シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング

要約

マイクロ流体プラットフォーム内の毛細管現象支援アセンブリを用いて、細菌やコロイドなどの液体中に浮遊するマイクロサイズの物体をポリジメチルシロキサン基板上の所定のアレイにパターニングする技術を提示する。

要約

定義された空間配置への微生物の制御されたパターニングは、微生物生理学および相互作用の研究を含む、広範囲の生物学的用途のためのユニークな可能性を提供する。最も単純なレベルでは、微生物の正確な空間パターニングは、多数の個々の細胞の信頼性の高い長期イメージングを可能にし、距離依存の微生物 - 微生物相互作用を定量的に研究する能力を変革する。よりユニークなことに、マイクロ流体技術によって提供される正確な空間パターニングと環境条件の完全な制御を組み合わせることで、微生物生態学における単一細胞研究のための強力で汎用性の高いプラットフォームが提供されます。

このホワイトペーパーでは、マイクロ流体チャネル内で微生物の汎用性とユーザー定義のパターンを生成し、長期的かつ高スループットのモニタリングのための完全な光アクセスを可能にするマイクロ流体プラットフォームを紹介します。この新しいマイクロ流体技術は、毛細管現象支援粒子アセンブリに基づいており、マイクロ流体チャネル内の蒸発懸濁液の制御された動きから生じる毛細管力を利用して、ポリジメチルシロキサン(PDMS)基板上に微細化されたトラップのアレイに個々のマイクロサイズの物体を堆積させる。シーケンシャルデポジションは、トラップのジオメトリと充填シーケンスによってのみ決定される、単一または複数のタイプのマイクロサイズのオブジェクトの所望の空間レイアウトを生成する。

プラットフォームは、異なる寸法および材料のコロイド粒子を使用して較正されており、多様なコロイドパターンを生成し、捕捉された粒子の表面官能化を実行するための強力なツールであることが証明されています。さらに、プラットフォームを微生物細胞上で試験し、モデル細菌として 大腸菌 細胞を使用した。何千もの個々の細胞を表面にパターン化し、その成長を経時的にモニターした。このプラットフォームでは、単一細胞堆積とマイクロ流体技術を組み合わせることで、微生物の幾何学的パターニングと環境条件の正確な制御の両方が可能になります。したがって、予備実験によって示されているように、単一の微生物の生理学と微生物と微生物の相互作用の生態学への窓が開かれます。

概要

単一の微生物の空間パターニングは、特にマイクロ流体デバイスなどの環境条件を完全に制御できる実験分野では、幅広い文脈で非常に望ましい。例えば、微生物を規則的な配列に配置することで、多数の個々の細胞を正確にイメージングし、それらの増殖、生理機能、環境刺激に応答した遺伝子発現、および薬物感受性の研究を可能にする。また、細胞コミュニケーション(例えば、クォーラムセンシング)、交配(例えば、藻類 - 細菌共生)、または拮抗作用(例えば、アレロパシー)に関する研究において特に関心のある細胞間相互作用を研究することを可能にする。細胞生理・進化研究¹、細胞間相互作用研究²、表現型分化スクリーニング³、環境モニタリング⁴、薬物スクリーニング⁵ は、このような定量的単一細胞解析を実現できる技術から大きな恩恵を受けることができる分野の一つです。

近年、ホログラフィック光学トラップ⁶および不均一な表面機能化方法7,8,9,10から単一細胞ケモスタット11^および液滴マイクロ流体¹²まで、単一細胞を単離および処理するためのいくつかの戦略が提案されている。これらの方法は、技術的に非常に要求が厳しいか、細胞生理機能に影響を与え、長期間にわたって研究できる微生物をパターン化するための高スループットプラットフォームを提供しず、単一セル分解能、完全な光学アクセス、および環境条件の制御を保証します。この論文の目標は、毛細管現象支援アセンブリを介してPDMS表面上の所定の空間配置にマイクロメトリック精度で細菌をパターン化するプラットフォームを記述することです。このプラットフォームは、微生物の正確で柔軟な空間パターニングを可能にし、そのマイクロ流体の性質のおかげで、環境条件に対する完全な光学アクセスと制御を可能にします。

このプラットフォームの背後にある技術は、マイクロ流体プラットフォーム¹⁶に統合された^{sCAPA13,14,15}(シーケンシャルキャピラリーアシスト粒子アセンブリ)と名付けられた近年開発されたアセンブリ技術です。蒸発する液滴のメニスカスは、マイクロ流体チャネル内のパターン化されたポリジメチルシロキサン(PDMS)基板上を後退しながら、液体中に懸濁した個々のコロイド粒子を基板上に微細化されたマイクロメトリックウェルにトラップする毛細管力を発揮する(図1A)。懸濁粒子は、最初に対流電流によって気液界面に輸送され、次いで毛細管現象によってトラップに入れられる。移動メニスカスによって加えられる毛細血管力は、粒子相互作用に関与する力と比較して、より大きなスケールで作用する。

したがって、アセンブリ機構は、粒子の材料、寸法、および表面特性の影響を受けない。粒子濃度、メニスカスの速度、温度、懸濁液の表面張力などのパラメータは、パターニングプロセスの収率に影響を与える唯一のパラメータです。読者は、パターニングプロセスに対する前述のパラメータの影響の詳細な説明をⁱⁿ¹³、^14、15で見つけることができる。オリジナルのsCAPA技術^13,14,15では、コロイドパターニングプロセスはオープンシステムで行われ、テンプレートを横切ってサスペンションを駆動するために高精度の圧電ステージが必要でした。このプラットフォームは、異なる戦略を活用し、制御された環境でマイクロフルイディクスで一般的に使用される標準機器でパターニングを実行できるため、サンプルを汚染するリスクを最小限に抑えることができます。

このマイクロ流体プラットフォームは、まずコロイド粒子上で最適化され、不活性粒子の規則的な配列を作成し、その後細菌に首尾よく適用されました。このホワイトペーパーでは、両方のマイクロ流体プラットフォームについて説明します(図1B、C)。プロトコルに記載されている準備ステップと実験装置のほとんどは、2つのアプリケーションで共通です(図2)。我々は、コロイドパターニングを報告して、この技術を使用して同じ表面上で複数の連続的な堆積を行い、複雑でマルチマテリアルパターンを作成できることを実証する。特に、各ステップごとに1つの単一粒子を堆積させて、トラップの形状および充填シーケンスによってのみ決定される特定の形状および組成を有するコロイド配列を形成する。細菌のパターニングに関しては、単一の堆積が記載されており、その結果、トラップごとに1つの細菌が堆積する。細胞が表面にパターニングされると、マイクロ流体チャネルは、細菌増殖を促進するために培地でフラッシュされる、任意の単一細胞研究の予備段階である。

プロトコル

1. シリコンマスターの準備

注:コロイドおよび微生物パターニングのためのテンプレートを形成する微細加工トラップを有するPDMSテンプレートは、Geisslerらによって導入された方法に従って作製された。¹⁷。 シリコンマスターは、クリーンルーム内で通常のリソグラフィー法により作製した。手順については次の手順を参照し、機器 の材料表 を参照してください。

1. コンピュータ支援設計 (CAD) ソフトウェアを使用して機能を設計します。
2. UVダイレクトレーザーライターで設計された特徴を露光することによって、ポジ型フォトレジストの層を有するクロムガラスマスクを準備する。
   1. クロムガラスマスクを、1:4のフォトレジスト対水比で15秒間現像液を用いてスピン現像液で現像する。
   2. マスクをクロムエッチャントに50秒間浸します。
   3. 10cmのシリコンウェーハを600Wで3分間プラズマ処理する。
   4. ヘキサメチルジシリザンの層を蒸着し、110°Cでベークするとフォトレジストに対する密着性が向上した。
   5. フォトレジストの層を4,500× g で2分間堆積させる。
   6. マスクアライナーでクロムガラスマスクを通して2秒間UVに露出させ、マスクは現像液で現像します。
3. シリコンマスターの製造を完了するには、深い反応性イオン交換を介してウェーハをエッチングし、所望の深さ(プロフィロメータで測定)を達成するためにエッチング時間(<2分)を調整します。

2. マイクロ流路金型作製

1. CADソフトウェアでチャンネルを設計し、スライサーソフトウェアでスライスして、デザインしたモデルを3Dプリンタの指示に変換し、スライス距離を0.05mmに設定します。
2. チャンネルを3Dプリンタで約1時間印刷します。
3. 金型を専用の養生洗濯機で洗って後硬化させます。
   1. 純粋なイソプロピルアルコール(IPA)を充填した容器に型を入れ、液体を渦巻き(20分間洗浄する)。IPAで満たされた容器を機械から取り出します。
   2. 洗浄した金型をIPA容器から取り出したら、洗浄硬化機に戻し、35°Cで15分間ポストキュアします。
      注: 材料表 には、金型準備プロトコルで使用されている3Dプリンタと硬化および洗濯機が報告されています。3Dモデルは、3Dプリンタ独自のスライサーソフトウェアでスライスされました。
4. プリントをUVオーブンに12時間置き、80°Cのオーブンに12時間置きます。
   メモ:この手順では、PDMSが硬化するのを防ぐため、すべてのポリマーが硬化し、硬化していないすべてのポリマーが印刷物から除去されます。
5. トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シランの蒸着によりモールドをシラン化する。
   1. 3Dモールドを真空デシケーターに入れ、100%濃縮トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シランを金型の近くに置いたアルミニウム箔にピペットで20 μL入れます。
   2. デシケーター内に真空を作り、蒸気を発生させ、40分間放置する。
   3. デシケーターから金型を取り出し、PDMSを注ぐ前に純粋なエタノールですすいでください。

3. マイクロ流体チップの作製

1. エラストマーとその架橋剤を混合してPDMS混合物を調製する(材料表)。気泡が形成され、PDMS混合物が不透明に見えるまで、混合物を激しく攪拌して2つの成分を均一にブレンドする。
   注:架橋剤の量は、エラストマーの量の10重量%でなければならない。
2. エラストマーと架橋剤の混合物を真空デシケーターで脱気し、捕捉された気泡を除去する。混合物をデシケーター内で混合に用いた容器に移す(ステップ3.1)。すべての気泡が除去され、混合物が再び透明に見えるまで、脱気プロセスを続けます。
   注: 通常、乾燥に必要な時間は 30 分です。
3. シリコンマスターに3gの混合物を注ぎ、マイクロ流体チップの「床」として機能するテンプレートを生成します。
   メモ: PDMS 層の厚さは、シリコンマスターに注がれる混合液の量を変更することで調整できます。
   1. 厚さ400μmのテンプレートを得るには、シリコンマスターに3gのPDMSを注ぎ、シリコンマスターをスピンコーターの上に置き、21× g で5秒間、54× g で10秒間スピンコートした後、ステップ3.2で説明したように再び脱気して閉じ込められた気泡を除去した。
4. 3Dプリントされたモールドに20gのPDMS混合物を注ぎ、マイクロ流体チップの「屋根」として機能するマイクロチャネルを作り、ステップ3.2の説明に従って30分間脱気する。
5. シリコンウェーハと3Dプリントモールドの両方を70°Cで少なくとも2時間焼きます。
6. PDMS層を3Dプリントされた金型から剥がし、マイクロ流路の周りの刃でPDMSを切断し、マイクロ流体流路の入口と出口として機能する穴を打ち抜きます。
7. PDMSをシリコンマスターから剥がし、PDMS層をテンプレートの上に結合されるマイクロ流体チャネルと同じ寸法の小さな断片に切断します。
8. テンプレートとマイクロチャネルを1%洗剤溶液( 材料表を参照)で5分間優しくこすり、イオン交換水ですすいでください。次に、テンプレートとマイクロチャネルをイソプロパノールですすぎ、脱イオン水ですすいでください。テンプレートとマイクロチャンネルを室温で1バールの圧縮空気で1分間乾燥させます。
9. テンプレートとマイクロチャンネルをプラズマクリーナーに入れ、接着する表面を上向きにします。プラズマクリーナーの電源を入れ、テンプレートとマイクロチャンネルを40秒間プラズマ処理します。プラズマクリーナーから取り出し、テンプレートの上にマイクロチャンネルを互いに接触させてすぐに接着します。
10. マイクロ流体チップを70°Cのオーブンに5日間保管してPDMS疎水性回復を確保し、30〜60°^10,11の最適な範囲内の後退接触角^{を有する。}

4. 細菌パターニング

1. 実験の1日前に、 エシェリヒア・コリ (株MG1655 prpsM-GFP)の集団を増殖させた。凍結ストックから直接培養物を接種し、37°Cのシェーカーインキュベーター内のリゾゲンブロス(LB)培地中で20時間一晩生育させた。 細胞に50 μg/mLのカナマイシンを加え、prpsM-GFPプラスミドを保持する。
2. 実験当日、実験開始前に均一で安定した温度を有するように実験数時間前にボックスインキュベーター(図2A)を37°Cに設定した。シリンジポンプと加熱したガラス板を顕微鏡ステージ(図2B、C)にセットアップし、ボックスインキュベーターと同じ温度に温度を設定します。
   注:顕微鏡(図2E)を含むシステム全体が囲まれたボックスインキュベーターは、チャネルを媒体でフラッシュしたときに、実験全体を通して均一で一定の温度が維持されることを保証します。
3. 実験の90分前に、マイクロ流体チップを100%エタノール(EtOH)で満たされた容器に入れ、少なくとも10分間、チャネルを100%EtOHでフラッシュする。マイクロ流体チップを真空デシケーターに入れ、少なくとも30分間脱気する。EtOHを蒸留水と交換し、チップを少なくとも30分間真空処理する。マイクロ流体チップを70°Cのオーブンに10分間入れ、流路に残った微量の液体を除去した。
   注:このステップは、培養培地を流したときのチャネル内の気泡形成を防止するために必要である。この気泡防止プロトコルは、Wangら¹⁸から適応された。
4. 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)培地(1x)のピペット1 mLを遠心分離バイアルに入れ、10 μLの0.132 Mリン酸カリウム(_K2HPO4)を加える。一晩培養物を37°Cのインキュベーターから取り出し、100 μLを遠心分離機バイアルにアリコートし、培養物を2,300 × gで2分間遠心分離した。遠心分離機バイアルから上清を軽くピペットで取り出し、ペレットを0.015% v/vのTween 20および0.01% v/vのリン酸カリウムを含む1mLの新鮮なMOPS培地に再懸濁する。
   注:細菌懸濁液の典型的な濃度は0.015〜0.15体積%の範囲であり、これは拡張された移動性蓄積ゾーンの形成を保証し、基質上の粒子の蓄積を防止する。一晩培地を新鮮な培地に交換すると、テンプレート上の細菌のフィルムを放出するリスクが最小限に抑えられます。新鮮な培地中の炭素源の欠如は、テンプレートパターニング中に細胞が懸濁液中で増殖するのを妨げる。懸濁液中のTween 20の0.015% v/vの濃度は、PDMSテンプレート上の後退液の接触角が30〜60°の最適範囲内に収まるようにするために必要である。
5. 細菌懸濁液を1mLシリンジにロードし、マイクロ流体チューブを介してシリンジをチップに接続します。
   1. シリンジとチューブの接続を固定するには、外径0.6mmの針をチューブに直接挿入します。流路を挟んで入口近傍に残留する懸濁液が飛散するのを避けるために、パターニングプロセス中に出口として使用される孔(図3A−III)を通して新鮮な媒体を流す。
   2. シリンジをシリンジポンプに取り付け、懸濁液がテンプレート領域をトラップで覆うまで、チャネルの上流部分に位置する入口を通って懸濁液をマイクロ流体チップに注入する。
      メモ: 液体注入プロセス中、空気はチャネルの下流端にある出口から逃げることがあります。
   3. シリンジポンプをセットして、細菌懸濁液(図3A-I)を0.07-0.2μL/minの流速で引き抜くように設定しますが、これは記載された形状ではメニスカス後退速度80-100μm/minに相当します。
   4. 顕微鏡ソフトウェアを介してパターニングプロセスを監視します。
      注:ここでは、テンプレート上の後退メニスカスを監視するために10倍の倍率を使用し、微細加工トラップへの個々の細菌の沈着を監視するために20倍の倍率を使用した。
6. テンプレートが細胞でパターン化されたら(図3A-II)、引き抜き流量を増やしてマイクロ流体チャネルをすばやく空にし、以前に少なくとも30分間脱気し、30°Cで予温した新鮮なLBで洗い流します。
7. シリンジポンプを流量2 μL/minに設定して、流路を静かに流します。チャネルが満たされたら、特定の実験ニーズに応じて流量(15 μL/分)を増やします。
8. 所望の倍率および時間間隔で増殖する細菌の画像を取得する。

5. コロイドパターニング

1. 遠心分離機バイアルに0.015% v/v Tween 20水溶液900 μLをピペットし、元のコロイド懸濁液100 μLをピペットに入れます。懸濁液を13,500 × g で1分間遠心分離する。上清を静かに取り除き、Tween 20水溶液(0.015% v/v)と交換してください。このプロセスを3回繰り返して、サプライヤーの溶媒をストックサスペンションから完全に交換できるようにします。
2. コロイド懸濁液を1mLシリンジにロードし、マイクロ流体チューブを介してシリンジをチップに接続します。流路の上流部にある中央部に位置する入口からマイクロ流体チップに懸濁液を注入し、テンプレートが覆われるまで懸濁液を徐々に押し込む。
3. メニスカス後退速度1~2μm/minに相当する0.07~0.2μL/minの流速でコロイド懸濁液を抜き取り、顕微鏡ソフトでパターニング過程を画像化します。10倍の倍率を使用してテンプレート上の後退メニスカスを監視し、20倍の倍率を使用して微細加工トラップへの個々の粒子の堆積を観察します。メニスカスがテンプレートの端に達したら流量を増やして、チャンネルをすばやく空にします。
   注: 複数のパーティクルで構成されるコロイド配列は、ステップ 5.1 から 5.3 までのパターニング プロセスを直列に実行することによって生成できます。チャネルは、所望のコロイド配列の構成に従って、各反復で新しいコロイド懸濁液をロードされる。各パターニングステップは、コロイド配列に1つの粒子を追加し、トラップが所望の粒子の配列で満たされるまで連続して実行することができる。得られたコロイド配列の組成は、トラップを充填するために使用されるコロイド懸濁液の配列によってのみ与えられる(図3B)。

結果

毛細管現象支援アセンブリを利用して、PDMSテンプレート上に微細加工されたトラップにコロイド粒子と細菌をパターン化するマイクロ流体プラットフォームが開発されました。毛細管現象支援アセンブリによるコロイドと細菌のパターニングを最適化するために、2つの異なるチャネル形状が設計されています。最初のチャネル形状(図1B)は、長さ23mmの平行な3つのセク?...

ディスカッション

ここで説明するマイクロ流体プラットフォームは、コロイドや細菌などのマイクロサイズの物体をPDMS基板上の所定の空間配置にパターニングすることを可能にする。マイクロフルイディクスが提供する環境条件を完全に制御し、sCAPA技術によって付与されたマイクロメトリック精度で細胞をパターン化する能力により、将来の生理学および生態学研究にとって非常に有望なプラットフォーム?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcatel AMS 200SE I-Speeder	Alcatel Micro Machining System		deep reactive ion exchange system
Alconox			detergent
AZ400K developer	MicroChemicals	AZ400K
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock)	BD	300912	used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel
Box Incubator	Life Imaging Services		used to ensure a uniform and constant temperature in the channel
Centrifuge	Eppendorf	5424R	used to replace the overnight media with fresh minimal media
Centrifuge vial	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		syringe pump
Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi267
Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi182
Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi183
Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M	PVA TePla		used to plasma treat a 10 cm silicon wafer
H401-T-CONTROLLER	Okolab		controller of the heated glass plate
H601-NIKON-TS2R-GLASS	Okolab		heated glass plate
Heidelberg DWL 2000	Heidelberg Instruments		UV direct laser writer
Insulin syringes, U 100, with luer	Codan Medical ApS	CODA621640	1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process
Klayout	Opensource		used to design the features on the silicon master
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	244610	Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel
Masterflex transfer tubing	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x)	Teknova	M2101	diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		microscope
openSCAD	Opensource		used to design the mold
OPTIspin SB20	ATM group	51-0002-01-00	spin developer
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	used to plasma treat the template and microchannel to bond them
Positive photoresist AZ1505	MicroChemicals	AZ1505
Potassium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	P3786	added to MOPS 1x
Prusa curing and Washing machine CW1S	Prusa		used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold
Prusa Resin - Tough	Prusa Research a.s.		UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing
Prusa SL1 3d printer	Prusa		used to print the mold
Scale	VWR-CH	611-2605	used to weight PDMS mixture
Silicon wafer (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N/Phos <100> 1-10 Ω cm
Süss MA6 Mask aligner	SUSS MicroTec Group		used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate
Sylgard 184	Dow Corning		silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01	Technic		chromium etchant
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma Aldrich	448931	used to silianize the 3D printed mold
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P1379	used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process
Veeco Dektak 6 M	Veeco		profilometer
VTC-100 Vacuum Spin Coater	MTI corporation		vacuum spin coater