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ここでは、 インビトロ セルラーインターフェース用の有機電変調電変調トランジスタ(OCMFET)ベースのデバイスの製造プロトコルを紹介する。マイクロOCMFETアレイと呼ばれるこの装置は、柔軟で低コストで参照のないデバイスであり、電気活性細胞培養の電気的および代謝的活動のモニタリングを可能にします。
現代の電気生理学は、ますます高度化するツールと材料の並行開発によって常に促進されてきました。さらに、この分野での発見は、過去50年間の印象的な成果を最終的に決定した前後のプロセスで技術の進歩を推進してきました。しかし、セルラーインターフェースに使用される最も採用されているデバイス(すなわち、トランジスタに基づくマイクロ電極アレイやマイクロエレクトロニクスデバイス)は、高コスト、材料の剛性、外部参照電極の存在など、いくつかの制限を依然として有しています。これらの課題を部分的に克服するために、有機バイオエレクトロニクスと呼ばれる新しい科学分野が発展し、低コスト、より便利な材料、革新的な製造技術などの利点をもたらしました。
細胞培養との間に便利にインターフェースするために、過去10年間にいくつかの興味深い新しい有機デバイスが提案されています。本論文では、有機電変調された電界効果トランジスタ(OCMFET)に基づく細胞インターフェース用デバイスの製造プロトコルを紹介する。マイクロOCMFETアレイ(MOA)と呼ばれるこれらのデバイスは、有機エレクトロニクスの利点とOCMFETの独特の特徴を組み合わせて、体心筋細胞およびニューロンの電気的および代謝活動を体質で監視することができる透明で柔軟で参照のないツールを準備し、電気細胞モデルのマルチパラメトリック評価を可能にします。
ニューロンや心筋細胞などの電気活性細胞のインビボモニタリングは、人間の脳、機能接続性研究、薬理学、毒物学の基礎研究アプリケーションにおいて有効かつ強力なアプローチを表しています。このような研究のために通常使用されるツールは、主にマイクロ電極アレイ(MEA)1,2,3,4,5に基づいており、ますます効率的で強力な電界効果デバイス(FET)6,7,7,8,9,10,11,12.これらの2つのデバイスファミリーは、ニューロンと心筋細胞の電気活動のリアルタイムモニタリングと刺激を可能にし、通常は堅牢性、使いやすさ、信頼性によって特徴付けられる。これらの特徴はMEAおよびFEDを電気生理学的適用のための金本位にし、標準的な細胞培養物、オルガノピックの脳スライスおよび三次元オルガノイド13、14、15、16とのインターフェイスに現在使用されている。MEAやFEDは、その幅広い使用と印象的な特徴にもかかわらず、高コスト、材料の剛性、および通常はかさばる参照電極の存在など、いくつかの制限を提示し、測定液環境に配置する必要があり、デバイスの適切な動作に必要です。
細胞インターフェースの代替ソリューションを探求するために、有機材料と革新的な製造技術に基づく電子機器の研究に過去10年間で多くの努力が投資されてきました。前述の制限に対処するために研究されたいくつかの有機デバイスの中で、OCMFETと呼ばれる特異な有機トランジスタが最近MEAおよびFEDs18に代わる有効な代替手段として提案されている。低コストの材料や製造技術、最適な機械的・化学的特性、光学透過性、生体適合性などの有機エレクトロニクス技術が提供する標準機能に加えて、OCMFETは外部参照電極を必要とせずに超高電荷感度(二重ゲート構造による)を提供します。さらに、この有機センサは、トランジスタ領域19,20から分離されたセンシング領域の特定の機能化に応じて、異なる検体/物理的パラメータを検出する顕著な能力を有する。これらの機能はすべて、細胞培養内のさまざまなパラメータを取得するために便利に利用できます。特に、神経/心臓の電気的活性を検出できることに加えて、細胞代謝活性に起因するわずかな局所pH変動を確実にモニタリングする単純な物理的機能化21を用いてOCMFETの超高pH感受性を利用することもできる。
インビトロ細胞バイオセンシングにおいて、細胞代謝活性のモニタリングは、培養の状態の強力な指標であり、薬物投与および電気刺激などの様々な刺激に対する細胞応答を評価するために使用することができる22,23。さらに、神経用途の特定の場合には、特に薬理学および毒物学24において、電気的および代謝活動の両方をモニタリングすることは大きな関心事である。OCMFETの利点を提供しながら、現代の体外電気生理学の要件に便利に対処することを意図して、マイクロOCMFETアレイ(MOA)と呼ばれるデバイスが最近導入されました。MOAはOCMFETベースのアレイで、インビトロ細胞インターフェース用に特別に設計された特殊なセンシング領域を備え、電気原性細胞培養のマルチパラメトリック分析を可能にします。特に、2つのMOAチャネルは、その感度を最大化するためにより大きなセンシング領域を有し、培養培地のpH変動などの関心のある特定のパラメータを監視するために選択的に機能化することができる。構造内の他のOCMFETは、細胞外の電気活動センサーとして機能する。図1は、16チャンネルMOAの構造を示しています。この機能は、外部参照電極の存在と組み合わせることで、MOAをインビトロアプリケーションにとって非常に興味深いツールにします。この研究は、ニューロンおよび心筋細胞の電気および代謝活動のインビトロ検出のための多感性MOAの段階的な製造プロトコルを提示する。図2は、主な製造手順、使用する材料、およびデバイス構造を示しています。
動物のケアと使用に関するすべての適用対象の国際、国家、および/または制度的ガイドラインに従った。プロジェクトのための動物の数を減らし、彼らの苦しみを最小限に抑えるために、すべての努力がなされました。
1. 開発ソリューション、エッチング液、有機半導体溶液、フォトリソグラフィマスクの調製
2. 基板の選択と準備
3. FG:チタン蒸着
4. FG パターニング
5. ゲート誘電体蒸着
6. 電気活動記録のためのOCMFETのセンシング領域の開放と、FGの背面にアクセスするビアの形成
7. FGによるソースとドレインの自己整列
8. 金の堆積、チャネル形成、およびソース、ドレイン、および制御ゲートのパターニング
9. pHセンシング用パリレンCの蒸着と活性化
10. 半導体蒸着、培養チャンバの配置、およびPETからの装置の最終的な切り抜き
11. トランジスタの電気的特性
MOAの可能性は、電気活動記録と代謝活動のモニタリングの両方のためにここで検証されています。細胞外作用電位を検出する装置の能力の正確な推定は、ラット心筋細胞培養物(特に 、8日間のインビトロ [DIV])18で測定された原発性ラット心筋細胞における)による徹底的な特徴付けに基づいていた。 図 3A は 、16 の OCMFET を備えた完全な MOA を示しています。上端のインセットは、MOAの表面に付着したコンフルエントラット心筋細胞培養の例を示す。彼らの健康を強調するために、細胞は記録セッションの後に肉体タンパク質、トロポミオシンについて免疫染色されている。下端のインセットは、OCMFETで測定された単一の心筋細胞信号を示す。
興味深いことに、 装置は、図3Bに示すように、自発的な電気的活動および異なる化学物質の投与に誘発される活動を検出することができた。この検証は、このアプローチを電気細胞インターフェースに使用することの実現可能性を実証するために非常に重要でした。配列構成のため、MOAは心臓信号の伝搬速度の再構築を可能にし、従って細胞ネットワークの研究のためのシステムの適合性を示す(図3C)。さらに検証してデバイスの実際の検出限界を決定するために、MOAは線条体ニューロン(21 DIV)18でテストされ、信号振幅と記録の信頼性という点で興味深い結果が得られました。 図3Dに示すように、OCMFETは、驚くべき安定性を持つニューロン電位を増幅し、最大3.2の信号対雑音比(SNRS)を示す(標準MEAs25で得られたSNRと同じ範囲で)。記録設定は、トランジスタバイアス用のカスタムマルチチャンネルエレクトロニクスと信号の読み出しとコンディショニングで構成されていました。電気記録用の各チャンネルには、1 MΩのフィードバック抵抗を備えたI/Vコンバータと、電圧ゲイン110の150 Hz-1.3 kHzバンドパスフィルタからなる第1段階があります。提示された全ての測定では、トランジスタはVDS = VGS = -1 Vと偏っていた。A/D 変換とデータの可視化と保存は、データ取得ボードを使用して実行されました ( 材料表を参照)。すべての測定セッションは、システム上の電気的な環境騒音を最小限に抑えるためにファラデーケージ内で行われました。
前述のように、プロトコルで提示された単純な物理的機能化を利用することによって、超nernstian応答を有する高感度pHセンサを準備することが可能であった。提示された製造アプローチのために、これらのpHデバイスはMOAに統合され、一次海馬ラットニューロン26の代謝活性によって誘発されるわずかなpH変動を監視するために使用することができる。特に、 図4に示すように、低周波センシング専用の2つのOCMFFETのうち1つだけが選択的に機能し、アプローチの実現可能性を実証した。この選択的機能化により、化学的に誘発された代謝変動に対する2つのOCMFETの応答の評価が可能となった:特に、GABA A受容体27の阻害剤であるビクキュリン(BIC)を用いて高い代謝状態を得ることができるが、テトロドトキシン(TTX)の添加によって低代謝状態を誘発することができ、最終的に細胞死を引き起こす288.記録設定は、電子活動測定に使用されるのと同じカスタムマルチチャネルエレクトロニクスで構成されていました。
前のケースとは異なり, 2 つの専用チャネルを使用して細胞代謝活性によって誘発される遅い変化.各チャンネルは、1 MΩのフィードバック抵抗を備えたI/Vコンバータと、カットオフ周波数が10Hzのローパスフィルタの2つのメインブロックで構成されたシンプルな回路で構成されていました。トランジスタはVDS = VGS = -1 Vに偏っており、すべての測定はファラデーケージ内で行われ、外部ノイズが記録に与える影響を最小限に抑えました(これは細胞代謝活性によって引き起こされる低電流変動を考慮すると特に重要な側面です)。実験中、培養液を低緩衝培地に保持し、システム全体を制御された環境(37°Cおよび連続CO2/気流束)に配置した。予想通り、25 μM BICを追加することで、pH感受性OCMFETの電流のみ変調することができました。これは、細胞代謝活性の対応する変動によって電流変動の誘導によってさらに確認された。
10 μM TTXを添加した後も同じ実験を繰り返し、細胞代謝が徐々に低下した。TTXの添加に続いて、pH感受性OCMFETもpH感受性のものも、いかなる応答も示さなかったため、アプローチの有効性を実証した。これらの結果は、提案された機能化の有効性と最大2週間の相対的安定性を示す。提案された実験(電気活性と代謝活性の両方)から引き出すことができる重要な結論は、同じ培養領域内で異なるOCMFETを選択的に機能させることによって異なる種類のセンサーを調製することができるということです。この側面は、同じ細胞培養中の異なるパラメータを監視できることが、それらの生物学的システムの複雑さのより良い特性評価のために重要であるため、細胞アプリケーションのバイオセンシングにおける非自明な成果を表しています。
図1:電気活性細胞の代謝および電気的モニタリングのための16チャンネルMOAのトップビュー。 スケールバー= 1 cm略称: OCMFET = 有機電変調された電界効果トランジスタ;FG = フローティングゲート;S/D = ソース/ドレイン;MOA = マイクロ OCMFET アレイ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:電気活性細胞の代謝および電気的モニタリングのためのMOAの主な製造ステップ。 (AおよびB)蒸発したTiフィルムは、標準のフォトリソグラフィプロセスを用いてパターン化され、OCMFETのフローティングゲートを調製する。(C) 15nmのパリレンCの堆積物。この層は、天然の酸化チと共に、トランジスタのゲート誘電体として機能する。(D及びE)パリレンC層は、プラズマ酸素処理を用いてパターン化される。パターン化されたフォトレジスト層は、電気記録およびフローティングゲートバックコンタクトのセンシング領域を選択的に露出させるために使用されます。(F) Auトップコンタクト、すなわちソース、ドレイン、コントロールゲート、およびフローティングゲートバックコンタクトのパターン化。自己整列技術は、デバイスの電気的性能を向上させるために使用されます。(G-I)代謝活動モニタリングのためのOCMFETのセンシング領域上のパリレンCの第2層の堆積。酸素プラズマ暴露後、この層はpH感受性膜(J)として作用する。(K)有機半導体(TIPSペンタセン)と培養室の位置付け後の完全なMOA(材料付き)の断面。略称: OCMFET = 有機電変調された電界効果トランジスタ;FG = フローティングゲート;S/D = ソース/ドレイン;MOA = マイクロ OCMFET アレイ;CG = 制御ゲート;PET = ポリエチレンテレフタレート;パーC = パリレンC;TIPS = 6,13-ビス(トリイソプロピルシリレチルニル) ペンタセン;ABS = アクリロニトリル ブタジエン スチレン。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:MOAを用いた細胞電気活動記録 (A)MOAの表面に付着したラット心筋細胞(8 DIV)のコンフルエント培養は、肉体タンパク質、トロペスミオシン(上部インセット)に対する記録セッションおよび免疫染色後に固定される。ボトムインセット:OCMFETで測定された単一の心筋細胞信号の例。スケールバー=150μm(B)心筋細胞培養物の電気的活動の化学調整。活性加速度は100 mMノルエピネフリンの添加に起因し、抑制は100 mMベラパミルの添加に起因した。左:周波数変調を打つ;右:5 OCMFET平均と標準偏差の統計:基礎の4分のスパイクカウント(129±4.6)、ノルエピネフリン媒介物(280±28.6)およびベラパミル媒介活性(15±1.9)。(C) 心臓信号の伝搬の再構築。右:地点14からサイト41への信号の伝播を示す培養物の自発的な活動のラスタプロット(右)。(D)ラット胚由来の線条体細胞の作用電位(21DIV)。この図は 18から変更されています。略語: OCMFET = 有機電荷変調された電界効果トランジスタ;MOA = マイクロ OCMFET アレイ;NE = ノルエピネフリン;VER = ベラパミル;DIV = インビトロの日数。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:MOAを用いて代謝活性記録を行う。 (A)TTXの10 μMの添加の前後に25 μM BICを加えたMOAのpH感受性および(B)pH感受性チャネルの応答。TTX添加後、pH感受性チャネルの挙動は、pH感受性チャネルの動作と同様になる。特に、TTX誘発細胞死によるBIC添加後の電流変動は認められない。(C) 代謝活性記録のための MOA.pH感受性およびpH感受性のOCMFETsはそれぞれ緑および赤で概説される。インセット:15 DIVの後にデバイス上で培養された健康な海馬ニューロン。この数字は 26から変更されています。略語: OCMFET = 有機電荷変調された電界効果トランジスタ;MOA = マイクロ OCMFET アレイ;BIC = ビキュクリン;TTX = テトロドトキシン;DIV = インビトロの日数。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
細胞アプリケーション用OCMFETの製造のための以前の方法とは異なり、提案された方法は、電気的および代謝的細胞活動を同時に検出できるMOAを調製するように特別に設計されている。さらに、pH感度を達成するためのこのアプローチは、標準的な製造プロトコルと互換性があり、センシング領域の化学修飾を伴わないという利点を有する(この側面は、デバイス全体の生体適合性を保証する)。pH感度は、ゲート誘電体(すなわち、生体適合性のパリレンC)として使用されるのと同じ材料を使用して達成され、このアプローチは速く、再生可能にする。
このアプローチの最終結果は、 インビトロ セルラーアプリケーション用の柔軟で透明で低コストで多量感性の有機ツールです。これは、単一のトランジスタ構造とセンシング領域の簡単な物理的な変更を使用して得ることができるという事実は、有機電子材料および方法の使用によって提供される利点を追加します。また、OCMFETの導入原理は特定の半導体やFG材料に厳密に依存しないため、プロセス全体を特定の用途に応じて変更・アップスケールすることができます。
提案された技術の重要な側面は、プラズマ活性化技術の再現性に関連している。一貫した結果を得るためには、パリレンCの厚さおよびそのエッチングレートの両方を制御する必要があります。パリレンC蒸着プロセスとプラズマクリーナーの頻繁なキャリブレーションは絶対に必要です。また、プロセスの再現性にも寄与する重要な側面として、デバイスの取り扱いや有機半導体の堆積化が重要です。ここでは、再現性の限界を本質的に生かしたシンプルなドロップキャスティング技術が使用されました。これらの問題を最小限に抑えるために、プロトコルステップ10.1で説明したように、同じ量の半導体溶液を毎回使用し、溶媒蒸発を可能な限り標準化すべきである。ホットプレートを使用して一定の温度を維持し、各液滴堆積後に基板を覆うことは、蒸発プロセスを遅くするのに役立ちます。この問題をさらに最小限に抑えるために、堆積技術(例えば、インクジェット印刷法を用いて)を切り替え可能である。
提案されたプロトコルの制限は、pHセンシングのためのOCMFETの機能化の性質に由来する。pHセンサーの安定性は、数週間26に制限されています。しかし、提案されたアプローチの安定性ウィンドウは、神経培養の成長に必要な標準的なインキュベーション時間(2〜3週間)をカバーするのに十分大きい。他のタイプのセンシング領域の機能化は、より長い実験のために考慮されるべきである。製造プロトコルは、専用のバックコンタクトを使用して、FGsへの電気的アクセスを可能にします。この接触は、デバイスの正常な動作中に浮いたままで、異なる技術(例えば、電着)を使用して、デバイスの電気的特性とセンシング領域の機能化のために利用することができる。
この手順は、広い材料やクリーンルーム設備を必要とせずに、セルラーアプリケーション用のマルチセンシングデバイスを準備するための便利な方法を表します。有機半導体の採用とセンシング領域の物理的(化学的ではない)機能化による性能と安定性の制限にもかかわらず、同様のアプローチを使用して、低コスト(および潜在的に使い捨て)、機械的に柔軟で光学的に透明なセンサーとバイオセンサーを準備することができ、細胞生物学、組織工学、神経科学の研究者に 生体外の細胞システムを研究するための新しい特殊なツールを提供することができます。
著者は宣言する利害の対立を持っていません。
著者らは、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムによる助成金第882897-検索&レスキュープロジェクトおよびPNR2015-2020 ARS01_00996 PONプロジェクト「TEX-STYLE」の助成金を認めている。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | 440159 | |
3D printer Makerbot Replicator 2x | Makerbot | https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
ABS filament | |||
Anisole | Sigma Aldrich | 296295 | |
Bromograph model Hellas | Bungard | https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros. | |
Gold | Local seller | ||
Hydrofluoric acid | Sigma Aldrich | 695068 | |
Iodine | Sigma Aldrich | 207772 | |
Kapton tape | polyimide insulation tape | ||
Laser cutter VLS2.30 | Universal Laser Systems | https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros. | |
Multichannel Systems acquisition board | www.multichannelsystems.com | ||
NaOH pellets | Sigma Aldrich | 567530 | |
Parylene C dimer | SCS special coating systems coating | ||
PDMS Silgard 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System | SCS special coating systems | https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros | |
PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) | Goodfellow | ES301450 | |
Petri dishes | |||
Plasma cleaner Gambetti "Tucano" | Gambetti | https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros. | |
Positive photoresist AZ1518 | MicroChemicals | ||
Potassium iodide KI | Sigma Aldrich | 221945 | |
Source Meter 2636 | Keithley | https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros | |
Spin coater unit | Ossila | https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros. | |
Stereoscopic microscope SMZ745T | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
Thermal evaporator unit | |||
TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) | Sigma Aldrich | 716006 | |
Titanium wire | Goodfellow | TI005129 | |
Ultrasonic bath | Falc Instruments | https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro. |
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