In vitro Analyse cellulaire multiparamétrique par des réseaux de transistors à effet de champ à modulation de charge micro organique

Résumé

Nous présentons ici le protocole de fabrication d’un dispositif à transistor à effet de champ à modulation de charge organique (OCMFET) pour l’interfaçage cellulaire in vitro . Le dispositif, appelé micro réseau OCMFET, est un dispositif flexible, peu coûteux et sans référence, qui permettra de surveiller les activités électriques et métaboliques des cultures cellulaires électroactives.

Résumé

L’électrophysiologie moderne a été constamment alimentée par le développement parallèle d’outils et de matériaux de plus en plus sophistiqués. À leur tour, les découvertes dans ce domaine ont entraîné des progrès technologiques dans un processus de va-et-vient qui a finalement déterminé les réalisations impressionnantes des 50 dernières années. Cependant, les dispositifs les plus utilisés pour l’interfaçage cellulaire (à savoir, les réseaux de microélectrodes et les dispositifs microélectroniques basés sur des transistors) présentent encore plusieurs limitations telles que le coût élevé, la rigidité des matériaux et la présence d’une électrode de référence externe. Pour surmonter partiellement ces problèmes, il y a eu des développements dans un nouveau domaine scientifique appelé bioélectronique organique, ce qui a entraîné des avantages tels que des coûts inférieurs, des matériaux plus pratiques et des techniques de fabrication innovantes.

Plusieurs nouveaux dispositifs organiques intéressants ont été proposés au cours de la dernière décennie pour s’interfacer facilement avec les cultures cellulaires. Cet article présente le protocole de fabrication de dispositifs d’interfaçage cellulaire basés sur le transistor à effet de champ à modulation de charge organique (OCMFET). Ces dispositifs, appelés micro réseaux OCMFET (MOA), combinent les avantages de l’électronique organique et les caractéristiques particulières de l’OCMFET pour préparer des outils transparents, flexibles et sans référence avec lesquels il est possible de surveiller à la fois les activités électriques et métaboliques des cardiomyocytes et des neurones in vitro, permettant ainsi une évaluation multiparamétrique des modèles cellulaires électrogéniques.

Introduction

La surveillance in vivo des cellules électroactives, telles que les neurones et les cardiomyocytes, représente une approche valide et puissante dans les applications de recherche fondamentale pour le cerveau humain, les études de connectivité fonctionnelle, la pharmacologie et la toxicologie. Les outils habituellement utilisés pour de telles études sont principalement basés sur des réseaux de microélectrodes (MEA)^1,2,3,4,5 et des dispositifs à effet de champ (FED) de plus en plus efficaces et puissants 6,7,8,9,10,11,12 . Ces deux familles d’appareils permettent la surveillance et la stimulation en temps réel de l’activité électrique des neurones et des cardiomyocytes et se caractérisent généralement par leur robustesse, leur facilité d’utilisation et leur fiabilité. Ces caractéristiques font des MEA et des FED la référence en matière d’applications électrophysiologiques, étant actuellement utilisées pour s’interfacer avec des cultures cellulaires standard, des tranches de cerveau organotypiques et des organoïdes tridimensionnels13,14,15,16. Malgré leur utilisation répandue et leurs caractéristiques impressionnantes, les MEA et les FED présentent certaines limitations telles que le coût élevé, la rigidité des matériaux et la présence d’une électrode de référence généralement volumineuse, qui doit être placée dans l’environnement liquide de mesure et est nécessaire au bon fonctionnement des dispositifs.

Pour explorer des solutions alternatives pour l’interfaçage cellulaire, beaucoup d’efforts ont été investis au cours de la dernière décennie dans l’étude des dispositifs électroniques basés sur des matériaux organiques et des techniques de fabrication ^innovantes17. Parmi les nombreux dispositifs organiques étudiés pour répondre aux limitations susmentionnées, un transistor organique particulier appelé OCMFET a récemment été proposé comme alternative valable aux MEA et ^FEDs18. En plus des caractéristiques standard offertes par la technologie de l’électronique organique, telles que les matériaux et les techniques de fabrication à faible coût, les propriétés mécaniques et chimiques optimales, la transparence optique et la biocompatibilité, l’OCMFET offre également une sensibilité de charge ultra-élevée (en raison de sa structure à double porte) sans avoir besoin d’une électrode de référence externe. De plus, ce capteur organique a la capacité remarquable de détecter différents paramètres analytiques/physiques, en fonction de la fonctionnalisation spécifique de sa zone de détection, qui est séparée de la zone du ^{transistor19,20}. Toutes ces caractéristiques peuvent être facilement exploitées pour l’acquisition de différents paramètres au sein d’une culture cellulaire. En particulier, en plus de pouvoir détecter l’activité électrique neuronale/cardiaque, il est également possible d’exploiter la sensibilité au pH ultra-élevée offerte par la structure à double porte particulière de l’OCMFET en utilisant une simple fonctionnalisation ^physique21 pour surveiller de manière fiable les légères variations locales de pH causées par l’activité métabolique cellulaire.

Dans la biodétection cellulaire in vitro, la surveillance de l’activité métabolique cellulaire est un indicateur puissant de l’état de la culture et peut être utilisée pour évaluer la réponse cellulaire à divers stimuli, tels que l’administration de médicaments et la stimulation ^{électrique22,23}. De plus, dans le cas spécifique des applications neuronales, la surveillance des activités électriques et métaboliques est d’un grand intérêt, en particulier en pharmacologie et en ^{toxicologie24}. Dans le but de répondre facilement aux exigences de l’électrophysiologie in vitro moderne tout en offrant tous les avantages de l’OCMFET, un dispositif appelé Micro OCMFET Array (MOA) a été récemment introduit. Le MOA est un réseau basé sur OCMFET avec des zones de détection spécialisées spécialement conçues pour l’interfaçage cellulaire in vitro, permettant l’analyse multiparamétrique de cultures de cellules électrogéniques. En particulier, deux canaux MOA ont des zones de détection plus grandes pour maximiser leur sensibilité et peuvent être fonctionnalisés de manière sélective pour surveiller des paramètres spécifiques d’intérêt, tels que les variations de pH du milieu de culture. Les autres OCMFET de la structure agissent comme des capteurs d’activité électrique extracellulaires. La figure 1 montre la structure d’un protocole d’accord à 16 canaux. Cette capacité, combinée à l’absence d’électrode de référence externe, fait du MOA un outil très intéressant pour les applications in vitro. Ce travail présente le protocole de fabrication étape par étape d’un protocole d’accord multidétection pour la détection in vitro des activités électriques et métaboliques des neurones et des cardiomyocytes. La figure 2 montre les principales étapes de fabrication, les matériaux utilisés et la structure de l’appareil.

Protocole

Toutes les lignes directrices internationales, nationales et/ou institutionnelles applicables pour le soin et l’utilisation des animaux ont été suivies. Tous les efforts ont été faits pour réduire le nombre d’animaux pour le projet et minimiser leurs souffrances.

1. Préparation de la solution en développement, des solutions de gravure, de la solution semi-conductrice organique et des masques photolithographiques

1. Préparer la solution en développement en diluant les granulés de NaOH dans de l’eau désionisée à une concentration de 175 mM.
   REMARQUE: Il s’agit d’une réaction exothermique. Si un récipient en plastique est utilisé, continuez à agiter le récipient jusqu’à ce que tous les granulés soient complètement dissous.
2. Préparer la solution de gravure au titane en diluant l’acide fluorhydrique (HF) dans de l’eau désionisée (1 partie d’eau concentrée à 48% HF, 49 parties d’eau désionisée).
   ATTENTION: L’acide fluorhydrique peut facilement pénétrer dans la peau, causant de graves dommages aux couches profondes des tissus. La neutralisation rapide de l’IC est nécessaire pour prévenir la destruction des tissus, qui peut se poursuivre pendant des jours et entraîner des blessures graves ou même la mort. Les risques associés à l’IC dépendent de la concentration et de la durée du contact avec l’acide. Utilisez uniquement sous une hotte à l’aide d’un écran facial. Le double gloving est également fortement recommandé.
3. Préparer la solution de gravure à l’or en mélangeant de l’iode, de l’iodure de potassium et de l’eau désionisée (pour 250 g de solution, utilisez 200 mL d’eau désionisée, 20 g de KI, 5 g de _I2). Remuer la solution à température ambiante pendant 1 h et la laisser reposer toute la nuit avant utilisation.
4. Préparer la solution semi-conductrice en dissolvant le 6,13-bis(triisopropylsilylethynyl) pentacène (TIPS Pentacene) dans l’anisole (1% en poids) et en remuant doucement pendant 2 h sur une plaque chauffante à 80 °C.
   REMARQUE: Continuez à agiter cette solution. Utilisez des flacons en verre ambré et/ou conservez-les dans des conditions de faible luminosité.
5. Préparez le jeu de masques photolithographiques souhaité avec un logiciel de graphiques vectoriels. Préparez 5 masques pour l’ensemble du processus: le masque pour le modelage des portes flottantes (FG); le masque pour l’ouverture des vias et les zones de détection pour les enregistrements électrophysiologiques; le masque pour le processus d’auto-alignement; le masque pour le modelage du contact supérieur de la source, du drain et de la porte de contrôle; et le masque pour l’activation plasmatique des canaux de pH.
   REMARQUE: En fonction de la résolution nécessaire et de la configuration photolithographique spécifique, différents types de masques peuvent être utilisés. Dans le cas des appareils proposés (qui ont une résolution latérale maximale de 40 μm), de simples masques souples en plastique ont été achetés dans un atelier de photocopie local.

2. Sélection et préparation du substrat

1. Découpez un carré de 6 x 6 ^cm2 de polyéthylène téréphtalate (PET) de 250 μm à partir d’une feuille de PET immaculée.
   REMARQUE: Commencez avec un substrat légèrement plus grand que l’appareil final pour avoir des marges suffisamment larges pour permettre la manipulation avec une pince de laboratoire standard sans l’endommager.
2. Inspectez le substrat avec un microscope optique pour exclure la présence de rainures profondes et de rayures. Sélectionnez soigneusement les substrats les moins rayés, car des imperfections plus importantes peuvent entraîner la défaillance de l’appareil final.
3. Rincez les substrats PET avec de l’acétone, de l’alcool isopropylique et de l’eau désionisée (dans cet ordre) et séchez-les à l’aide de flux d’azote. Conservez les substrats dans des boîtes/récipients de Petri en plastique propre.

3. FG: dépôt de titane

1. Pré-nettoyez les substrats avec de l’oxygène plasma (30 s à 100 W) et placez-les sur le support de substrat à l’intérieur de la chambre à vide de l’évaporateur thermique.
2. Placez 60 mg de titane dans le creuset, fermez l’obturateur et pompez la chambre d’évaporation jusqu’à ce qu’elle atteigne un niveau de vide inférieur à ^10-6 Torr. Augmentez la puissance de l’évaporateur jusqu’à ce que le creuset brille en rouge et attendez 30 s. Ouvrez l’obturateur, augmentez la puissance à 60% (ou jusqu’à ce que le creuset brille d’un blanc éclatant) et attendez 60 s. Fermez l’obturateur et coupez l’alimentation.
3. Retirez les substrats de l’évaporateur; nettoyez-les à l’aide d’acétone, d’alcool isopropylique et d’eau désionisée; et les sécher à l’aide de flux d’azote. Effectuer un deuxième traitement au plasma à l’oxygène (60 s à 200 W) pour oxyder légèrement la surface du titane.

4. Motifs FG

1. Placez un substrat à la fois sur le revêtement de spin placé à l’intérieur d’une hotte. Déposez 4 mL de résine photosensible sur le substrat à l’aide d’une pipette en plastique jetable. Utilisez les paramètres de revêtement de spin suivants pour obtenir une couche de résine photosensible de 2 μm d’épaisseur : vitesse de rotation : 3000 tr/min ; temps de rotation: 45 s; temps d’accélération: 0,5 s; temps de décélération: 0,5 s.
2. Cuire doucement la résine photosensible en plaçant le substrat sur une plaque chauffante (70 °C pendant 5 min). Conservez le substrat à l’intérieur d’une boîte de Petri / d’un récipient en plastique enveloppé de papier d’aluminium pour éviter toute exposition directe à la lumière.
   REMARQUE: Évitez la température de cuisson suggérée (100 ° C pendant 50 s) pour éviter la déformation du substrat. Cependant, la cuisson à une température plus basse pendant une période plus longue garantit de bons résultats.
3. Placez l’appareil dans un bromographe et positionnez le masque photolithographique en plastique avec la disposition FG souhaitée sur le substrat. Exposez à la lumière ultraviolette (UV) par le haut pendant 1 min et retirez soigneusement le masque, en prenant soin de minimiser les mouvements latéraux du masque sur le substrat pour éviter de le rayer.
4. Plonger le substrat pendant 5 s dans un récipient en verre rempli de la solution en développement (étape 1.1). Rincez-le rapidement à l’eau désionisée et séchez-le sous azote. Utilisez un microscope optique pour rechercher des taches sous-développées / surdéveloppées dans le substrat. Répétez l’immersion du substrat dans la solution en développement en cas de sous-développement.
5. Gravez le titane exposé en le submergeant dans la solution de gravure au titane (étape 1.2) pendant 15 s, rincez-le à l’eau désionisée et séchez-le à l’azote. Inspectez optiquement le substrat et retirez la résine photosensible à l’aide d’acétone. Rincez le substrat avec de l’alcool isopropylique et de l’eau désionisée, puis séchez-le avec de l’azote.

5. Dépôt diélectrique de la porte

1. Préparer la chambre de dépôt de l’enduit de parylène en répartissant 2 mL du promoteur d’adhérence (méthacrylate de silane -3-(triméthoxysilyl)propyle) sur les parois de la chambre de dépôt à l’aide d’une lingette de laboratoire. Placer 300 mg de dimère de parylène C (correspondant à une épaisseur finale de 150 nm) sur l’enduit de parylène. Réglez la valeur de pression inférieure sur 7 mbar et la valeur de pression supérieure sur 10 mbar. Après le dépôt, nettoyez les substrats avec de l’acétone, de l’alcool isopropylique et de l’eau désionisée, puis séchez-les avec de l’azote.

6. Ouverture des zones de détection de l’OCMFET pour l’enregistrement de l’activité électrique et formation des vias pour accéder à l’arrière des FG

1. Déposez la résine photosensible sur les substrats en utilisant les mêmes paramètres que les étapes 4.1 et 4.2.
2. Placez l’appareil dans un bromographe et placez le masque photolithographique en plastique sur le substrat pour les vias (ouvertures circulaires d’un diamètre de 50 μm sur les zones de détection et ouvertures de 100 x 100 ^μm2 sur les FG éloignées des zones de détection (appelée contact arrière des FG dans les figures 1 et 2)) sous un microscope stéréoscopique pour améliorer la précision de l’alignement. Exposez à la lumière UV par le haut pendant 1 min et retirez soigneusement le masque, en prenant soin de minimiser les mouvements latéraux du masque sur le substrat pour éviter de le rayer.
   REMARQUE: Les vias sur le côté des FG éloignés de la zone de détection (représentés comme contact arrière des FG dans les figures 1 et 2) sont nécessaires pour le contact lors de la caractérisation du transistor. De plus, avoir un accès électrique aux FG peut être très utile pour différents types de fonctionnalisation (par exemple, l’électrodéposition).
3. Développez la résine photosensible comme décrit précédemment à l’étape 4.4. Exposez le substrat avec la résine photosensible à motifs (qui agit ici comme un masque) au plasma d’oxygène (180 s à 200 W) pour éliminer le parylène C des zones de détection.
   REMARQUE: La vitesse de gravure du parylène C dans un nettoyeur à plasma isotrope à 200 W est d’environ 90 nm / min. Une légère surgravure est effectuée pour nettoyer davantage les zones de détection. La résine photosensible est également gravée pendant le processus. Cependant, son épaisseur (2 μm) est beaucoup plus élevée que celle du Parylène C.
4. Placez les substrats dans un récipient en verre rempli d’acétone à l’intérieur du bain à ultrasons pendant 10 s pour éliminer complètement la résine photosensible. Rincez les substrats avec de l’acétone, de l’alcool isopropylique et de l’eau et séchez-les avec de l’azote.
   REMARQUE: L’utilisation de la sonication au lieu de simplement rincer les substrats avec de l’acétone est cruciale pour éviter le repliement et le redéposition indésirables des fragments de parylène C sur la surface des zones de détection.

7. Auto-alignement de la source et du drain avec le FG

1. Déposez la résine photosensible sur les substrats en utilisant les mêmes paramètres que les étapes 4.1 et 4.2. Placez l’appareil dans un bromographe et placez sur le substrat un masque photolithographique en plastique avec de simples rectangles noirs qui couvrent complètement les zones du transistor. Exposez à la lumière UV pendant 1 min à partir du haut et du bas, et retirez soigneusement le masque, en prenant soin de minimiser les mouvements latéraux du masque sur le substrat pour éviter de le rayer.
   REMARQUE: Avec l’exposition double face, les FG agissent comme des masques photolithographiques par rapport à l’exposition inférieure, tandis que la présence du masque supérieur garantit que seule la résine photosensible présente sur le canal des transistors reste non exposée.
2. Développez la résine photosensible comme décrit précédemment à l’étape 4.4.

8. Dépôt d’or, formation de canaux et modelage des sources, des drains et des portes de contrôle

1. Nettoyez les substrats avec un traitement plasma doux (30 s à 30 W) pour favoriser l’adhérence du métal sur le Parylène C et placez-les sur le support de substrat à l’intérieur de la chambre à vide de l’évaporateur thermique.
2. Placez 30 mg d’or dans le creuset, fermez l’obturateur et pompez la chambre d’évaporation jusqu’à ce qu’elle atteigne ^10-5 Torr. Augmentez la puissance de l’évaporateur jusqu’à ce que le creuset brille en rouge et attendez 30 s. Ouvrez l’obturateur, augmentez la puissance à 40% (ou jusqu’à ce que le creuset brille d’un blanc éclatant), attendez 60 s, fermez l’obturateur et baissez l’alimentation.
3. Placez les substrats dans un récipient d’acétone à l’intérieur du bain à ultrasons pendant 10 s pour soulever la résine photosensible, retirant ainsi l’or du canal des transistors. Rincez les substrats avec de l’acétone, de l’alcool isopropylique et de l’eau et séchez-les avec de l’azote. Déposez la résine photosensible sur les substrats en utilisant les mêmes paramètres que les étapes 4.1 et 4.2.
4. Placez l’appareil dans un bromographe et placez sur le substrat un masque photolithographique en plastique avec les sources, les drains et la disposition de la porte de contrôle souhaités. Exposez à la lumière UV pendant 1 min à partir du haut et retirez soigneusement le masque, en prenant soin de minimiser les mouvements latéraux du masque sur le substrat pour éviter de le rayer.
5. Développer la résine photosensible comme décrit à l’étape 4.4. Gravez l’or exposé en le submergeant dans la solution de gravure à l’or (étape 1.3) pendant 10 s, rincez-le à l’eau désionisée et séchez-le à l’azote. Inspectez optiquement le substrat et retirez la résine photosensible à l’aide d’acétone. Rincer avec de l’alcool isopropylique et de l’eau désionisée et sécher avec de l’azote.

9. Dépôt et activation du parylène C pour la détection du pH

1. Déposez la résine photosensible sur les substrats en utilisant les mêmes paramètres que les étapes 4.1 et 4.2.
2. Placez l’appareil dans un bromographe et placez sur le substrat un masque photolithographique en plastique avec des ouvertures correspondant aux zones de détection du pH des OCMFET. Exposez à la lumière UV pendant 1 min à partir du haut et retirez soigneusement le masque, en prenant soin de minimiser les mouvements latéraux du masque sur le substrat pour éviter de le rayer.
3. Développer la résine photosensible comme décrit à l’étape 4.4. Protégez l’ensemble de l’appareil, à l’exception des zones de détection du pH, avec du ruban isolant en polyimide (voir le tableau des matériaux). Déposer une couche de 500 nm de parylène C (correspondant à 1 g de dimère de parylène C) sur le substrat en utilisant les mêmes paramètres décrits à l’étape 5.1.
   REMARQUE: L’épaisseur totale du parylène C sur les zones de détection du pH est de 650 nm. Aucun silane n’est requis pour ce dépôt.
4. Retirez délicatement le ruban isolant en polyimide. Exposer le substrat au plasma d’oxygène (5 min et 30 s à 200 W) pour activer le parylène C sur les zones de détection du pH des OCMFET.
   REMARQUE: Le ruban isolant en polyimide est nécessaire ici pour limiter le dépôt de parylène C. En fait, un simple décollage à l’aide de la résine photosensible ne donne pas de résultats positifs en raison de la nature presque sans sténopé du revêtement conforme obtenu avec le parylène C.
5. Placez les substrats dans un récipient d’acétone à l’intérieur du bain à ultrasons pendant 10 s pour éliminer complètement la résine photosensible. Rincez les substrats avec de l’acétone et de l’alcool isopropylique (pas d’eau) et séchez-les avec de l’azote.

10. Dépôt de semi-conducteurs, placement de la chambre de culture et découpe finale du dispositif à partir du PET

1. Placer les substrats sur une plaque chauffante à 50 °C. Versez une gouttelette (1 μL) de solution semi-conductrice (étape 1.4) sur chaque zone de canal, recouvrez tout le substrat avec un couvercle et laissez-le sécher sous une hotte chimique pendant 30 min.
2. Préparez la chambre de culture en imprimant un anneau en acrylonitrile butadiène styrène d’un rayon interne de 15 mm, d’une épaisseur de 1 mm et d’une hauteur de 7 mm avec une imprimante 3D. Collez la chambre de culture sur la partie centrale du substrat à l’aide de polydiméthylsiloxane (rapport de l’agent de durcissement: 15% en poids). Découpez l’appareil du PET manuellement ou à l’aide d’une découpeuse laser.

11. Caractérisation électrique des transistors

1. Caractériser chaque transistor à l’aide d’un sourcemètre18,19,20,21 (voir la Table des matériaux).
   REMARQUE: Les caractéristiques de sortie et d’entrée doivent être mesurées pour extrapoler les paramètres des transistors (principalement la mobilité des porteuses, la tension seuil, le rapport _ION / _IOFF et la pente inférieure au seuil).

Résultats

Le potentiel du protocole d’accord a été validé ici pour les enregistrements d’activité électrique et la surveillance de l’activité métabolique. L’estimation précise des capacités du dispositif à détecter les potentiels d’action extracellulaire a été basée sur une caractérisation approfondie avec des cultures de cardiomyocytes de rat (en particulier dans les cardiomyocytes primaires de rat mesurés à 8 jours in vitro [DIV])¹⁸. La figure 3A montre un protocole d’accord complet avec 16 OCMFET. L’encart supérieur montre un exemple de culture cardiomyocytaire de rat confluent adhérant à la surface du MOA. Pour mettre en évidence leur santé, les cellules ont été immunocolorées pour la protéine sarcomérique, la tropomyosine, après la séance d’enregistrement. L’encart inférieur montre un seul signal cardiomyocytaire mesuré avec un OCMFET.

Fait intéressant, l’appareil pourrait détecter l’activité électrique spontanée et l’activité induite lors de l’administration de différents produits chimiques, comme le montre la figure 3B. Cette validation a été cruciale pour démontrer la faisabilité de l’utilisation de cette approche pour l’interfaçage de cellules électrogéniques. En raison de la configuration du réseau, le protocole d’accord a également permis la reconstruction de la vitesse de propagation du signal cardiaque, démontrant ainsi l’adéquation du système à l’étude des réseaux cellulaires (Figure 3C). Pour une validation plus poussée afin de déterminer la limite de détection réelle de l’appareil, le MOA a également été testé avec des neurones striataux (21 DIV)¹⁸, avec des résultats intéressants en termes d’amplitude du signal et de fiabilité des enregistrements. Comme le montre la figure 3D, l’OCMFET pourrait amplifier les potentiels de champ neuronal avec une stabilité remarquable, montrant des rapports signal/bruit (SNRS) allant jusqu’à 3,2 (dans la même gamme que celle des SNR obtenus avec les MEAs25 standard). La configuration d’enregistrement consistait en une électronique multicanal personnalisée pour la polarisation du transistor et la lecture et le conditionnement du signal. Chaque canal pour l’enregistrement électrique a un premier étage composé d’un convertisseur I/V avec une résistance de rétroaction de 1 MΩ et d’un filtre passe-bande de 150 Hz-1,3 kHz avec un gain de tension de 110. Pour toutes les mesures présentées, les transistors étaient biaisés avec _VDS = _VGS = -1 V. La conversion A/N ainsi que la visualisation et le stockage des données ont été effectués à l’aide d’une carte d’acquisition de données (voir la Table des matériaux). Toutes les séances de mesure ont été effectuées à l’intérieur d’une cage de Faraday afin de minimiser le bruit électrique et environnemental sur le système.

Comme mentionné précédemment, en exploitant la fonctionnalisation physique simple présentée dans le protocole, il a été possible de préparer des capteurs de pH très sensibles avec une réponse supernernstienne. En raison de l’approche de fabrication présentée, ces dispositifs de pH pourraient être intégrés dans un protocole d’accord et utilisés pour surveiller les légères variations de pH induites par l’activité métabolique des neurones primaires du rat ^{hippocampique26}. En particulier, comme le montre la figure 4, un seul des deux OCMFET dédiés à la détection basse fréquence a été fonctionnalisé de manière sélective pour démontrer la faisabilité de l’approche. Cette fonctionnalisation sélective a permis d’évaluer la réponse des deux OCMFET aux variations métaboliques induites chimiquement : en particulier, un état métabolique élevé peut être obtenu en utilisant la bicuculline (BIC), un inhibiteur des récepteurs GABA ^A27, tandis qu’un état métabolique faible peut être induit par l’ajout de tétrodotoxine (TTX), qui provoque éventuellement la mort ^cellulaire28 . La configuration d’enregistrement consistait en la même électronique multicanal personnalisée utilisée pour les mesures d’activité électronique.

Contrairement au cas précédent, deux canaux dédiés ont été utilisés pour enregistrer les variations lentes induites par l’activité métabolique cellulaire. Chaque canal se composait d’un circuit simple composé de deux blocs principaux : un convertisseur I/V avec une résistance de rétroaction de 1 MΩ et un filtre passe-bas avec une fréquence de coupure de 10 Hz. Les transistors ont été biaisés avec _VDS = _VGS = -1 V, et toutes les mesures ont été effectuées à l’intérieur d’une cage de Faraday pour minimiser l’impact du bruit externe sur les enregistrements (c’est un aspect particulièrement important compte tenu des faibles fluctuations de courant induites par l’activité métabolique cellulaire). Au cours des expériences, les cultures ont été maintenues dans un milieu de culture à faible tampon et l’ensemble du système a été placé dans un environnement contrôlé (37 °C et un flux continu de _CO2 / air). Comme prévu, seul le courant de l’OCMFET sensible au pH a pu être modulé par l’ajout de 25 μM BIC. Cela a été confirmé par l’induction de la variation actuelle par la variation correspondante de l’activité métabolique cellulaire.

La même expérience a été répétée après l’ajout de 10 μM TTX, ce qui a entraîné un ralentissement progressif du métabolisme cellulaire. Après l’ajout du TTX, ni l’OCMFET sensible au pH ni l’OCMFET insensible au pH n’ont montré de réponse, démontrant ainsi l’efficacité de l’approche. Ces résultats démontrent l’efficacité de la fonctionnalisation proposée et sa stabilité relative jusqu’à 2 semaines. Une conclusion importante que l’on peut tirer des expériences proposées (à la fois l’activité électrique et l’activité métabolique) est qu’il est possible de préparer différents types de capteurs en fonctionnalisant sélectivement différents OCMFET dans la même zone de culture. Cet aspect représente une réalisation non triviale dans la biodétection pour les applications cellulaires, car la capacité de surveiller différents paramètres au sein d’une même culture cellulaire est cruciale pour une meilleure caractérisation de la complexité de ces systèmes biologiques.

Figure 1 : Vue de dessus d’un protocole d’accord à 16 canaux pour la surveillance métabolique et électrique des cellules électroactives. Barre d’échelle = 1 cm. Abréviations : OCMFET = transistors organiques à effet de champ modulés en charge ; FG = porte flottante; S/D = source/drain; MOA = micro réseau OCMFET. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Principales étapes de fabrication d’un protocole d’accord pour la surveillance métabolique et électrique des cellules électroactives. (A et B) Le film Ti évaporé est modelé à l’aide d’un procédé photolithographique standard pour préparer la porte flottante des OCMFET. (C) Dépôt de 15 nm de parylène C. Cette couche, avec l’oxyde de Ti natif, agit comme diélectrique de porte des transistors. (D et E) La couche de parylène C est modelée à l’aide d’un traitement à l’oxygène plasmatique. Une couche de résine photosensible à motifs est utilisée pour exposer sélectivement les zones de détection pour les enregistrements électriques et les contacts arrière de la porte flottante. (F) Modelage des contacts supérieurs Au, à savoir la source, le drain, la porte de contrôle et le contact arrière de la porte flottante. Une technique d’auto-alignement est utilisée pour améliorer les performances électriques de l’appareil. (G-I) Dépôt de la deuxième couche de parylène C sur la zone de détection des OCMFET pour la surveillance de l’activité métabolique. Après l’exposition au plasma d’oxygène, cette couche agira comme la membrane sensible au pH (J). (K) Coupe transversale d’un protocole d’accord complet (avec matériaux) après le dépôt du semi-conducteur organique (TIPS Pentacene) et le positionnement de la chambre de culture. Abréviations : OCMFET = transistors organiques à effet de champ modulés en charge ; FG = porte flottante; S/D = source/drain; MOA = micro réseau OCMFET; CG = porte de contrôle; PET = polyéthylène téréphtalate; Par C = Parylène C; TIPS = 6,13-bis(triisopropylsilylethynyl) pentacène; ABS = acrylonitrile butadiène styrène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Enregistrements de l’activité électrique cellulaire avec un MOA. (A) Une culture confluente de cardiomyocytes de rat (8 DIV) adhérant à la surface d’un MOA, fixé après une séance d’enregistrement et immunocoloré pour la protéine sarcomérique, la tropomyosine (encart supérieur). Encadré du bas : exemple d’un signal cardiomyocytaire unique mesuré avec un OCMFET. Barre d’échelle = 150 μm. (B) Réglage chimique de l’activité électrique d’une culture de cardiomyocytes. L’accélération de l’activité résulte de l’ajout de 100 mM de noradrénaline, tandis que la suppression résulte de l’ajout de 100 mM de vérapamil. À gauche : modulation de fréquence battante ; à droite : statistiques sur 5 OCMFET-moyenne et écart-type : pic sur 4 min d’activité basale (129 ± 4,6), médiée par la noradrénaline (280 ± 28,6) et médiée par le vérapamil (15 ± 1,9). (C) Reconstruction de la propagation d’un signal cardiaque. A droite : tracé raster de l’activité spontanée de la culture indiquant la propagation du signal du site 14 au site 41 (à droite). (D) Potentiels d’action des cellules striatales provenant d’embryons de rat (21 DIV). Ce chiffre a été modifié par rapport à ¹⁸. Abréviations : OCMFET = transistor à effet de champ à modulation de charge organique ; MOA = micro réseau OCMFET; NE = noradrénaline; VER = vérapamil; DIV = jours in vitro. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Enregistrements de l’activité métabolique avec un protocole d’accord. Réponse des canaux (A) sensibles au pH et (B) insensibles au pH d’un MOA à l’ajout de 25 μM BIC avant et après l’ajout de 10 μM de TTX. Après l’ajout de TTX, le comportement du canal sensible au pH devient similaire à celui du canal insensible au pH. En particulier, aucune variation de courant ne peut être observée après l’ajout de BIC en raison de la mort cellulaire induite par TTX. (C) Protocole d’accord pour les enregistrements de l’activité métabolique. Les OCMFET sensibles au pH et insensibles au pH sont décrits en vert et en rouge, respectivement. Encart : neurones sains de l’hippocampe cultivés sur l’appareil après 15 DIV. Barre d’échelle = 50 μm. Ce chiffre a été modifié par rapport à ²⁶. Abréviations : OCMFET = transistor à effet de champ à modulation de charge organique ; MOA = micro réseau OCMFET; BIC = biccuculline; TTX = tétrodotoxine; DIV = jours in vitro. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Contrairement aux méthodes précédentes de fabrication d’OCMFET pour des applications ^{cellulaires18,29}, la méthode proposée est spécifiquement conçue pour préparer des protocoles d’accord capables de détecter simultanément l’activité cellulaire électrique et métabolique. De plus, cette approche pour atteindre la sensibilité au pH a l’avantage d’être compatible avec les protocoles de fabrication standard et n’implique aucune modification chimique de la zone de détection (cet aspect assure la biocompatibilité de l’ensemble du dispositif). La sensibilité au pH est obtenue en utilisant le même matériau utilisé comme diélectrique de porte (c’est-à-dire le parylène C biocompatible), ce qui rend cette approche rapide et reproductible.

Le résultat final de cette approche est un outil organique flexible, transparent, peu coûteux et multidétection pour les applications cellulaires in vitro . Le fait que cela puisse être obtenu en utilisant une structure de transistor unique et une simple modification physique de la zone de détection ajoute aux avantages offerts par l’utilisation de matériaux et de méthodes électroniques organiques. De plus, comme le principe de transduction de l’OCMFET ne dépend pas strictement du matériau semi-conducteur ou FG spécifique, l’ensemble du processus peut être modifié et mis à l’échelle en fonction de l’application spécifique.

Un aspect critique de la technique proposée est lié à la reproductibilité de la technique d’activation plasmatique. Pour obtenir des résultats cohérents, l’épaisseur du parylène C et sa vitesse de gravure doivent être contrôlées. Un étalonnage fréquent du processus de dépôt de parylène C et du nettoyeur plasma est absolument nécessaire. D’autres aspects critiques, qui contribuent également à la reproductibilité du processus, sont la manipulation prudente du dispositif et le dépôt du semi-conducteur organique. Une technique simple de moulage par goutte a été utilisée ici, qui pose intrinsèquement des limites de reproductibilité. Pour minimiser ces problèmes, comme décrit à l’étape 10.1 du protocole, la même quantité de solution semi-conductrice doit être utilisée à chaque fois et l’évaporation du solvant doit être normalisée autant que possible. Maintenir une température constante à l’aide d’une plaque chauffante et recouvrir le substrat après chaque dépôt de gouttelettes aidera à ralentir le processus d’évaporation. Pour minimiser davantage ce problème, la technique de dépôt (par exemple, en utilisant une méthode d’impression à jet d’encre) pourrait être ^changée30.

Une limitation du protocole proposé découle de la nature de la fonctionnalisation de l’OCMFET pour la détection du pH. La stabilité des capteurs de pH est limitée à quelques ^semaines26. Cependant, la fenêtre de stabilité de l’approche proposée est suffisamment grande pour couvrir les temps d’incubation standard nécessaires à la croissance de la culture neuronale (2-3 semaines). D’autres types de fonctionnalisation de la zone de détection doivent être envisagés pour des expériences plus longues. Le protocole de fabrication utilise un contact arrière dédié, permettant un accès électrique aux FG. Ce contact, qui est laissé flottant pendant le fonctionnement normal de l’appareil, peut être exploité pour la caractérisation électrique de l’appareil et la fonctionnalisation des zones de détection à l’aide de différentes techniques (par exemple, l’électrodéposition).

Cette procédure représente un moyen pratique de préparer un dispositif de détection multiple pour les applications cellulaires sans avoir besoin de matériaux expansifs ou d’installations de salle blanche. Malgré les limites de performance et de stabilité dues à l’emploi d’un semi-conducteur organique et à la fonctionnalisation physique (et non chimique) de la zone de détection, des approches similaires pourraient être utilisées pour préparer des capteurs et des biocapteurs à faible coût (et potentiellement jetables), mécaniquement flexibles et optiquement transparents, qui peuvent fournir aux chercheurs en biologie cellulaire, en génie tissulaire et en neurosciences de nouveaux outils spécialisés pour étudier les systèmes cellulaires in vitro.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Sigma Aldrich	440159
3D printer Makerbot Replicator 2x	Makerbot		https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros.
ABS filament
Anisole	Sigma Aldrich	296295
Bromograph model Hellas	Bungard		https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros.
Gold	Local seller
Hydrofluoric acid	Sigma Aldrich	695068
Iodine	Sigma Aldrich	207772
Kapton tape			polyimide insulation tape
Laser cutter VLS2.30	Universal Laser Systems		https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros.
Multichannel Systems acquisition board			www.multichannelsystems.com
NaOH pellets	Sigma Aldrich	567530
Parylene C dimer	SCS special coating systems coating
PDMS Silgard 184	Sigma Aldrich	761036
PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System	SCS special coating systems		https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros
PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm)	Goodfellow	ES301450
Petri dishes
Plasma cleaner Gambetti "Tucano"	Gambetti		https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros.
Positive photoresist AZ1518	MicroChemicals
Potassium iodide KI	Sigma Aldrich	221945
Source Meter 2636	Keithley		https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros
Spin coater unit	Ossila		https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros.
Stereoscopic microscope SMZ745T	Nikon		https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros.
Thermal evaporator unit
TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene)	Sigma Aldrich	716006
Titanium wire	Goodfellow	TI005129
Ultrasonic bath	Falc Instruments		https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro.