer SlipTip with needle 26 GTerumaSS-01SSurgical procedure
TERUMO Syringe 3 cc/mL Luer LockTipTerumaSS-03LSurgical procedure
TERUMO Syringe 5 cc/mL Luer LockTipTerumaSS-05LSurgical procedure
TobraDex (Tobramycin, Dexamethasone) Sterile Ophthalmic OintmentAlconNo. 01577Surgical procedure
Topcon Retinal Camera TRC-50DXTopcon948605Ophthamic imaging
Vidisic GelBausch & LombGB41789155517Surgical procedure
Xylazil-20Ilium38653/50276Surgical procedure
Zeiss Opmi Rescan 700Carl Zeiss Meditec AG7210Surgical procedure

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases
Posted by JoVE Editors on 12/29/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR),
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore,
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

to:

Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore,
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)
4Singapore Eye Research Institute (SERI),
5UCL Institute of Ophthalmology,
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School,
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar,
8Department of Ophthalmology, University of Bonn
* These authors contributed equally

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