JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ここでは、 インビトロ セルラーインターフェース用の有機電変調電変調トランジスタ(OCMFET)ベースのデバイスの製造プロトコルを紹介する。マイクロOCMFETアレイと呼ばれるこの装置は、柔軟で低コストで参照のないデバイスであり、電気活性細胞培養の電気的および代謝的活動のモニタリングを可能にします。

要約

現代の電気生理学は、ますます高度化するツールと材料の並行開発によって常に促進されてきました。さらに、この分野での発見は、過去50年間の印象的な成果を最終的に決定した前後のプロセスで技術の進歩を推進してきました。しかし、セルラーインターフェースに使用される最も採用されているデバイス(すなわち、トランジスタに基づくマイクロ電極アレイやマイクロエレクトロニクスデバイス)は、高コスト、材料の剛性、外部参照電極の存在など、いくつかの制限を依然として有しています。これらの課題を部分的に克服するために、有機バイオエレクトロニクスと呼ばれる新しい科学分野が発展し、低コスト、より便利な材料、革新的な製造技術などの利点をもたらしました。

細胞培養との間に便利にインターフェースするために、過去10年間にいくつかの興味深い新しい有機デバイスが提案されています。本論文では、有機電変調された電界効果トランジスタ(OCMFET)に基づく細胞インターフェース用デバイスの製造プロトコルを紹介する。マイクロOCMFETアレイ(MOA)と呼ばれるこれらのデバイスは、有機エレクトロニクスの利点とOCMFETの独特の特徴を組み合わせて、体心筋細胞およびニューロンの電気的および代謝活動を体質で監視することができる透明で柔軟で参照のないツールを準備し、電気細胞モデルのマルチパラメトリック評価を可能にします。

概要

ニューロンや心筋細胞などの電気活性細胞のインビボモニタリングは、人間の脳、機能接続性研究、薬理学、毒物学の基礎研究アプリケーションにおいて有効かつ強力なアプローチを表しています。このような研究のために通常使用されるツールは、主にマイクロ電極アレイ(MEA)1,2,3,4,5に基づいており、ますます効率的で強力な電界効果デバイス(FET)6,7,7,8,9,10,11,12.これらの2つのデバイスファミリーは、ニューロンと心筋細胞の電気活動のリアルタイムモニタリングと刺激を可能にし、通常は堅牢性、使いやすさ、信頼性によって特徴付けられる。これらの特徴はMEAおよびFEDを電気生理学的適用のための金本位にし、標準的な細胞培養物、オルガノピックの脳スライスおよび三次元オルガノイド13、14、15、16とのインターフェイスに現在使用されている。MEAやFEDは、その幅広い使用と印象的な特徴にもかかわらず、高コスト、材料の剛性、および通常はかさばる参照電極の存在など、いくつかの制限を提示し、測定液環境に配置する必要があり、デバイスの適切な動作に必要です。

細胞インターフェースの代替ソリューションを探求するために、有機材料と革新的な製造技術に基づく電子機器の研究に過去10年間で多くの努力が投資されてきました。前述の制限に対処するために研究されたいくつかの有機デバイスの中で、OCMFETと呼ばれる特異な有機トランジスタが最近MEAおよびFEDs18に代わる有効な代替手段として提案されている。低コストの材料や製造技術、最適な機械的・化学的特性、光学透過性、生体適合性などの有機エレクトロニクス技術が提供する標準機能に加えて、OCMFETは外部参照電極を必要とせずに超高電荷感度(二重ゲート構造による)を提供します。さらに、この有機センサは、トランジスタ領域19,20から分離されたセンシング領域の特定の機能化に応じて、異なる検体/物理的パラメータを検出する顕著な能力を有する。これらの機能はすべて、細胞培養内のさまざまなパラメータを取得するために便利に利用できます。特に、神経/心臓の電気的活性を検出できることに加えて、細胞代謝活性に起因するわずかな局所pH変動を確実にモニタリングする単純な物理的機能化21を用いてOCMFETの超高pH感受性を利用することもできる。

インビトロ細胞バイオセンシングにおいて、細胞代謝活性のモニタリングは、培養の状態の強力な指標であり、薬物投与および電気刺激などの様々な刺激に対する細胞応答を評価するために使用することができる22,23。さらに、神経用途の特定の場合には、特に薬理学および毒物学24において、電気的および代謝活動の両方をモニタリングすることは大きな関心事である。OCMFETの利点を提供しながら、現代の体外電気生理学の要件に便利に対処することを意図して、マイクロOCMFETアレイ(MOA)と呼ばれるデバイスが最近導入されました。MOAはOCMFETベースのアレイで、インビトロ細胞インターフェース用に特別に設計された特殊なセンシング領域を備え、電気原性細胞培養のマルチパラメトリック分析を可能にします。特に、2つのMOAチャネルは、その感度を最大化するためにより大きなセンシング領域を有し、培養培地のpH変動などの関心のある特定のパラメータを監視するために選択的に機能化することができる。構造内の他のOCMFETは、細胞外の電気活動センサーとして機能する。図1は、16チャンネルMOAの構造を示しています。この機能は、外部参照電極の存在と組み合わせることで、MOAをインビトロアプリケーションにとって非常に興味深いツールにします。この研究は、ニューロンおよび心筋細胞の電気および代謝活動のインビトロ検出のための多感性MOAの段階的な製造プロトコルを提示する。図2は、主な製造手順、使用する材料、およびデバイス構造を示しています。

プロトコル

動物のケアと使用に関するすべての適用対象の国際、国家、および/または制度的ガイドラインに従った。プロジェクトのための動物の数を減らし、彼らの苦しみを最小限に抑えるために、すべての努力がなされました。

1. 開発ソリューション、エッチング液、有機半導体溶液、フォトリソグラフィマスクの調製

  1. 175 mMの濃度でNaOHペレットを脱イオン水に希釈して、開発液を調製します。
    注:これは発熱反応です。プラスチック容器を使用する場合は、すべてのペレットが完全に溶解するまで、容器を攪拌し続けます。
  2. 脱イオン水(濃縮48%HFの1部、49部脱イオン水)にフッ化水素酸(HF)を希釈してチタンエッチング液を調製します。
    注意:フッ化水素酸は皮膚に容易に浸透し、深部組織層に深刻な損傷を引き起こす可能性があります。HFの急速な中和は、数日続き、重度の傷害またはさらには死亡をもたらす可能性のある組織破壊を防ぐために必要である。HFに関連するリスクは、酸との接触の濃度および期間に依存する。顔の盾を使用して、ヒュームフードの下でのみ使用してください。ダブルグローブも強くお勧めします。
  3. ヨウ素、ヨウ化カリウム、および脱イオン水を混合して金エッチング液を調製(溶液250gの場合、200mLの脱イオン水、20gのKI、I2の5gを使用する)。室温で溶液を1時間撹拌し、使用前に一晩休ませます。
  4. 6,13-ビス(トリイソプロピルシリレチルニル)ペンタセン(TIPSペンタセン)をアニソール(重量1%)に溶解し、80°Cのホットプレートで2時間軽く攪拌して半導体溶液を調製します。
    注:このソリューションを攪拌し続けます。アンバーガラスバイアルを使用し、低照度条件で保管してください。
  5. ベクトルグラフィックスソフトウェアで、希望のフォトリソグラフィマスクセットを準備します。プロセス全体に対して5つのマスクを用意します: フローティングゲート(FG)のパターニング用のマスク。電気生理学的録音のためのビアおよび感知区域の開口のためのマスク;自己整列プロセスのマスク。ソース、ドレインとコントロールゲートトップコンタクトのパターニングのためのマスク。pHチャネルのプラズマ活性化のためのマスク。
    メモ:必要な解像度と特定のフォトリソグラフィックの設定に応じて、異なる種類のマスクを使用することができます。提案されたデバイス(最大横解像度は40 μm)の場合、シンプルなプラスチック製のフレキシブルマスクは、地元のコピーショップで購入されています。

2. 基板の選択と準備

  1. 手付かずのPETシートから250μmポリエチレンテレフタレート(PET)の6 x 6 cm2 正方形を切ります。
    注:最終的なデバイスよりもわずかに大きな基板から始めて、損傷を与えることなく標準のラボピンセットで操作できる十分な幅の広いマージンを持っています。
  2. 深い溝や傷の存在を除外するために光学顕微鏡で基板を検査します。より大きな欠陥が最終的なデバイスの故障につながる可能性があるため、傷の少ない基板を慎重に選択してください。
  3. PET基質をアセトン、イソプロピルアルコール、脱イオン水(この順序)でリンスし、窒素の流れを用いて乾燥させます。きれいなプラスチックペトリ皿/容器に基材を保管してください。

3. FG:チタン蒸着

  1. プラズマ酸素(100Wで30s)で基板を事前に洗浄し、熱エバポレータの真空チャンバー内の基板ホルダーに置きます。
  2. 60mgのチタンをるつぼに入れ、シャッターを閉め、蒸発チャンバーを10-6 トルより低い真空レベルに達するまでポンプで送ります。るつぼが赤く輝くまで蒸発器のパワーを上げ、30 s待ちます。シャッターを開け、パワーを60%に上げ(またはるつぼが明るい白色になるまで)、60s待ちます。シャッターを閉め、電源を下げろ。
  3. 蒸発器から基板を取り外します。アセトン、イソプロピルアルコール、脱イオン水を使用してそれらをきれいにしてください。窒素の流れを使用してそれらを乾燥させます。チタン表面を僅かに酸化する第2酸素プラズマ処理(200Wで60s)を行う。

4. FG パターニング

  1. ヒュームフードの内側に置かれたスピンコーターに一度に1つの基板を置きます。使い捨てのプラスチックピペットを使用して基板上にフォトレジストの4 mLを堆積させる。2 μm厚のフォトレジスト層を得るために次のスピンコーティングパラメータを使用してください: スピン速度: 3000 rpm;スピン時間:45 s;加速時間:0.5 s;減速時間:0.5 s.
  2. ホットプレート(70°Cで5分間)に基板を置いてフォトレジストをソフトベークする。直接光の露出を避けるために、アルミホイル包装ペトリ皿/プラスチック容器の中に基板を保管してください。
    注:基板の変形を防ぐため、推奨されるベーク温度(50sの場合は100°C)を避けてください。しかし、より長い時間のために低い温度で焼くことは良い結果を保障する。
  3. デバイスをブロモグラフに配置し、プラスチック製のフォトリソグラフィマスクを目的のFGレイアウトで基板上に配置します。上から紫外線(UV)光を1分間照射し、マスクを慎重に取り外し、マスクを被傷を避けるため、マスクを基板上に横移動しないように注意してください。
  4. 現像液を充填したガラス容器に5s用の基板を突き落とす(ステップ1.1)。脱イオン水で素早くすすいで、窒素の下で乾燥させます。光学顕微鏡を使用して、基板内の未発達/未発達のスポットを探します。開発中の場合には、開発ソリューションで基板の浸漬を繰り返します。
  5. 露出したチタンをチタンエッチング液に15sの液中に沈め(ステップ1.2)し、脱イオン水ですすいで、窒素を用いて乾燥させる。基板を光学的に検査し、アセトンを用いてフォトレジストを取り外す。イソプロピルアルコールと脱イオン水で基板をリンスし、窒素で乾燥させます。

5. ゲート誘電体蒸着

  1. 塗布室壁に2mLの接着促進剤(シラン-3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート)を実験室ワイプで分配して、パリレンコーターの堆積チャンバーを準備します。パリレンコーターに300mgのパリレンCダイマー(最終厚さ150nmに相当)を置きます。低い圧力値を 7 mbar に、高い圧力値を 10 mbar に設定します。堆積後、アセトン、イソプロピルアルコール、脱イオン水で基材を洗浄し、窒素で乾燥させます。

6. 電気活動記録のためのOCMFETのセンシング領域の開放と、FGの背面にアクセスするビアの形成

  1. ステップ4.1および4.2の同じパラメータを使用して、基板上にフォトレジストを堆積させる。
  2. デバイスをブロモグラフに配置し、プラスチック製のフォトリソグラフィマスクをビアの基板(感知領域上の直径50μmの円形開口部、FG上の100 x 100 μm2 開口部)を検出領域( 図1 と 図2のFGの背面接触と呼ばれる)の上に配置して、精密な位置合わせを改善します。上から1分間紫外線に当て、マスクを慎重に取り外し、マスクを被傷を避けるために、マスクの基板上の横移動を最小限に抑えるように注意してください。
    注: 検出領域から離れた FG の側のビア( 図 1 および 図 2 の FG の背面接触として示されています)は、トランジスタの特性評価中の接触に必要です。さらに、FGへの電気的アクセスを有することは、機能化の異なるタイプ(例えば、電着)のために非常に有用であり得る。
  3. ステップ 4.4 で前述したようにフォトレジストを開発します。パターン化されたフォトレジスト(ここではマスクとして機能する)を用いて基板を酸素プラズマ(200Wで180s)に露出し、感知領域からパリレンCを除去する。
    注:200 Wの等方性プラズマクリーナーにおけるパリレンCのエッチング速度は約90nm/分です。センシング領域をさらに洗浄するために、わずかなオーバーエッチングが行われます。フォトレジストは、プロセス中にエッチングされます。しかし、その厚さ(2 μm)は、パリレンCのそれよりもはるかに高い。
  4. 基板を超音波浴の中にアセトンを充填したガラス容器に入れ、10sでフォトレジストを完全に除去します。基質をアセトン、イソプロピルアルコール、水でリンスし、窒素で乾燥させます。
    注:単にアセトンで基板をすすくう代わりに超音波処理を使用することは、感知領域の表面にパリレンC断片の望ましくない折りたたみや再堆積を防ぐために重要です。

7. FGによるソースとドレインの自己整列

  1. ステップ4.1および4.2の同じパラメータを使用して、基板上にフォトレジストを堆積させる。デバイスをブロモグラフに配置し、トランジスタの領域を完全に覆うシンプルな黒い長方形のプラスチック製のフォトリソグラフィマスクを基板に配置します。上面と底面の両方から1分間UV光に当て、マスクを慎重に取り外し、マスクを被傷を避けるために、基材上のマスクの横移動を最小限に抑えるように注意してください。
    注:両面露光では、FGは底面露出に対してフォトリソグラフィックマスクとして機能し、トップマスクの存在はトランジスタのチャンネルに存在するフォトレジストのみが露出していない状態に保たれている。
  2. ステップ 4.4 で前述したようにフォトレジストを開発します。

8. 金の堆積、チャネル形成、およびソース、ドレイン、および制御ゲートのパターニング

  1. パリレンC上の金属の密着性を促進し、熱蒸発器の真空チャンバー内の基板ホルダーに置くために、穏やかなプラズマ処理(30 Wで30 s)で基板を洗浄します。
  2. るつぼに30mgの金を入れ、シャッターを閉め、蒸発チャンバーを10-5 トルに達するまでポンプで送ります。るつぼが赤く輝くまで蒸発器のパワーを上げ、30 s待ちます。シャッターを切り、パワーを40%に上げ(または、るつぼが明るい白色に輝くまで)、60s待ってからシャッターを閉めて、電源を下げます。
  3. 基板を超音波浴内のアセトン容器に入れ、10sの超音波浴でフォトレジストを持ち上げ、トランジスタのチャネルから金を取り除きます。基質をアセトン、イソプロピルアルコール、水でリンスし、窒素で乾燥させます。ステップ4.1および4.2の同じパラメータを使用して、基板上にフォトレジストを堆積させる。
  4. デバイスをブロモグラフに配置し、プラスチック製のフォトリソグラフィマスクを基板に配置し、所望のソース、ドレイン、および制御ゲートレイアウトを使用します。上から1分間紫外線に当て、マスクを慎重に取り外し、マスクを被傷を避けるために、マスクの基板上の横移動を最小限に抑えるように注意してください。
  5. ステップ 4.4 で説明したようにフォトレジストを開発する。露出した金を金エッチング液に10sに浸してエッチングし(ステップ1.3)、脱イオン水ですすいで、窒素を使用して乾燥させます。基板を光学的に検査し、アセトンを用いてフォトレジストを取り外す。イソプロピルアルコールと脱イオン水ですすい、窒素で乾燥させます。

9. pHセンシング用パリレンCの蒸着と活性化

  1. ステップ4.1および4.2の同じパラメータを使用して、基板上にフォトレジストを堆積させる。
  2. デバイスをブロモグラフに配置し、OCMFETのpH感知領域に対応する開口部を持つプラスチック製のフォトリソグラフィマスクを基板に配置します。上から1分間紫外線に当て、マスクを慎重に取り外し、マスクを被傷を避けるために、マスクの基板上の横移動を最小限に抑えるように注意してください。
  3. ステップ 4.4 で説明したようにフォトレジストを開発する。pH-センシング領域を除き、ポリイミド絶縁テープでデバイス全体を保護します( 材料表を参照)。ステップ5.1に記載の同じパラメータを使用して、500nmのパリレンC(パリレンCダイマーの1gに相当する)を基板に付着させる。
    注: pH-センシング領域の総パリレン C 厚さは 650 nm です。この堆積にはシランは必要ありません。
  4. ポリイミド絶縁テープを慎重に取り外します。基板を酸素プラズマ(200 Wで5分、30 s)に露出し、OCMFETのpHセンシング領域でパリレンCを活性化します。
    注:ポリイミド絶縁テープは、パリレンCの堆積を制限するためにここに必要です。実際、フォトレジストを使用した簡単なリフトオフは、パリレンCで得られるコンフォーマルコーティングのほとんどピンホールフリーの性質のために肯定的な結果を与えません。
  5. 基板を超音波浴内のアセトン容器に入れ、フォトレジストを完全に除去します。基質をアセトンとイソプロピルアルコール(水なし)でリンスし、窒素で乾燥させます。

10. 半導体蒸着、培養チャンバの配置、およびPETからの装置の最終的な切り抜き

  1. 基板を50°Cのホットプレートに置きます。 半導体溶液(ステップ1.4)の液滴(1μL)を各チャンネル領域に投げ、基板全体を蓋で覆い、化学フードの下で30分間乾燥させます。
  2. 内径15mm、厚さ1mm、高さ7mmのアクリロニトリルブタジエンスチレンリングを3Dプリンタで印刷して、培養チャンバーを準備します。ポリジメチルシロキサン(硬化剤の比率:重量15%)を使用して、基板の中央部に培養チャンバーを接着します。手動またはレーザーカッターを使用して、PETからデバイスを切り取ります。

11. トランジスタの電気的特性

  1. ソースメーター18,19,20,21を使用して各トランジスタを特性化します(材料表を参照)。
    注: 出力と入力特性の両方を測定して、トランジスタのパラメータ(主にキャリアの移動度、閾値電圧、ION/IOFF 比、およびサブしきい値勾配)を推定する必要があります。

結果

MOAの可能性は、電気活動記録と代謝活動のモニタリングの両方のためにここで検証されています。細胞外作用電位を検出する装置の能力の正確な推定は、ラット心筋細胞培養物(特に 、8日間のインビトロ [DIV])18で測定された原発性ラット心筋細胞における)による徹底的な特徴付けに基づいていた。 図 3A は 、16 の OCMFET を備えた完全な MOA を示しています。上端のインセットは、MOAの表面に付着したコンフルエントラット心筋細胞培養の例を示す。彼らの健康を強調するために、細胞は記録セッションの後に肉体タンパク質、トロポミオシンについて免疫染色されている。下端のインセットは、OCMFETで測定された単一の心筋細胞信号を示す。

興味深いことに、 装置は、図3Bに示すように、自発的な電気的活動および異なる化学物質の投与に誘発される活動を検出することができた。この検証は、このアプローチを電気細胞インターフェースに使用することの実現可能性を実証するために非常に重要でした。配列構成のため、MOAは心臓信号の伝搬速度の再構築を可能にし、従って細胞ネットワークの研究のためのシステムの適合性を示す(図3C)。さらに検証してデバイスの実際の検出限界を決定するために、MOAは線条体ニューロン(21 DIV)18でテストされ、信号振幅と記録の信頼性という点で興味深い結果が得られました。 図3Dに示すように、OCMFETは、驚くべき安定性を持つニューロン電位を増幅し、最大3.2の信号対雑音比(SNRS)を示す(標準MEAs25で得られたSNRと同じ範囲で)。記録設定は、トランジスタバイアス用のカスタムマルチチャンネルエレクトロニクスと信号の読み出しとコンディショニングで構成されていました。電気記録用の各チャンネルには、1 MΩのフィードバック抵抗を備えたI/Vコンバータと、電圧ゲイン110の150 Hz-1.3 kHzバンドパスフィルタからなる第1段階があります。提示された全ての測定では、トランジスタはVDS = VGS = -1 Vと偏っていた。A/D 変換とデータの可視化と保存は、データ取得ボードを使用して実行されました ( 材料表を参照)。すべての測定セッションは、システム上の電気的な環境騒音を最小限に抑えるためにファラデーケージ内で行われました。

前述のように、プロトコルで提示された単純な物理的機能化を利用することによって、超nernstian応答を有する高感度pHセンサを準備することが可能であった。提示された製造アプローチのために、これらのpHデバイスはMOAに統合され、一次海馬ラットニューロン26の代謝活性によって誘発されるわずかなpH変動を監視するために使用することができる。特に、 図4に示すように、低周波センシング専用の2つのOCMFFETのうち1つだけが選択的に機能し、アプローチの実現可能性を実証した。この選択的機能化により、化学的に誘発された代謝変動に対する2つのOCMFETの応答の評価が可能となった:特に、GABA A受容体27の阻害剤であるビクキュリン(BIC)を用いて高い代謝状態を得ることができるが、テトロドトキシン(TTX)の添加によって低代謝状態を誘発することができ、最終的に細胞死を引き起こす288.記録設定は、電子活動測定に使用されるのと同じカスタムマルチチャネルエレクトロニクスで構成されていました。

前のケースとは異なり, 2 つの専用チャネルを使用して細胞代謝活性によって誘発される遅い変化.各チャンネルは、1 MΩのフィードバック抵抗を備えたI/Vコンバータと、カットオフ周波数が10Hzのローパスフィルタの2つのメインブロックで構成されたシンプルな回路で構成されていました。トランジスタはVDS = VGS = -1 Vに偏っており、すべての測定はファラデーケージ内で行われ、外部ノイズが記録に与える影響を最小限に抑えました(これは細胞代謝活性によって引き起こされる低電流変動を考慮すると特に重要な側面です)。実験中、培養液を低緩衝培地に保持し、システム全体を制御された環境(37°Cおよび連続CO2/気流束)に配置した。予想通り、25 μM BICを追加することで、pH感受性OCMFETの電流のみ変調することができました。これは、細胞代謝活性の対応する変動によって電流変動の誘導によってさらに確認された。

10 μM TTXを添加した後も同じ実験を繰り返し、細胞代謝が徐々に低下した。TTXの添加に続いて、pH感受性OCMFETもpH感受性のものも、いかなる応答も示さなかったため、アプローチの有効性を実証した。これらの結果は、提案された機能化の有効性と最大2週間の相対的安定性を示す。提案された実験(電気活性と代謝活性の両方)から引き出すことができる重要な結論は、同じ培養領域内で異なるOCMFETを選択的に機能させることによって異なる種類のセンサーを調製することができるということです。この側面は、同じ細胞培養中の異なるパラメータを監視できることが、それらの生物学的システムの複雑さのより良い特性評価のために重要であるため、細胞アプリケーションのバイオセンシングにおける非自明な成果を表しています。

figure-results-2774
図1:電気活性細胞の代謝および電気的モニタリングのための16チャンネルMOAのトップビュー。 スケールバー= 1 cm略称: OCMFET = 有機電変調された電界効果トランジスタ;FG = フローティングゲート;S/D = ソース/ドレイン;MOA = マイクロ OCMFET アレイ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3251
図2:電気活性細胞の代謝および電気的モニタリングのためのMOAの主な製造ステップ。 (AおよびB)蒸発したTiフィルムは、標準のフォトリソグラフィプロセスを用いてパターン化され、OCMFETのフローティングゲートを調製する。(C) 15nmのパリレンCの堆積物。この層は、天然の酸化チと共に、トランジスタのゲート誘電体として機能する。(D及びE)パリレンC層は、プラズマ酸素処理を用いてパターン化される。パターン化されたフォトレジスト層は、電気記録およびフローティングゲートバックコンタクトのセンシング領域を選択的に露出させるために使用されます。(F) Auトップコンタクト、すなわちソース、ドレイン、コントロールゲート、およびフローティングゲートバックコンタクトのパターン化。自己整列技術は、デバイスの電気的性能を向上させるために使用されます。(G-I)代謝活動モニタリングのためのOCMFETのセンシング領域上のパリレンCの第2層の堆積。酸素プラズマ暴露後、この層はpH感受性膜(J)として作用する。(K)有機半導体(TIPSペンタセン)と培養室の位置付け後の完全なMOA(材料付き)の断面。略称: OCMFET = 有機電変調された電界効果トランジスタ;FG = フローティングゲート;S/D = ソース/ドレイン;MOA = マイクロ OCMFET アレイ;CG = 制御ゲート;PET = ポリエチレンテレフタレート;パーC = パリレンC;TIPS = 6,13-ビス(トリイソプロピルシリレチルニル) ペンタセン;ABS = アクリロニトリル ブタジエン スチレン。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4460
図3:MOAを用いた細胞電気活動記録 (A)MOAの表面に付着したラット心筋細胞(8 DIV)のコンフルエント培養は、肉体タンパク質、トロペスミオシン(上部インセット)に対する記録セッションおよび免疫染色後に固定される。ボトムインセット:OCMFETで測定された単一の心筋細胞信号の例。スケールバー=150μm(B)心筋細胞培養物の電気的活動の化学調整。活性加速度は100 mMノルエピネフリンの添加に起因し、抑制は100 mMベラパミルの添加に起因した。左:周波数変調を打つ;右:5 OCMFET平均と標準偏差の統計:基礎の4分のスパイクカウント(129±4.6)、ノルエピネフリン媒介物(280±28.6)およびベラパミル媒介活性(15±1.9)。(C) 心臓信号の伝搬の再構築。右:地点14からサイト41への信号の伝播を示す培養物の自発的な活動のラスタプロット(右)。(D)ラット胚由来の線条体細胞の作用電位(21DIV)。この図は 18から変更されています。略語: OCMFET = 有機電荷変調された電界効果トランジスタ;MOA = マイクロ OCMFET アレイ;NE = ノルエピネフリン;VER = ベラパミル;DIV = インビトロの日数。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5423
図4:MOAを用いて代謝活性記録を行う。 (A)TTXの10 μMの添加の前後に25 μM BICを加えたMOAのpH感受性および(B)pH感受性チャネルの応答。TTX添加後、pH感受性チャネルの挙動は、pH感受性チャネルの動作と同様になる。特に、TTX誘発細胞死によるBIC添加後の電流変動は認められない。(C) 代謝活性記録のための MOA.pH感受性およびpH感受性のOCMFETsはそれぞれ緑および赤で概説される。インセット:15 DIVの後にデバイス上で培養された健康な海馬ニューロン。この数字は 26から変更されています。略語: OCMFET = 有機電荷変調された電界効果トランジスタ;MOA = マイクロ OCMFET アレイ;BIC = ビキュクリン;TTX = テトロドトキシン;DIV = インビトロの日数。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

細胞アプリケーション用OCMFETの製造のための以前の方法とは異なり、提案された方法は、電気的および代謝的細胞活動を同時に検出できるMOAを調製するように特別に設計されている。さらに、pH感度を達成するためのこのアプローチは、標準的な製造プロトコルと互換性があり、センシング領域の化学修飾を伴わないという利点を有する(この側面は、デバイス全体の生体適合性を保証する)。pH感度は、ゲート誘電体(すなわち、生体適合性のパリレンC)として使用されるのと同じ材料を使用して達成され、このアプローチは速く、再生可能にする。

このアプローチの最終結果は、 インビトロ セルラーアプリケーション用の柔軟で透明で低コストで多量感性の有機ツールです。これは、単一のトランジスタ構造とセンシング領域の簡単な物理的な変更を使用して得ることができるという事実は、有機電子材料および方法の使用によって提供される利点を追加します。また、OCMFETの導入原理は特定の半導体やFG材料に厳密に依存しないため、プロセス全体を特定の用途に応じて変更・アップスケールすることができます。

提案された技術の重要な側面は、プラズマ活性化技術の再現性に関連している。一貫した結果を得るためには、パリレンCの厚さおよびそのエッチングレートの両方を制御する必要があります。パリレンC蒸着プロセスとプラズマクリーナーの頻繁なキャリブレーションは絶対に必要です。また、プロセスの再現性にも寄与する重要な側面として、デバイスの取り扱いや有機半導体の堆積化が重要です。ここでは、再現性の限界を本質的に生かしたシンプルなドロップキャスティング技術が使用されました。これらの問題を最小限に抑えるために、プロトコルステップ10.1で説明したように、同じ量の半導体溶液を毎回使用し、溶媒蒸発を可能な限り標準化すべきである。ホットプレートを使用して一定の温度を維持し、各液滴堆積後に基板を覆うことは、蒸発プロセスを遅くするのに役立ちます。この問題をさらに最小限に抑えるために、堆積技術(例えば、インクジェット印刷法を用いて)を切り替え可能である。

提案されたプロトコルの制限は、pHセンシングのためのOCMFETの機能化の性質に由来する。pHセンサーの安定性は、数週間26に制限されています。しかし、提案されたアプローチの安定性ウィンドウは、神経培養の成長に必要な標準的なインキュベーション時間(2〜3週間)をカバーするのに十分大きい。他のタイプのセンシング領域の機能化は、より長い実験のために考慮されるべきである。製造プロトコルは、専用のバックコンタクトを使用して、FGsへの電気的アクセスを可能にします。この接触は、デバイスの正常な動作中に浮いたままで、異なる技術(例えば、電着)を使用して、デバイスの電気的特性とセンシング領域の機能化のために利用することができる。

この手順は、広い材料やクリーンルーム設備を必要とせずに、セルラーアプリケーション用のマルチセンシングデバイスを準備するための便利な方法を表します。有機半導体の採用とセンシング領域の物理的(化学的ではない)機能化による性能と安定性の制限にもかかわらず、同様のアプローチを使用して、低コスト(および潜在的に使い捨て)、機械的に柔軟で光学的に透明なセンサーとバイオセンサーを準備することができ、細胞生物学、組織工学、神経科学の研究者に 生体外の細胞システムを研究するための新しい特殊なツールを提供することができます。

開示事項

著者は宣言する利害の対立を持っていません。

謝辞

著者らは、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムによる助成金第882897-検索&レスキュープロジェクトおよびPNR2015-2020 ARS01_00996 PONプロジェクト「TEX-STYLE」の助成金を認めている。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylateSigma Aldrich440159
3D printer Makerbot Replicator 2xMakerbothttps://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros.
ABS filament
AnisoleSigma Aldrich296295
Bromograph model HellasBungardhttps://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros.
GoldLocal seller
Hydrofluoric acidSigma Aldrich695068
IodineSigma Aldrich207772
Kapton tapepolyimide insulation tape
Laser cutter VLS2.30Universal Laser Systemshttps://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros.
Multichannel Systems acquisition boardwww.multichannelsystems.com
NaOH pelletsSigma Aldrich567530
Parylene C dimerSCS special coating systems coating
PDMS Silgard 184Sigma Aldrich761036
PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition SystemSCS special coating systemshttps://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros
PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm)GoodfellowES301450
Petri dishes
Plasma cleaner Gambetti "Tucano"Gambettihttps://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros.
Positive photoresist AZ1518MicroChemicals
Potassium iodide KISigma Aldrich221945
Source Meter 2636Keithleyhttps://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros
Spin coater unitOssilahttps://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros.
Stereoscopic microscope SMZ745TNikonhttps://www.microscope.healthcare.nikon.
com/. Estimated price: 2k-3k euros.
Thermal evaporator unit
TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene)Sigma Aldrich716006
Titanium wireGoodfellowTI005129
Ultrasonic bathFalc Instrumentshttps://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro.

参考文献

  1. Hubel, D. H. Tungsten microelectrode for recording from single units. Science. 125 (3247), 549-550 (1957).
  2. Verzeano, M., Negishi, K., Angeles, L. Neuronal activity in cortical and thalamic networks. A study with multiple microelectrodes. Journal of General Physiology. 43 (6), 177-195 (1960).
  3. Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74 (1), 61-66 (1972).
  4. Grattarola, M., Martinoia, S. Modeling the neuron-microtransducer junction: from extracellular to patch recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (1), 35-41 (1993).
  5. Wallace, K., Strickland, J. D., Valdivia, P., Mundy, W. R., Shafer, T. J. A multiplexed assay for determination of neurotoxicant effects on spontaneous network activity and viability from microelectrode arrays. NeuroToxicology. 49, 79-85 (2015).
  6. Bergveld, P. Development, operation, and application of the tool for electrophysiology. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 19 (5), 342-351 (1972).
  7. Bergveld, P., Wiersma, J., Meertens, H. Extracellular potential recordings by means of a field effect transistor without gate metal, called OSFET. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 23 (2), 136-144 (1976).
  8. Fromherz, P., Offenhausser, A., Vetter, T., Weis, J. A neuron-silicon junction: a Retzius cell of the leech on an insulated-gate field-effect transistor. Science. 252 (5010), 1290-1293 (1991).
  9. Martinoia, S., et al. Development of ISFET array-based microsystems for bioelectrochemical measurements of cell populations. Biosensors and Bioelectronics. 16 (9-12), 1043-1050 (2001).
  10. Heer, F., et al. CMOS microelectrode array for the monitoring of electrogenic cells. Biosensors and Bioelectronics. 20 (2), 358-366 (2004).
  11. Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab on a Chip. 9 (18), 2644-2651 (2009).
  12. Maccione, A., et al. Multiscale functional connectivity estimation on low-density neuronal cultures recorded by high-density CMOS micro electrode arrays. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 161-171 (2012).
  13. Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
  14. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Scientific Reports. 4, 5489 (2014).
  15. Zuo, L., Yu, S., Briggs, C. A., Kantor, S., Pan, J. Y. Design and fabrication of a three-dimensional multi-electrode array for neuron electrophysiology. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (12), (2017).
  16. Spanu, A., et al. A three-dimensional micro-electrode array for in-vitro neuronal interfacing. Journal of Neural Engineering. 17 (3), 036033 (2020).
  17. Spanu, A., Martines, L., Bonfiglio, A. Interfacing cells with organic transistors: a review of in vitro and in vivo applications. Lab on a Chip. 21 (5), 795-820 (2021).
  18. Spanu, A., et al. An organic transistor-based system for reference-less electrophysiological monitoring of excitable cells. Scientific Reports. 5, 8807 (2015).
  19. Viola, F. A., Spanu, A., Ricci, P. C., Bonfiglio, A., Cosseddu, P. Ultrathin, flexible and multimodal tactile sensors based on organic field-effect transistors. Scientific Reports. 8, 8073 (2018).
  20. Napoli, C., et al. Electronic detection of DNA hybridization by coupling organic field-effect transistor-based sensors and hairpin-shaped probes. Sensors. 18 (4), 990 (2018).
  21. Spanu, A., et al. A reference-less pH sensor based on an organic field effect transistor with tunable sensitivity. Organic Electronics. 48, 188-193 (2017).
  22. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
  23. Zhang, Y. S., et al. Multisensor-integrated organs-on-chips platform for automated and continual in situ monitoring of organoid behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 2293-2302 (2017).
  24. Yu, H., et al. A novel design of multifunctional integrated cell-based biosensors for simultaneously detecting cell acidification and extracellular potential. Biosensors and Bioelectronics. 24 (5), 1462-1468 (2009).
  25. Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
  26. Spanu, A., Tedesco, M. T., Martines, L., Martinoia, S., Bonfiglio, A. An organic neurophysiological tool for neuronal metabolic activity monitoring. APL Bioengineering. 2 (4), 046105 (2018).
  27. Díaz-García, C. M., et al. Neuronal stimulation triggers neuronal glycolysis and not lactate uptake. Cell Metabolism. 26 (2), 361-374 (2017).
  28. Xie, Y., Dengler, K., Zacharias, E., Wilffert, B., Tegtmeier, F. Effects of the sodium channel blocker tetrodotoxin (TTX) on cellular ion homeostasis in rat brain subjected to complete ischemia. Brain Research. 652 (2), 216-224 (1994).
  29. Caboni, A., Orgiu, E., Barbaro, M., Bonfiglio, A. Flexible organic thin-film transistors for pH monitoring. IEEE Sensors Journal. 9 (12), 1963-1970 (2009).
  30. Fraboni, B., Bonfiglio, A., Basiricò, L. Inkjet printing of transparent, flexible, organic transistors. Thin Solid Films. 520, 1291-1294 (2011).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

175

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved